全 文 ：生物多样性 0 20 4, 1 2 ( 2 ) : 2 2 7 一 2 36
刀切 ivd ers 勿 cS te cn 。
三峡库 区稀有植物裸芸香的遗传
多样性和保育策略
宋卫华 李晓东 李新伟 黄宏文 李建强 *
(中国科学院武汉植物园 , 武汉 4 3 00 7 4 )
摘要 : 采用随机扩增多态性 D N A ( R A P )D 对采 自长江三峡库区丰都 ( F D ) 、 巫溪 ( WX ) 、 巫山 ( W S ) 、 巴东 ( B n) 、兴
山 ( X S ) 、梯归 ( Z G ) 6 个 自然居群的 12 8 份裸芸香 ( sP il 叩明a an m is ne 。 。 )样品进行 了基因组 DN A 多态性分析 。 用
13 条引物 ,共扩增出 85 条谱带 , 其中 57 条多态带 , 多态位点占 67 . 06 % 。 6 个居群的多态位点比率分别为 25 . 97 %
( F D )
、
29
.
7 3 % (W X )
、
24
.
3 2% ( W S )
、
4 3
.
2 1% ( B D )
、
3 0
.
2 6 % ( X S )
、
3 9
.
19 % ( Z G )
。 用 P OP G E N E 1 . 3 1 版
和 NST Y S 2 . 10 版软件对数据进行分析 , 结果显示 :裸芸香具有较高的遗传多样性 , 居群总的 N ie 包基因多样性为 0 .
20 82
, 总 hS 阶no n 信息多样性指数为 0 . 3 1% ;但各个居群内部遗传多样性较低 , 居群内平均 Ne i’s 基因多样性为 0 .
10 94
, 平均 Shan on n 信息多样性指数为 0 . 164 ;1 居群间的基因分化系数 sC t 二 0 . 53 91 , 基因流 刀m = 0 . 4 2 75 , 居群间基
因分化大于居群内基因分化 , 居群间的基因交流相当少 。 U P G M A 聚类可将 6 个居群分为两大类 :丰都居群和 以巴
东居群为地理中心呈星散状分布的其他 5 个居群 。 居群间的遗传距离与地理距离呈显著正相关 ( r = 0 . 930 94 , 尸 二
0
.
98 61 )
。 最后我们初步探讨了裸芸香的濒危原因 ,并提出了有效保护该物种的措施 。
关键词 : sP il op e g 口 n u m is 砚ns 。 , R A PD , 遗传变异 , 濒危机制 ,保护 , 三峡库区
中图分类号 : Q 16 文献标识码 : A 文章编号 : 1 005 一 00 9 4( 2o 4) 02 一 02 27 一 or
G e n e t i c d i v e r s i t y a n d c o n s e r v a t i o n s t r a t e g y o f sP iolP ge
a n u m s i n e n s e
, a
r a r e s P e c i e s i n t h e T h r e e
·
G o r g e s eR
s e r v o i r a r e a
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一
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,
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一
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,
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一
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一
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A b s t r a e t : hT
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T h er e
一
G o笔 e s R e s e vr o i r a r e a w a s a n a l y z e d u s in g R A PD . T h i rt e e n p r i m e r s p r o d u e e d a to t a l o f 8 5 s e o ar b l e
m a r k e sr
, o f w h i e h 5 7 ( 6 7
.
0 6% ) w
e , p o l y m o印 h i e . Th e p e cr e n t a g e o f p o l y m o甲 h i e l o e i o f th e s i x p o P u -
l a t i o n s w a s 2 5
.
9 7% ( F D )
,
2 9
.
7 3% ( WX )
,
24
.
3 2% ( W S )
,
4 3
.
2 1% ( B D )
,
30
.
2 6% ( X S )
, a n d
3 9
.
19% ( ZG )
, r e s p e e t iv e l y
·
A s a n a ly
z e d b y p o p G E N E 1
.
3 1 a n d N T SY S Z
.
10
,
th e g e n e t i e d i v e r s i t y o f
sP i l叩〔若口 n u m s ine ns e w a s h ig h , w i t h a n a v e ar g e N e i包 g e n e d iv e r s i t y o f 0 . 2 0 8 2 a n d a n a v e r a g e Sh a n n o n 包
In fo mr
a t io n I n d e x o f 0
.
