全 文 ：　收稿日期:2008-06-19
基金项目:国家科技支撑计划项目(2007BAI30B03);国家自然科学基金项目(30760308)
作者简介:李治建(1982-),男 , 硕士生 ,研究方向为药理学;e-mail:lizhijian0220@126.com。
通讯作者:斯拉甫·艾白(1960-),男 , 研究员 ,主任药师 ,从事药理毒理学研究及新药开发。
第 26卷　第 6期
2008年 12月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science) Vol.26　No.6Dec.2008
文章编号:1007-7383(2008)06-0735-04
地锦草不同提取部位抗皮肤癣菌作用
李治建1 , 斯拉甫·艾白2 , 3 , 古力娜·达吾提2 , 肖　威1 , 安惠霞1
(1 石河子大学药学院 , 新疆石河子 832000;2 新疆维吾尔自治区维吾尔医医院 , 新疆乌鲁木齐 830049;
3 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 , 新疆乌鲁木齐 830049)
摘要:为研究地锦草不同提取部位的体外抗皮肤癣菌作用。采用大孔吸附树脂梯度洗脱分离法对地锦草乙醇提取
物进行洗脱分离 ,得到五个洗脱部位;根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀
释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A), 测定地锦草 5 个提取部位对 17 株临床常见皮肤癣菌的最低抑菌浓度
值(MIC)。结果表明地锦草 5个提取部位均有显著的抗真菌作用 , 其抗真菌有效物质主要集中在 20%乙醇和 40%
乙醇洗脱部分。由此可知 ,地锦草不同提取部位对试验菌株的生长具有明显地抑制作用。
关键词:地锦草;提取部位;抗皮肤癣菌;最低抑菌浓度
中图分类号:R977.9　　　　文献标识码:A　　　　
　　地锦草为大戟科植物地锦(Euphorbia humifusa
Willd.)或斑地锦(Euphorbia maculata L.)的干燥全
草 ,是维吾尔医常用药材 ,维吾尔名为夏塔热其尼
(Xiahatereqini),临床主要用于治疗手癣 、体癣 、足癣 、
花斑癣 、银屑病[ 1 ,2] 。研究[ 3 ,4]发现 ,地锦草具有显
著的抗皮肤癣菌作用 。
为进一步明确其化学成分与药效之间的相关
性 ,本研究通过化学分离方法将地锦草主要化学组
分分成 5个部位 ,并参照美国临床实验室标准化委
员会(NCCLS)的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真
菌药物敏感性试验方案》(M38-A)[ 5] ,对其不同提取
部位进行体外抗真菌活性 ,初步筛选地锦草抗真菌
的有效部位 ,为进一步研究其抗真菌作用机制和分
离有效的先导化合物奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　受试药物
地锦草药材由新疆维吾尔医药研究所药剂室提
供 ,经生药学鉴定为大戟科植物地锦草(Euphorbia
humifusa Willd.);阳 性 对 照 药:特 比 萘 酚
(Terbinafine),(诺华公司 ,批号:010482)。
1.2　试验菌种
红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)4 株 ,石膏样
毛癣菌(Trichophyton gypseum)4株 ,质量控制菌株为
近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)1 株 ,由新疆医
科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)提
供 。
石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)3 株 ,须
癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)3株 ,许兰毛癣
菌(Trichophyton schoenleinii)3株 ,由新疆维吾尔自治
区人民医院皮肤科临床检验室提供。
1.3　培养基
RPMI-1640培养基(Sigma);三氮吗啡琳丙磺酸
(MOPS ,Sigma);马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),批
号:20070825 ,北京奥博星生物科技有限公司。
RPMI-1640培养基的配制:将 10.4g RPMI-1640和
34.53g MOPS 粉末溶于 900mL 蒸馏水中 ,用 1mol/L
NaOH溶液调整其 pH 至 7.0(25℃),加蒸馏水定容至
1 L ,G-6漏斗滤过灭菌 ,存于 4℃冰箱备用。
PDA培养基的配制:称取 PDA 粉末 38g ,加入
1000mL 蒸馏水中 ,摇匀加热煮沸溶解 ,121℃高压灭
菌 20min ,分装 ,4℃保存 ,备用 。
DOI :10.13880/j.cnki.65-1174/n.2008.06.024
1.4　实验仪器
BHC-1300ⅡA型生物安全柜 ,苏州安泰空气技
术有限公司;FM型生化培养箱 ,上海福玛实验设备
有限公司;Leica DM-2500型显微镜 ,德国 。
1.5　方法
1.5.1　地锦草不同部位的提取分离方法
取地锦草全草 18kg ,加 8倍量 70%乙醇回流提
取2 次 ,每次 2h ,滤过 ,合并醇提掖 ,减压回收至无
醇味 ,离心(3500r/min ,5min),滤过 ,上清液分 2次上
样于 D101大孔吸附树脂柱 ,水-乙醇梯度洗脱(H2O 、
20%乙醇 、40%乙醇 、60%乙醇),收集梯度洗脱部
位 ,TLC检识 ,合并流份 ,得到 5个洗脱部位 ,分别减
压浓缩至稠膏状 ,即得:H2O部位(按生药计 1.25g/
mL ,批号:070703),20%乙醇洗脱部位(按生药计 0.
