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五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠VEGF、bFGF影响及形态学观察的实验研究



全 文 :第 30 卷 第 3 期
2 0 1 2 年 3 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol. 30 No. 3
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五叶草莓醇提物对 S180 荷瘤小鼠 VEGF、
bFGF影响及形态学观察的实验研究
李巧兰,陈莉
(陕西中医学院,陕西 咸阳 712046)
摘 要:目的:观察单味五叶草莓醇提物对 S180 荷瘤小鼠的影响,探讨五叶草莓抗肿瘤效果及可能机制。方
法:对 S180 荷瘤小鼠实体瘤模型予以单味五叶草莓醇提物及 CTX治疗,观察抑瘤率,胸腺、脾脏指数及肿瘤细胞
中 VEGF、bFGF的蛋白表达,并进行疗效分析。结果:CTX 组及五叶草莓高、低剂量组的抑瘤率分别为 51. 69%、
45. 05%、37. 77%,提示环磷酰胺的抑瘤率最高,五叶草莓有一定的抑瘤率;五叶草莓高剂量组与模型组比较脾脏
指数明显升高,且具有显著差异(P < 0. 01) ,中药五叶草莓对胸腺及脾脏有一定的保护作用,对免疫器官影响小
于 CTX。五叶草莓 VEGF、bFGF蛋白在小鼠 S180 肉瘤组织中呈高表达,环磷酰胺及五叶草莓各剂量组可降低
VEGF蛋白表达,其中 VEGF与模型组相比有显著差异(P < 0. 01)。结论:五叶草莓醇提物对 S180 荷瘤小鼠的肿
瘤有一定的抑制作用;可促进 S180 荷瘤小鼠免疫器官胸腺、脾脏的生长;提高 S180 荷瘤小鼠 VEGF、bFGF 的水
平。
关键词:五叶草莓;肿瘤;VEGF;bFGF;实验研究
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1673 - 7717(2012)03 - 0544 - 03
Influence of Alcohol Extract from Quinqueleaf Strawberry on VEGF
and Bfgf of S180 Tumor - Bearing Mice and Experience on Morphology
LI Qiao - lan,CHEN LI
(Shanxi College of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,Shanxi,China)
Abstract:Objective:The influence of alcohol extract from Quinqueleaf Strawberry on S180 tumor - bearing mice was
observed and the effect as well as the mechanisms was analyzed. Methods:S180 tumor - bearing mice were treated with
alcohol extract from Quinqueleaf Strawberry and CTX therapy. The tumor inhibition rate,the expressions of VEGF and
bFGF in thymus,spleen and tumor cells were measured and analyzed. Results:The tumor inhibition rates of CTX group
and high,low dose of Quinqueleaf Strawberry wee 51. 69%,45. 05%,37. 77% respectively,indicating Cyclophospha-
mide has the highest tumor inhibition rate and Quinqueleaf Strawberry has some effects on tumor inhibition. Compared
with the model group,the spleen index in high dose of Quinqueleaf Strawberry group was obviously increased,with signif-
icant difference(P < 0. 01) ,indicating Quinqueleaf Strawberry can protect thymus and spleen and has little influence on
immune organs than CTX. Expressions of VEGF and bFGF in S180 sarcomas were high;Cyclophosphamide and Quinque-
leaf Strawberry groups can decrease the VEGF expression,which has significant difference compared with the model group
(P < 0. 01). Conclusion:Alcohol extract from Quinqueleaf Strawberry has a certain effect on inhibiting tumor of S180
tumor - bearing mice and can promote the growth of thymus and spleen and increase the expressions of VEGF and bFGF.