3 1 9 6
.
I n e o n t r a s t
,
t h e g e n e t i e di v e r s it y w i th i n e a e h p o p u l a t io n w a s lo w
,
w i th a n
a v e r a g e N e i急 g e n e d i v e r s i t y o f 0 . 10 9 4 a n d a n a v e r a g e S h a n n o n 包 In fo mr a t io n I n d e x 0
.
16 4 1
.
I n a d d i t io n
,
sG r w a s 0
.
5 3 9 1 a n d NI 刀 w a s 0
.
4 2 7 5
,
in d i e a ti n g m o r e d i fe er
n ti a ti o n a n d l e s s g e n e e x e h an g
e b e tw e e n p o p
-
u la t i o n s t h a n w i t h i n p o p u l a ti o n s
.
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e U PG M A e l u s t e r a n a l y s i s s h o w e d t h a t th e s i x p o p u la t io n s w e r e g e n e t
-
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e lu s t e r e d i n t o wt o g r o u P s
,
of w h i e h o n e w a s t h e F e n g d u p o P u l a ti o n a n d t h e o t h e r e o n s i s t e d o f th e
r e m a i n i n g if
v e p o P u l a ti o n s d i s t r i b u t e d g e o g ar p h ie a ll y w i t h th e B a d o n g p o p u l a t i o n a s th e e e n t e r
.
A p o s it i v e
e o r e l a t i o n (
r = 0
.
9 3 0 9 4
,尸 二 0 . 9 8 6 1 ) e x i s t e d b e tw e e n g e o g ar p h i e a l d i s t a n e e a n d g e n e ti e d i s t a n e e
.
F i n a l
-
l y w e d i s e u s s e d th e e a u s e o f th e e n d a n g e r m e n t s t a tu s sP i loP 嗒 a n u m s ien sn e a n d p or p o s e d s o m e m a n a g e -
m e n t s t ar te g i e s fo r e fe
e t i v e l y p or t e e t i n g t h i s s p e e i e s
.
eK y w
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: sP iloP
e邵。 u m 5 1、 sn e , RA P D , g e n e t i e v ar i a ti o n , e a u s e s Of e n d a n g e mr e n t , e o n s e vr a t i o n , th e
T h r e e
一
G o r g e s R e s e vr o i
r a er a
基金项目 : 中国科学院方向胜项 目 ( K SC XZ 一SW一 104 ) 和中国科学院武汉植物研究所所长基金的资助项目 ( 0 10 35 12 3)收稿日期 : 20 0 3 一 0 9 一 0 8 ; 接受日期 : 2 0 0 3 一 1 1 一 2 2
作者简介 : 宋卫华 ,女 , 197 8 年出生 ,博士研究生 。 主要从事生物多样性研究 。
* 通讯作者 A u t h o r of r e o r e s p o n d e n e e . E 一m a i l : J i a n q i a n gl @ h o r m a i l . 。 o m
生 物 多 样 性 i Bo d动 e s rity Sc i e配 e 1 2卷
裸芸香 ( Ps li po ge a o m 、 ie n。 。 )隶属 于芸香科
( Rtu ca ae )e裸芸香属 , 为多年生宿根草本 ,是我国特