84g/mL ,批号:070703), 40%乙醇洗脱部位(按生药
计0.70g/mL ,批号:070703),60%乙醇洗脱部位(按
生药计 0.20g/mL ,批号:070703),水不溶部位(按生
药计 0.55g/mL ,批号:070703)。
各洗脱部位分别用二甲基亚砜溶解制成浓度为
409600μg/mL的储备液 ,存于-70℃冰箱备用 。
1.5.2　最低抑菌浓度值(MIC)的测定
根据NCCLS的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗
真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)[ 5] ,测定地锦草
不同提取部位对 17株皮肤癣菌的最低抑菌浓度值
(MIC)。
1.5.2.1　抗真菌药物稀释液的制备
将地锦草不同提取部位的储备液分别用 RPMI-
1640培养基倍比稀释成 2 倍终浓度 ,由高向低依次
为:4096 、2048 、1024 、512 、256 、128 、64 、32 、16 、8μg/L;
称取特比奈芬 8mg ,用 1mL DMSO 溶解 ,制成浓度为
8000μg/L的储备液 ,储备液用 RPMI-1640培养基倍
比稀释成 2倍终浓度 ,由高向低依次为:0.16 、0.08 、
0.04 、0.02 、0.01 、0.005 、0.0025 、0.00125 、0.000625 、
0.0003125μg/mL。
1.5.2.2　菌接种液的制备
皮肤癣菌:将受试的皮肤癣菌接种于马铃薯培
养基(PDA)上 ,26℃培养 7 ～ 14d。吸取 2mL 无菌的
0.85%的 NaCl溶液 ,冲洗菌落表面的菌丝和孢子 ,
将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数 ,
将其浓度调至 l×105 ～ 5×105cfu/mL ,用 RPMI-1640
培养基稀释50倍至 2倍终浓度 。
将受试的念珠菌接种于马铃薯培养基(PDA)
上 ,36℃培养 48h。
挑取菌落 ,加入2mL无菌的0.85%的NaCl溶液
中 ,用0.5#McFarland standard比浊管比浊 ,用 RPMI
-1640液基稀释 100倍后再稀释 20 倍至 2倍终浓
度 。
1.5.2.3　接种
将 100μL 的 2倍终浓度的药液 ,由第 1孔至第
10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌 96孔细胞培
养板中 ,第 11孔为生长对照孔(仅加菌悬液 100μL
和 RPMI-1640培养基 100μL ,不加药物),第 12孔为
空白对照孔(真菌 、药物都不加 ,只加 RPMI-1640培
养基200μL)。
将调好的菌接种液 100μL ,分别加入相应的微
孔内 ,这将使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液(2
倍终浓度)分别被 1∶1稀释到终浓度 。
1.5.2.4　结果的判定
皮肤癣菌 , 26℃孵育 7 ～ 14d 读结果。念珠菌 ,
36℃孵育 48h读结果。读取 MIC 值时 ,应在不搅动
的情况下与对照孔按下列标准比较:0:肉眼清晰;1:
略模糊(80%受抑制);2:浊度显著减低(50%受抑
制);3:浊度轻度减低;4:浊度未减低 。本试验药物
取 1(略模糊)或 2(浊度显著减低)为判定终点 。
1.5.2.5　质量控制
按照 NCCLS 方案 , 对近平滑念珠菌(Candida
parapsilosis)进行反复测定 ,其两性霉素 B的 MIC 值
0.5 ～ 4.0μg/mL ,氟康唑的MIC值 1.0 ～ 4.0μg/mL ,
5-氟胞嘧啶的 MIC值 0.12 ～ 0.5μg/mL。
每次试验以此菌株为对照 ,只有当其MIC值介
于其质控范围之内时 ,方认为试验操作准确可靠。