Key words:Quinqueleaf Strawberry;tumor;VEGF;bFGF;experiment research
收稿日期:2011 - 10 - 20
基金项目:陕西省教育厅资助项目[2008K16 - 06(1) ]
作者简介:李巧兰(1956 -) ,女,陕西汉中人,教授,硕士研究生导
师,研究方向:中医老年病和心身疾病。
五叶草莓(又名泡儿、栽秧泡,当地群众又称“白泡
儿”、“地瓢儿”、“白草莓”) ,属蔷薇科草莓属多年生草本植
物,是秦岭山区的一种野生植物,对生长环境要求不高,容
易采摘,资源极为丰富,可食用或酿酒。当地民间草医常用
其全草煎服治疗胃脘痛、腹腔肿块、小便不通、噎膈等病,每
获良效。笔者根据民间应用经验,将五叶草莓全草粉碎装
胶囊试用于消化道肿瘤(胃癌、食道癌、大肠癌、肝癌)及前
列腺癌等疾病的治疗,对于缩小瘤体、缓解及改善全身症
状,提高患者生活质量等方面有着极显著的效果。本课题
拟通过对 S180 荷瘤小鼠 VEGF、bFGF 的检测分析,观察五
叶草莓醇提物对 S180 荷瘤小鼠肿瘤血管新生指标影响,试
探讨五叶草莓抗肿瘤效果及可能的作用机制,为肿瘤的防
治提供新的思路与途径。
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DOI:10.13193/j.archtcm.2012.03.98.liql.048
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1 材 料
1. 1 实验动物
选用健康雄性 SPF昆明种小鼠 50 只,年龄 4 ~ 9 周,体
重 19 ~ 22g,由西安交通大学实验动物中心提供,合格证
号:SGXK(陕)2007 - 001。
1. 2 瘤株
S180 瘤株由第四军医大学实验动物中心提供。
1. 3 用药、试剂及仪器
1. 3. 1 用药 五叶草莓,采购自陕西秦岭山区,经陕西中
医学院药学系生药教研室胡本祥教授鉴定为蔷薇科植物五
叶草莓 F. pentaphylla Lozinsk. 的全草,本药为正品。用系
统溶剂法对五叶草莓进行提取和粗分离,得浸膏,用生理盐
水将浸膏稀释,高剂量组按生药量计算为 8. 26g·kg -1·
d -1低剂量组按生药量计算为 4. 13g·kg -1·d -1,配好溶液
备用。环磷酰胺注射液(CTX) (山西普德药业有限公司,
批号:H14023686)
1. 3. 2 试剂 乙醇,兔抗 VEGF 免疫组化染色试剂盒、兔
抗 bFGF免疫组化染色试剂盒、SABC 试剂盒、DAB 显色剂
由博奥康医药公司提供。
1. 3. 3 主要实验仪器 GTK - 2002 自动恒温摊拷烘片机
(西安瑞丰仪器设备有限公司) ,ZMN - 7803 自动组织包埋
机(西安瑞丰仪器设备有限公司) ,LQ - A包埋蜡块修整仪
(西安瑞丰仪器设备有限公司) ,YABO600 电脑自动脱水机
(常州市雅博电子设备有限公司) ,Motic 显微镜及照相系
统(Motic公司) ,旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;电热
恒温水浴箱(北京西城区医疗器械厂) ;循环水式多用真空
泵(郑州长城科工贸有限公司) ;电热鼓风干燥箱(北京科
伟永鑫实验仪器设备厂) ;电子天平(抚顺宇辰衡器有限公
司) ,手术刀,止血钳,试管等。
2 方 法
2. 1 动物分组、模型制作及给药
所有小鼠先适应性喂养 7 天,后将在无菌条件下接种
7 天的荷瘤 S180 腹水瘤小鼠的腹水与 PBS 液按 1 ∶ 3 的比
例进行稀释,离心后弃上清液,并用红细胞计数板计数瘤细
胞 [(2 ~ 3)× 107个 /mL],用台盼蓝溶液染色进行活细胞