有的单种属植物 (应俊生 ,张玉龙 , 1994 ) , 染色体数
目 Z n = 18 , 其模式标本采 自湖北西部宜昌地区 。 裸
芸香为重要 的药用植物 (黄成就 , 1997 ) ,它 的果实
可人药 , 有消肿 、 驱蛔虫之功效 。 此外 ,全株具有清
香柑桔气味 ,是一种香料原料 ,有一定的经济价值 。
裸芸香除了贵州赤水有分布外 , 主要分布于湖
北 (巴东 、 兴山 、 宜昌 、 株归 )和重庆 (丰都 、江津 、 巫
山 、 北暗 、 南川 、 巫溪 、武隆 ) , 其中丰都为本次调
查中所发现的新居群 。 裸芸香分布范围为海拔 or o
一
50 0 m (应俊生 , 张玉龙 , 1994 ;王诗云等 , 19 95 ; 黄
成就 , 19 97 ) ,有相当一部分居群分布在长江三峡库
区消涨带内 。 三峡大坝建成后 ,位于库区消涨带内
的裸芸香居群将被淹没 ,导致这一野生资源遭受重
大损失 , 因而裸芸香曾被列为中国第二批拟公布珍
稀濒危保护植物 (许再富 , 19 98 ) 。 同时 ,库区蓄水
后将影响并可能改变库区的水文小气候以及生态环
境 ,对裸芸香的生存会带来潜在的危机 。
裸芸香种质资源的有效保育对该物种的保存 、
群落和生态系统的维持有着重要 的意义 ( H u an g et
al
. ,
20 02 )
。 三峡大坝建成后造成的生境片段化对
于库区内濒危植物的影响 ,是植物生态学家和植物保
育遗传学家极为关注的科学问题 ( w 。 。 t 。 1. , 20 3 )
。
物种保育成功与否 ,主要在于是否保育了尽可能多的
遗传多样性 , 以保持其适应生境变化 的潜力 ( aB r et
& K hO n
,
19 1 ; S
e hal et
a l
. ,
19 9 1 )
。 物种遗传多样性
的研究及其群体遗传结构的分析是制定并实施有效
保育策略的基础和依据 (葛颂 , 19 98 ) 。 尽管已有学者
对裸芸香开展 了化学成分研究 (袁萍等 , 19 9 )和组织
培养技术研究 (叶其刚等 , 19 95 ) , 但对其自然居群遗
传多样性的研究尚未见报道 。
本研究 通 过对野外居 群 的调 查 取样 , 采 用
RA P D 标记技术研究了三峡库区内裸芸香 6 个 自然
居群遗传多样性 ,其目的在于 : ( 1) 揭示裸芸香的遗
传多样性水平 、居群间和居群内的遗传变异规律 ,为
裸芸香就地保育优先居群的选定或迁地保护取样策
略的制定与实施提供基础数据 ; ( 2) 分析裸芸香遗
传多样性格局 , 以及影响遗传分化的因素 ,探讨其致
濒原因 ,为裸芸香种质资源的综合保育策略的制定
与实施提供基础的科学依据 。
1 材料方法
1
.
1 材料
裸芸香的 6 个 自然居群采 自其自然分布区长江
三峡库区的 6 个县市 ( 图 1 ) 。 每个居群随机选取 20
z 一、 . 一哎夔毅主·节“一厂 (O 兴山 户
办 .乡代布尸
.八一广沪八
~ 2 / 、 / z 荞汽 _、
二·八以导否
工 _ /
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二峡大矛
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图例 Le g e n d
. 大中城市 iB g
O 城镇 C o u n t y
了`.袱
一 采样点 Sam p l i n g S i t e
图 1
Fi g
·
裸芸香 6 个自然居群在三峡库区的分布
T h
e
d i
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u t io n o f t h e s i x n a t u ral p o p u l a t i o n s o f sP i l叩 e g 口 n u m 5 1肥醚 e in th e hT er e 一G o r g e s R e s e vr o i r a r e a
1
. 丰都社坛区 ; 2 . 巫溪城厢镇 ; 3 . 巫山双龙镇 ; 4 . 巴东沿渡河 ; 5 . 兴山湘萍 ; 6 . 株归香溪
1
.
S h
e t a n , F
e n gd
u ; 2
.
C h e n群 ia n g , W u x i ; 3 . Sh u a n g lo n g , W u s h a n ; 4 . Y a n d u h e , B a d o n g ; 5 . X ia n g p in g , X i n g s h a n ; 6 . X i a n邵 i ,
Z ig u i
2期 宋卫华等 :三峡库区稀有植物裸芸香的遗传多样性和保育策略
一 25个个体 ,采摘新鲜嫩叶 , 分别用硅胶快速干燥
后室温保存 。 居群内个体间的取样尽量间隔在 s m
以上 , 但对破坏严重 、 个体较少的居群 (如巴东居
群 )则采取了完全采样策略 。 各居群生境特点及采
样数等见表 1 。
1
.