且只有生长对照孔生长良好 ,空白对照无生长 ,其它
孔随药物浓度升高 ,呈现真菌生长梯度受抑制时 ,方
证明试验成功。
1.6　数据处理
测定结果以表示 ,统计过程采用 PEMS 3.1数据
处理软件。
2　结果
地锦草 5个不同提取部位和特比奈芬对 17株
皮肤癣菌的MIC值测定结果(表 1)。
736　　　　　　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷
表 1　地锦草不同提取部位和特比奈芬抗真菌药物敏感性试验结果
药物
红色毛癣菌
4 株(T.r)
石膏样毛癣菌
4株(T.g)
须癣毛癣菌
3 株(T.m)
许兰毛癣菌
3株(T.s)
石膏小孢子菌
3株(M.g)
平均 MIC
/μg·mL-1
平均MIC
/μg·mL-1
平均MIC
/μg·mL-1
平均 MIC
/μg·mL-1
平均 MIC
/μg·mL-1
17 株皮肤
癣菌的平均
MIC
/μg·mL-1
1 512±0 448±128 256±0 512±0 256±74 407±40
2 107±37 112±32 64±0 128±0 64±18 98±17
3 128±0 128±0 64±0 128±0 64±0 105±0
4 1024±0 1024±0 1024±0 1024±0 512±0 935±0
5 512±0 640±256 512±0 512±0 256±0 497±51
6 0.017±0.005 0.030±0.006 0.066±0.023 0.040±0.000 0.080±0.000 0.047±0.007
　　注:药物 1:地锦草 H2O洗脱部位;2:地锦草 20%乙醇洗脱部位;3:地锦草 40%乙醇洗脱部位;4:地锦草 60%乙醇洗脱部
位;5:地锦草水不溶部位;6:阳性对照药:特比奈芬。
3　讨论
地锦草是中医 、维医常用药材 ,应用广泛 。维吾
尔医理论认为 ,地锦草具有清除异常粘液质 、胆液汁
及败血 、消肿止痒之功能 ,维医常用其复方百癣夏塔
热治疗手癣 、体癣 、足癣 、花斑癣 、银屑病等疾病。现
代化学研究发现 ,地锦草主要含有黄酮 、三萜 、香豆
素 、甾醇 、鞣质及酚酸类等化合物[ 6] ,药理研究证明
地锦草及其复方具有抗菌 、抗炎 、抗过敏 、免疫调节 、
抗氧化 、保肝 、止血及解毒等多种作用[ 7～ 9] ,是一种
药用价值极高的植物 ,近年来引起国内外学者的极
大重视。
以往的研究报道地锦草对多种细菌有显著的抑
制和杀灭作用[ 10 ,11] ,但关于其抗真菌作用的报道较
少。邓淑文等[ 12] 研究了地锦草维药复方百癣夏塔
热体外抗真菌的作用 ,发现地锦草复方具有显著的
抗真菌作用 ,尤其对皮肤癣菌最为明显。为了进一
步探讨地锦草的抗真菌作用 ,作者对地锦草提取物
及其制剂进行了体内外药理试验 ,证实了地锦草具
有显著地抗真菌作用 ,但其抗真菌作用的机制及化
学成分与药效之间的相关性还不明确[ 3 ,4] 。本研究
通过大孔吸附树脂洗脱分离法将地锦草主要化学组
分分成几部分 ,通过体外药敏试验筛选有效部位 ,以
阐明其抗真菌的作用机制 。研究结果发现 ,地锦草
5个提取部位均有显著的抗真菌作用 ,不同提取部
位对 17株皮肤癣菌的抗真菌活性强度:20%乙醇
洗脱部位>40%乙醇洗脱部位 >H2O 洗脱部位>
水不溶部位>60%乙醇洗脱部位;地锦草 20%乙
醇洗脱部位和 40%乙醇洗脱部位对 5种不同的皮
肤癣菌的平均 MIC 值均小于其他部位。本研究用
中药化学提取分离手段与药理实验密切结合 ,方法
快速 、简捷 ,结果可靠 ,初步完成了地锦草有效部位
的筛选 ,为进一步研究其抗真菌有效单体及作用机
制奠定了基础。
参考文献:
[ 1] 买买提明·沙比尔 , 乌　兰, 阿尔甫 ,等.维吾尔药材标准
上册 [ M] .乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社 , 1993:99.