计数,若活细胞率 > 95%后,在小鼠左腋皮下注射 0. 2mL
稀释液,制成实体瘤模型。参照《药理实验方法学》[1]将上
述已接种 S180 腹水型肉瘤的昆明种鼠,于接种 24h后随机
分成 4 组,为空白组、模型组、CTX 组、五叶草莓高、低 2 个
剂量组共 5 组,各组体重无明显差异。模型组根据体重按
0. 2mL /10g用生理盐水灌胃 1 次,环磷酰胺(CTX)按0. 04
g /kg每天腹腔注射 1 次,高剂量组按生药量计算为8. 26g·
kg -1·d -1,用生理盐水将浸膏稀释,予 0. 4mL /只 /日灌胃,
低剂量组按生药量计算为 4. 13g·kg -1·d -1,用生理盐水
将浸膏稀释,予 0. 4mL /只,灌胃,日 1 次。
毛色,精神,行动,进食水等一般情况观察。接种 14 天
后小鼠脱臼处死,分别称取小鼠体重,解剖瘤体、脾、胸腺,
分别称重,个别组出现提早死亡的动物则提前解剖称重纪
录。计算抑瘤率、瘤 /体比、脾 /体比、胸腺指数和脾指数
等[2]。抑瘤率 =(C - T)/C × 100% T为实验组平均瘤重,
C为对照组平均瘤重。胸腺指数 =胸腺重 /体重,脾脏指数
=脾脏重 /体重。
2. 2 血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子
(bFGF)蛋白的测定
2. 2. 1 标本提取 接种 14 天后断颈脱臼处死荷瘤小鼠解
剖瘤体,称重后置于 4%多聚甲醛中固定 24 ~ 48h,常规脱
水,石蜡包埋,切片,留做免疫组化。
2. 2. 2 VEGF bFGF免疫组织化学检测 将组织切片置于
二甲苯中浸泡 10min,更换二甲苯再浸泡 10min,常规脱蜡,
100%、95%、80% 、70%酒精梯度水化,蒸馏水充分浸洗;
3%H2O2 室温下封闭 30min 以灭活内源性过氧化物酶,
0. 01M PBS(后同)洗 10min,2 次;滴加正常山羊血清封闭
工作液,置湿盒中 37℃孵育 1h,甩去多余液体,勿洗;滴加
适当稀释的 VEGF 抗体(工作浓度为 1 ∶ 300) ,置湿盒中
37℃孵育 1h,4 ℃过夜;复温至 37℃ ,PBS 洗 10min,2 次;
滴加生物素标记山羊抗兔 IgC,PBS 洗 10min,2 次;DAB 显
色,70%、80%、95%、100%酒精依次梯度脱水,二甲苯透
明,中性树胶封片。分别以抗体稀释液代替一抗作为阴性
对照,在清晰的背景上出现特异性棕黄色颗粒者为阳性,在
Motic显微镜下照相,应用计算机图像处理分析技术对免疫
组化结果进行半定量分析,通过 Motic Digilabii网络版数码
显微镜互动教室进行彩色图文分析,测定免疫反应产物
VEGF蛋白的平均光密度、积分光密度及平均灰度值,以备
统计分析。
2. 3 病理组织学观察
随机取各组小鼠 S180 瘤块组织标本,经 4%多聚甲醛
固定 24h,经常规脱水、透明、浸腊、包埋,切片 HE 染色,光
镜下观察并拍照,并对各实验组肿瘤细胞种植部位侵袭程
度进行组织学分级。
2. 4 统计学方法
各组数据用均数 ±标准差(珋x ± s)表示,应用 SPSS 16. 0
统计软件进行数据分析,组间比较采用多样本方差分析,两
两比较采用 t检验,P < 0. 05 为有统计学意义。
3 结 果
3. 1 各组小鼠抑瘤率对比
见表 1。实验证明各组均有一定的抑瘤作用,以 CTX
组最为明显,抑瘤率达到 51. 69%;五叶草莓高、低剂量组
抑瘤率分别为 45. 05%和 37. 77%(P < 0. 01)。五叶草莓低
剂量组与 CTX组比较差异显著(P < 0. 05)。
表 1 五叶草莓醇提物对 S180 荷瘤小鼠的
抑瘤作用(珋x ± s)
组别 n 平均瘤重(g) 抑瘤率(%)
CTX组 10 0. 84 ± 0. 10** 51. 69