2 D N A 提取
参照 改 良 的 CAT B 法 提取 D NA ( Doy l e &
D o y l e
,
1 9 8 7 ; W h i t t ak e r e r a l
. ,
19 9 7 )
。 样品 D N A 经
紫外分光光度计和 0 . 8% 琼脂糖凝胶电泳检测确定
D NA 质量后 ,用 0 . 1 x TE 缓冲液将 DN A 稀释至 20
n『 u L 用于 P CR 扩增 。
1
.
3 引物筛选和 R A P D 扩增
随机从 3 个居群中选取 3 个个体的 D N A 进行
引物 筛 选 , 从 O p e or n 公 司 O以 1 2 0 、 O P E I佗。 、
o P H I一。 共 60 条随机引物中筛选出谱带清晰 、 多态
性强 、重复性好的引物 13 条 (表 2 ) , 用于全部 12 8
个 D N A 样品的正式扩增 。
P C R 扩增反应参照 W i l i a m s et a l . ( 19 9 0 ) 。 反
应体系总体积 2 5 林L ,包括 : 10 x p C R B u fe r Z · 5 协L ,
M g C 1
2
2
.
0 林 L , dN T p M i x tu er (各 2 . 5 m M ) 0 . 5 林 L ,
T a q E ( 5 叮协L ) 0 . 4 卜 L , irP m e r ( 5 p m o F L ) l 卜L , 模
板 D N A ( 2 0 n g/ 林L ) l 林L , 灭菌双蒸水 d dH Z o l 7 . 6
林L 。 最后加 2 5 u L 矿物油防止挥发 。 pC R 扩增体
系中 , T aq E 为 Por m eg a 公司产品 , 其他为上海生工
公司产品 。 扩增反应在 p e kr i n E lm e r p C R S y s te m
9 6 0 0 上进行 。 扩增程序为 : 9 4℃预变性 2 m in ,接 4 0
个循环 (每个循环依次包含 94 ℃ 0 . 5 im n , 35 ℃ l
m i n
,
7 2℃一 5 m i n ) ,然后 7 2℃延伸 5 m i n , 最后反应
终止在 4℃ 。 扩增产物采用 1 . 8% 琼脂糖凝胶电泳
检测 ,在 iB o RA D 电泳仪上 , 1 x TA E 电泳缓冲液中 ,
3 w
c m (8 4
v
)电压下电泳 3 h 。 电泳结束后 , 扩增
产物先 E B ( 0 . 5 林g耐 L ) 染色 4 0 m in , 然后蒸馏水
d H Z o 褪色 一 h ,接着用 U V p p o laer id 紫外观测仪观
察并一次性成像 。
1
.
4 数据分析
为保证结果良好的可重复性 ,每次扩增至少重
复两次 ,稳定的扩增带用于最终的数据分析 。 根据
G e n e R u l e r TM DN A l a d d e : M i x ( M B I F
e
mr
e n ta s
, 代号
s M 03 3 1
一
l) 指示的标准分子量 , 对照反应产物在琼
脂糖凝胶上的位置 , 估计扩增产物 的分子量的大
表 1 裸芸香采样的位置和生境
T ab l
e
1 hT
e hab i tat
s a n d lo e al i t i e s Of ht e s am P l e s of sP il卿g “ n um s i ne ns e
居群
P o Pu l a t ion
产地
助 e al i t y
海拔
A l t i t u de
生境
H ab i t at
伴生植物
C o m P a n i o n
取样数
Sam pil
n g
( m )
s i z e
丰都 (印 ) 重庆丰都市社坛区 2 0(] 山坡 、 田边 ;散生或丛生 红毛悬钩子 ( R砧。 杯响已ns is ) , 黄 19
eF
n gd u s he tan
,
F e n gd
u C i灯 , H i il s id e an d if e ld s , s p are ly 荆 ( 叭此牛 nes u汕 ) , 枫杨 ( 瓜or -
Ch o飞 q i n g o r d e n s e ly gor wn ca ary s te 刀之)I 〕taer ) ,构树 ( B or ~ ne 右她尸即” 诉ar ) ,龙葵 ( Sol an u m n呀n 名m )
巫溪 ( W X ) 重庆巫溪城厢镇 2 50 一 2 80 山坡及田边 野塘篙 (肠妙 or n 加na 成 ns 司 , 狗尾 24