[ 2] 斯拉甫 ,哈木拉提 , 努尔买买提.夏塔热片合用夏塔热软
膏的抗真菌消炎作用研究[ J] .中草药 , 2000 , 31(7):538-
540.
[ 3] 古力娜·达吾提 , 尤丽吐孜 , 艾则孜·亚森 , 等.维药地锦
草软膏的体外抗真菌及其对豚鼠皮肤真菌感染的治疗
作用研究[ J] .中药药理与临床 , 2007 , 23(5):178-180.
[ 4] 古力娜·达吾提 , 努尔买买提·艾买提 , 尤丽都孜·买买
提 ,等.雅丽蔓(地锦草)总黄酮体外抗真菌作用研究
[ J] .中国民族医药杂志 , 2006 ,(4):44-45.
[ 5] 李厚敏 , 刘伟 , 李若瑜.美国临床实验室标准化委员会
2003年版产孢丝状真菌药敏试验方案简介[ J] .中华检验
医学杂志 , 2005 , 28(1):121-123.
[ 6] 柳润辉 ,孔令义.地锦草脂溶性成分研究[ J] .天然产物
研究与开发 , 2005 , 17(4):437-439.
[ 7] 曹瑞珍 , 魏永春 ,张国文 , 等.地锦草总黄酮对 D-半乳糖
衰老模型小鼠抗氧化作用的研究[ J] .卫生研究 , 2007 , 36
(3):387.
[ 8] 阿不都热依木 , 阿不都艾尼 , 哈木拉提 , 等.五种维吾尔
药的清除羟自由基及抗 DNA损伤作用研究[ J] .中草药 ,
2001 , 32(3):236-238.
[ 9] 曹瑞珍 ,魏永春 , 强　欣 , 等.地锦草总黄酮预防四氯化
碳所致急性肝损伤的实验研究[ J] .时珍国医国药 , 2007 ,
18(1):85-86.
[ 10] 谭　红 ,刘　伟.地锦草总黄酮的体外抑菌试验[ J] .中
国兽医医药杂志 , 2007 , (4):5-6.
[ 11] 陈福星 ,陈文英 , 褚景生 ,等.地锦草水煎液对小鼠 IFN-
γ的影响[ J] .中国兽医杂志 , 2007 , 43(4):46-47.
[ 12] 邓淑文 , 哈木拉提.百癣夏塔热体外抗真菌活性研究
[ J] .中药药理与临床 , 2006 , 22(4):166-169.
737第 6期　　　　　　　　　　　　　李治建 ,等:地锦草不同提取部位抗皮肤癣菌作用　　　　　　　　　　　　　　
Studies of Antifungal Susceptibility of Different Extraction Parts
from Euphorbia humifusa against Dermatophytes
LI Zhi-jian1 , Silafu·AIBAI2 , 3 , Gulnar·DAWUTI2 , XIAO Wei1 , AN Hui-xia1
(1 College of Pharmacy , Shihezi University , Shihezi , Xinjiang 832000 , China;
2 Uighur Medicine Hospital of Xinjiang Autonomous Region , Urumqi , Xinjiang 830049 , China;
3 Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine , Urumqi , Xinjiang 830049 , China)
Abstract:To study the antifungal effects of different extraction parts from Euphorbia humifusa in vitro , and measure the
minimum inhibition concentrations(MICs).The five extraction parts of the Euphorbia humifusa were subjected to macrop-
orous resin column eluted with gradient elution separation.Applied the standard approved by the national committee for
clinical laboratory standards(NCCLS):reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous
fungi(M38-A),measured the MICs of different extraction parts from Euphorbia humifusa against 17 strains of common
clinical dermatophytes.All of the five extraction parts from Euphorbia humifusa had obvious antifungal effects in vitro ,
their antifungal substance were centralized in 20%EtOH and 40%EtOH elution fractions.The five extraction parts from
Euphorbia humifusa had antifungal activities against the tested strains in vitro.
Key words:Euphorbia humifusa;extraction parts;anti-dermatophytes;minimal inhibitory concentration
738　　　　　　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