WYCM高剂量组 10 0. 95 ± 0. 30** 45. 05
WYCM低剂量组 10 1. 08 ± 0. 31** 37. 77
模型组 10 1. 73 ± 0. 47 /
注:与模型组比较差异显著,* P < 0. 05;与模型组比较差异显
著,**P < 0. 01。
3. 2 各组小鼠胸腺指数及脾脏指数对比
见表 2。胸腺指数:空白组与模型组比较有显著性差
异(P < 0. 01)脾脏指数:五叶草莓高剂量组、空白组的与模
型组比较有显著性差异(P < 0. 01) ;CTX 组与模型组比较
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有显著性差异(P < 0. 05) ;五叶草莓高、低剂量组与 CTX组
比较,CTX、五叶草莓高剂量组、五叶草莓低剂量组与空白
组比较,胸腺指数及脾脏指数均无明显差异(P > 0. 05) ,但
CTX组 P值较小,说明中药五叶草莓对胸腺及脾脏有一定
的保护作用,对免疫器官影响小于 CTX。
表 2 五叶草莓醇提物对 S180 荷瘤小鼠脾脏
指数与胸腺指数的影响(珋x ± s)
组别 n 胸腺指数 脾脏指数
CTX组 10 1. 36 ± 0. 36*▲ 4. 82 ± 0. 89**▲
WYCM高剂量组 10 2. 13 ± 0. 31☆☆ 6. 84 ± 1. 01☆☆
WYCM低剂量组 10 2. 00 ± 0. 59☆☆ 6. 23 ± 0. 78☆☆
模型组 10 1. 86 ± 0. 62 6. 06 ± 1. 01
空白组 10 1. 84 ± 0. 49 5. 88 ± 1. 05
注:* 表示与模型组比较差异显著(P < 0. 05) ;**表示与模
型组比较差异显著(P < 0. 01) ;☆表示与 CTX 组比较差异显著(P
< 0. 05) ;☆☆表示与 CTX 组比较差异显著(P < 0. 01) ;▲表示与
空白组比较差异显著(P < 0. 05)。
3. 3 各组小鼠肿瘤细胞 VEGF、bFGF表达水平的测定
灰度系指图像每一像素的明暗(深浅)程度,即该像素
的图像由黑到白变化的量化等级。灰度值的大小与物质含
量多少呈反比关系,灰度值越小,表示染色越深,所含物质
的量越多。光密度又称吸光度,是指光线通过某一物质前
与通过后光强度比值的对数值。光密度值与物质含量成正
比关系,光密度值越小,说明光线被吸收的程度小,物质含
量则越低[3]。
五叶草莓 VEGF、bFGF蛋白在小鼠 S180 肉瘤组织中呈
高表达,环磷酰胺及五叶草莓各剂量组可降低 VEGF 蛋白
表达,其中 VEGF 与模型组相比有显著差异(P < 0. 01)。
具体如表 3 ~ 4 所示。
表 3 五叶草莓醇提物对 S180荷瘤小鼠 VEGF的影响(珋x ± s)
组别 n 阳性目标平均灰度 阳性目标平均光密度 阳性目标积分光密度
CTX组 10 192. 427 ± 11. 689** 1. 8 × 10 - 5 ± 0. 8 × 10 - 5** 0. 608 ± 0. 233**
WYCM高 10 212. 657 ± 11. 043**☆☆ 1. 4 × 10 - 5 ± 0. 5 × 10 - 5** 0. 501 ± 0. 157**
WYCM低 10 175. 823 ± 9. 204*☆☆ 3. 4 × 10 - 5 ± 3. 3 × 10 - 5 2. 218 ± 2. 119☆
模型组 10 164. 023 ± 9. 574 3. 8 × 10 - 5 ± 1. 9 × 10 - 5 1. 265 ± 0. 549
注:* 表示与模型组比较差异显著(P < 0. 05) ;**表示与模
型组比较差异显著(P < 0. 01) ;☆表示与 CTX 组比较差异显著(P