W u x i Ch e n gx ian g
,
W面 C o u n ty , H i l s id e an d if el d s , s par e ly 草 (set arz 嘛记` ) ,竺麻 (及祀人me iar
Ch o n gq i n g o r d e n s e ly gor w
n n沁 a ) ,鬼针草 ( B沁 ns p i如a )
巫山 ( WS )
W
u s han
重庆巫山县双龙镇
Sh u an 咖n g , W u s han
C o u n t y
,
Ch o n朋 in g
1 10 一 15 0 山坡 ;散生或丛生 黄荆 , 野 塘篙 , 藏灵 仙 ( cl e am山
H i l s id e
, s p are ly or d o
s e 一 ch
lnes
is )
, 探 春 ( asJ m in um 两` -
ly 脚 w n d u m )
巴东 ( B D )
Bad o n g
湖北巴东县沿渡河镇
Y an d u h e
,
B a d o n g C o u n ty
,
H u be i
红毛悬钩子 ,水麻 ( eD 6庄君e as i a 。 ir -
e n at l is )
兴山 ( X S )
X i n罗 h an
湖北兴山县湘萍乡
X ian 即 i n g , X i n即 h an
C o u n t y
,
H u b e i
240
一 2 60
山坡 ;分布狭窄 , 数量有
限
H i l s i de
,
lim i t e d i n di s itr
-
bu t i o n an d n u n l b e r
山坡 、 路旁 ;散生或丛生
H i l l s id e an d m ad s i d e
,
叩aer l y o r de n s e ly 脚 w n
野塘篙 , 黄荆 , 蒲公英 ( aT ~ ac “ m
nOI
矛烤O lic u m )
株归 ( Z G )
Z igU i
湖北株归县香溪镇
X ian 歹 i , 2 1四 1 C o u n t y ,
H u be i
公路旁山坡上 ;丛生
iH ls i山 aol gn or a d s
d e n se ly 脚 w n
野塘篙 , 黄荆 ,蒲公英 ,臭椿
( A沥碱哪 以。臼5 1二 ) , 艾篙 ( A电。 汇-
s i a a 毕 , )
生 物 多 样 性 B i o d vi e rs ity sc i e砒 e 12卷
小 ,依据统一的标准 ,有带的记为 1 ,无带的记为 O ,
缺失数据记为 “ · ” , 生 成 。l/ 矩阵图 。 用 PO P -
G E N E 1
.
3 1 版软件 ( Y e h & B o y l e , 19 9 7 )计算裸芸
香居群的多态位点百分率 ( 尸尸乙 ) 、 N ie 急( 19 73 )基 因
多样性指数 ( H ) 、 S h a n n o n 乞( L e w o n ti n , 19 7 2 )多态性
信息指数 ( )I 、 同时计算居群内基因多样度 ( sH ) 、 居
群间基因多样度 ( sD t ) 、 居群间基因分化系数 ( sC t ) 、
基因流 ( 2、 玩 )以及 N ie ` 遗传一致度和遗传距离 。 并
使用 N TS Y S 软件 ( R o h l f , 19 9 4 )进行 了居群地理距
离与遗传距离相关性的 M an elt 检验 。
2 结果
2
.
1 裸芸香的 RA P D 遗传多样性
对裸芸香 6 个 自然居群的 128 个样本进行
RA PD 扩增 ,共获得强度和清晰度均较好的 85 条谱
带 ,其中 57 个为多态性带 , 占总数的 67 . 0 6 % 。 不
同引物扩增片段数目不等 , OP H习2 扩增最多 , 为 10
条 (如图 2 ) ; O P H刃 9 扩增最少 , 仅 2 条 。 平均每条
引物产生扩增带 6 . 54 条 , 多态带 4 . 38 条 。 各条引
物的扩增多态性见表 2 。 其中 , O P H毛 1 和 O PH习2
扩增多态位点百分率达到 10 % ,而 O PE习 3 引物为
单态扩增 。 扩增片段长度在 350 一 2 60 b p 不等 。
1 6 1 5 1 4 1 3 12 1 1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 l M
图 2 引物 O P H刁 2 对裸芸香样品的 R A P D 扩增谱带
F ig
.
2 R Ap D b a n d s o f sP il叩已g o n u m s ine 邢 15 s a m p l e s a m p l iif e d
w i th p
r im e r O P H刃2
L a n e s l 一 9 b e lo n g t o p o p u l a t io n WX ; la n e s l o 一 1 6 t o W S
.
M
:
DN A l a dd
e :
( 10 0
一
300 0 b p )
从 PC R 扩增图谱可以看出 , 丰都居群具有 4 个
特 有标 记 ( OP A0 1一 17 0 0 、 OP H OZ 一3 10 、 O P 0H 4 一 14 0 0
和 o PH 15 一 16 0 0 ) 。 其中 ,前 3 个为单态的特征标记 ,
第 4 个标记见于 丰都居群 84 % 的个体 ;标记 1E 4 -
0 5 2 0 在丰都居群中为单态标记 ,而在其他居群中极
少见 ,仅见于巫 山的 l 个个体和巴东的 3 个个体 。
而且 , A0 5 一 160 、 E0 9刁60() 和 H 16 刃3 5 0 在除丰都外
的其他居群中几乎为单态标记 (仅株 归 2 个个体缺
少 A05 一 16 0 0 , 巴东 4 个个体缺少 EOg习 6 0 0 ) , 而丰都
居群 中仅 1 % 的个体具有 H 16 刃 350 标记 , 并缺少
其他 2 个标记 。 这些情况都表明丰都居群具有较多
的异于其他居群的遗传变异 , 这一点在下面的遗传
聚类分析中也得到了证明 。
裸芸香居群遗传变异结果表明裸芸香具有较高
的多态位点百分率 (尸尸乙二 67 . 06 % ) 、 N ie 亏基因多样
性 ( H = 0 . 2 0 8 2 ) 与 S h a n n o n 乞信息多样性指数 ( I =
0
.
3 19 6 ) (表 3 ) 。 平均每个居群的总位点数 、 多态位
点数 、 多态位点百分率 、 N ie 乞基因多样性 、 s h an n o n 、
信息多样性指数分别为 7 6 、 2 4 . 5 、 3 2 . 11% 、 0 . 10 9 4 、
0
.
164 1
。 各居群间的遗传多样性差别比较大 , 其中 ,
巴东 ( B D ) 居群具有最多的总位点数 ( 8 1 ) 、 多态位
点数 ( 35 )以及最高的多态位点百分率 ( 43 . 21 % ) 、
N e i包基因多样性 ( H = 0 . 13 9 3 )与 S h a n n o n 乞信息多
样性指数 ( I = 0 . 2 12 3 ) 。 而巫山 ( W )S 居群 的上述
各项指标均最低 , 分别为 7 4 、 18 、 2 4 . 3 2% 、 0 . 0 8 4 5 、
0
.
12 6 1
,说明巴东 ( B D )居群的遗传多样性在 6 个
居群中最高 ,巫山 ( W )S 居群的遗传多样性最低 。
2
.
2 裸芸香居群的遗传变异的分析
遗传变异分析表明裸芸香各居群间存在着较大
的遗传分化 (表 4 ) 。 6 个 自然居群总的遗传多样性
tH = 0
.
21 28
, 其中居 群 内 遗传 多 样 性 ( sH ) 为
0
.
0 9 8 1
,居群 l旬的基因多样性 ( D s t )为 0 . 1 14 7 ; 居群
间基因流 ( N m )为 0 . 4 2 75 ,小于 l ,表明居群间基 因
交流有限 ;居群间的基因分化系数 ( sC )t 为 0 . 53 9 1 ,
表明有 53 . 91 % 的遗传变异存在于居群间 , 46 . 09 %
的遗传变异存在于居群内 , 居群 间的遗传分化大于
居群内的分化 。
2
.
3 居群间遗传一致度与聚类分析
裸芸香自然居群平均遗传一致度为 0 . 848 1 ,各
个居群间的遗传一致度 ( N ie , 19 7 3 ) 在 0 . 7 2 8 4 -
0
.