< 0. 05) ;☆☆表示与 CTX组比较差异显著(P < 0. 01)。
表 4 五叶草莓醇提物对 S180 荷瘤小鼠
bFGF的影响(珋x ± s)
组别 n 阳性目标平均灰度 阳性目标平均光密度 阳性目标积分光密度
CTX组 10 179. 121 ± 20. 20** 3. 4 × 10 - 5 ± 2. 6 × 10 - 5 0. 863 ± 0. 287**
WYCM高 10 169. 041 ± 17. 385* 3. 7 × 10 - 5 ± 2. 0 × 10 - 5 1. 067 ± 0. 376*
WYCM低 10 150. 354 ± 34. 096☆ 4. 7 × 10 - 5 ± 3. 3 × 10 - 5 1. 344 ± 0. 848
模型组 10 137. 581 ± 32. 688 5. 3 × 10 - 5 ± 4. 1 × 10 - 5 1. 584 ± 0. 510
注:* 表示与模型组比较差异显著(P < 0. 05) ;**表示与模
型组比较差异显著(P < 0. 01) ;☆表示与 CTX 组比较差异显著(P
< 0. 05)。
3. 4 肿瘤组织切片 HE染色观察
肉瘤组织经 HE染色,镜下观察(见插页Ⅲ图 1) ,可见
肿瘤细胞侵犯肌层,瘤组织呈片状生长,肿瘤细胞密集排
列,细胞大小不同,形态各异;细胞核大小不一,核质比例增
大;染色质呈颗粒状,分布不均匀,可见不对称性,多极性核
分裂等病理性核分裂象,瘤体周围有广泛水肿、出血,大量
新生血管形成。环磷酰胺组有大片的细胞坏死区,较多新
生血管形成。五叶草莓高、低组均可见到不同程度的片状
坏死区,瘤组织内及其周围微血管均减少。
4 讨 论
在实体瘤的生长、浸润和转移中,持续的血管生成是一
个关键因素。新生的微血管是肿瘤浸润和转移的第一站,
肿瘤微血管数量越多,肿瘤细胞进入血液循环的机会就越
大,转移概率越大。死亡的几率也会大大增加。血管新生
指在原有的毛细血管和 /或微静脉基础上通过血管内皮细
胞迁移、增殖、黏附和形成管腔样结构等,最终形成有功能
的新血管的过程[4]。恶性肿瘤生长经历两个阶段:血管前
期和血管期。在血管前期,恶性肿瘤主要通过弥散作用获
取氧气及营养。当恶性肿瘤生长到 2mm3之后即处于血管
期,其生长绝对依赖于血管新生,肿瘤组织之所以生长迅速
易于转移,是因为不断产生的大量新生血管提供了丰富的
血液供应[5]。通过抑制血管新生,进而抑制恶性肿瘤的生
长已经成为目前肿瘤学研究的热点[6],并为筛选抗肿瘤药
物和探求其抗癌机理开辟了新的途径、新的思路。在众多
与血管形成相关的因子中,肿瘤细胞自分泌的血管内皮生
长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)是两个最主
要促血管生成因子,在肿瘤中的表达常被作为评估抗肿瘤
血管生成剂的重要指标。此二者通过与特异受体结合促进
血管内皮细胞增殖、迁移,最终形成新生血管[7]。本实验
通过对这两个指标的检测,探讨五叶草莓抑瘤可能的作用
机制。通过实验我们得知:CTX组及五叶草莓高、低剂量组
的抑瘤率分别为 51. 69%、45. 05%、37. 77%,提示环磷酰胺
的抑瘤率最高,五叶草莓有一定的抑瘤作用。中药五叶草
莓对胸腺及脾脏有一定的保护作用,对免疫器官影响小于
CTX。我们用免疫组化法对各组小鼠肿瘤组织进行 VEGF、
bFGF蛋白表达的检测,结果显示:五叶草莓 VEGF、bFGF
蛋白在小鼠 S180 肉瘤组织中呈高表达,环磷酰胺及五叶草
莓各剂量组可降低 VEGF 蛋白表达,其中 VEGF 与模型组
相比有显著差异(P < 0. 01)。说明五叶草莓抑制肿瘤作用
机制可能与抑制肿瘤血管形成有关。
参考文献
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