9 5 5 8之 I司 (表 5 ) 。 其 中 , 丰都 ( F D ) 与 巫 溪
( WX ) 居群间的遗传一致度最低 ( I = 0 . 72 84 ) ;巫溪
( W X )与巫山 ( W s) 居群间的遗传一致度最高 ( I =
0
.
95 58 )
。 丰都 ( FD )居群与其他 5 个居群间的遗传
一致度均较小 ( 0 . 7 2 8 4 〔 I蕊 0 . 7 4 8 0 ) ;与株归 ( ZG )
居群间遗传一致度最大 ( 0 . 7 4 8 0 ) ;与巫溪 ( W X )居
2期 宋卫华等 :三峡库区稀有植物裸芸香的遗传多样性和保育策略 3 2 1
表 2各个引物序列 、 扩增位点 、 多态位点数 、 多态位点百分率与扩增片段大小
Ta b l
e P 2r im e r s e q u e n e e s
, t o t滋 n u m b e r o f lo e i , p e cr e n t a g e o f p o ly m o 甲 h ie l o e i (尸尸乙) , a n d le n gt h o f s e g m e n t s
45041316é9
气7
59810
276
引物号
P r im e r
O P AO I
( ) I ) AOS
O P A 17
O P EO3
O P I乙0 7
O P E 09
O P E 14
O P H O I
0 P H 0 2
O P H 0 4
0 1
)
H 0 9
O P H 15
O P H 16
序列 ( 5 ’ 一 3 ’ )
S
e q u e n e e s ( 5
`一 `
C A G G C CC I
,
I C
A G G G G T C T I
,
G
G A C CG C
,
r l
,
g r
C C A G A T G C A C
A G A T G C A G CC
C
r
F I C A C CC G A
T G CG G C T G A G
G G T C G G A G A A
T CG G A CG T G A
G G A A C T C C C C
T C T A G CT G G G
A A T G G CG C A G
T C T CA G C TG G
总位点数
T
o t a l n u m b
e r o
f l
o e i
多态位点数
N
o
.
o
f p
o
lym o印h i e l o e i
多态位点百分率
尸尸乙 ( % )
6 6
.
6 7
5 5
.
5 6
8 3
.
3 3
0
.
0 0
5 7
、
14
8 0
.
0 0
4 4
.
4 4
1〔M) . 0 0
100
.
0 0
6 0
.
00
5 0
.
00
5 7
.
14
6 6
.
6 7
片段大小 ( b p )
L e n gt h o f s
e gm e n * s ( b p )
80 0 一 2 0 0 0
4 50 一 19 0 0
11 50 一 19 00
6 00 一 19 5 0
8 00 一 17 0 0
4 0 0 一 1 80 0
4 50 一 18 0 0
6 5 0 一 1 80 0
3 10 一 1 20 0
7 0 0 一 18 50
10 0 0 一 26 0 0
6 9 0 一 2 20 0
35 0 一 11 00
表 3 裸
T a b l
e 3
芸香 6 个自然居群的遗传变异
G
e n e t ie v a r ia t io n o f th
e s ix n a t u ar l P o P u la t io n s o f 乃i lop eg 日 n u m s in e邢 e
居群
P
o 「) u l a * io n
个体数
N o
.
o
f
s a
m p l
e 、
总位点数
T o t a l n u m b e
r
o
f l o
e i
多态位点数
N
o
.
o
f p o ly
-
m o rP hi (
、
1
0 〔二
i
多态位点
百分率
尸PL ( % )
N
e i台基
因多样性
H
S h a n n o n
指数
I
重庆丰都 ( F D )
S t
a n d
a r ( 1 d e v i a t i
o n
重庆巫溪 ( W X )
S t a n d
a
dr d
e v i a t i o n
重庆巫 山 ( W S )
S t
a n d a r
(
1 d
e v i a t io n
湖北 巴东 ( B D )
S* a n d a r d d
e v i a t i (I n
湖北兴 一IJ ( X S )
S r
a n d
a r
d 〔l e v i a * io n
湖北柿归 ( Z G )
S t
a n t l a
r
d d
e v i at io n
居群平均 M e a n o f
S t
a n d
a r f
l d
e v i a t i o n
物种水平 S p e C i e s
S t a n d
a
dr d
e v i a t i o n
l 9 7 7 2 O 2 5
.
9 7
2 4 7 4 2 2 2 9
.
7 3
2 0 7 4 l 8 24
.
32
2 l 8 l 3 5 4 3 2 1
2 I 7 6 2 3 3 0
.
2 6
2 3 7 4 2 9 3 9
.
19
p o P u l
a t i o n 7 6 24
.
5 3 2
.
11
l
e v e
l 8 5 5 7 6 7
.
0 6
0
.
0 9 13
0
.
17 3 6
0
.
1 12 9
0
.
18 8 5
0
,
0 84 5
0
.
16 4 8
0
.
13 9 3
0
.
18 3 7
0
.
0 9 5 8
0
.
16 6 4
0
.
13 2 6
0
.
18 4 8
0
.
10 9 4
0
、
17 7 0
0
.
2 0 8 2
0
.
18 3 8
0 13 5 3
0
.
2 4 9 4
0
.
16 5 6
0 2 7 0 7
0
.
12 6 1
0
.
2 3 9 9
0
.
2 12 3
0
.
2 6 7 9
0
.
14 5 8
0
.
24 3 9
0
.
19 9 7
0
.
2 7 0 8
0
.
16 4 1
0
.
2 5 7 1
0
.
3 19 6
0
.
2 6 4 1
居群代号同表 l 尸尸乙 = p e 二 e n t a g e o f p o lym o印 h i e l o c i ; H 二 Ne i 自g e n e d i v e o i t y ; I 二 S ha n n o n 亏 i n fo mr a t i o n i n d e x : p o p u l a t i o n c o de s c o r e印 o n d t o t ho s e
i n T
a
l
)
l
e 】
表 4 裸芸香 6 个自然居群基因多样性 N e i S分析
T a b l
e 4 N e i乌 a n a ly s i s o f g e n e d i v e r s i ty i n s ix n a t u r al p o p u l a t i o n s o f 乃 11叩已g o n u m s ien 酬 e
总基因多样性 居群内基因多样性 基因分化系数 基因流
Ht sH cs
t 、 b i
平均 M e a n 0 . 2 12 8 0 . 0 9 8 1 0 . 5 3 9 1 0 . 4 2 7 5
标准差 S一a n da dr d e v ia t i o n 0 . 03 4 6 0 . 0 12 4
lH = t o t a l g e n e d i
v e r s i t y ;价 = g e n e d i v e o i t y w i t h i n p o P u l a t i o n s ; 凸 t = t h e e o e fi e i e n t o f g e n e d ife r e n t i a t i o n ; 叭门 二 g e n e fl o w 尸场 n 二 0 . 5 ( l 一凸 t ) / 份 t
生 物 多 样 性 B i o d 动e rs ity Sc ie nc e 1 2 卷
表 5 裸芸香 6 个自然居群间的 N ei g 遗传一致度
T a b l
e
5 N
e i ` g e n e t i e id e n t i t y o f s i x n at u ra lp o Pu lat io n s of Ps i l叩 e g “ n u m s ine 邢e
丰都( F D ) 巫溪 ( W X ) 巫 山( W S ) 巴东 ( BD ) 兴山( X S )
巫溪 ( WX )
巫山 ( W S )
巴东( BD )
兴 11) ( X S )
柿归 ( ZG )
0
.
7 28 4
0
.
7 28 7 0
.
9 5 5 8
0
.
7 29 8 0
.
8 8 9 1 0
.
8 67 6
0
.
74 5 0 0
.
8 9 80 0
.
89 6 9 0
,
8 85 0
0
.
7 4 8 0 0
.
9 0 9 0 0 8 9 6 7 0
.
8 8 88 0
.
9 5 4 4
居群代号同表 l 。 p o p u l a t i o n e o de s e o er s p o n d t o t h o s e i n T ab l e l ·
广一一叽l
【~
-
WS
厂一一一一 x s
2公一一一一一 ZG
图 3 裸芸香 6 个自然居群的 N ei 云遗传一致度 U P G M A 聚
类图
F ig
.
3 D
e n
d or g r a m o f U PG M A b a s e d o n N e i 、 g e n e t i e id e n t i ty
o
f th
e s ix n at u r al p o p u l a t i o n s o f PS il叩c g 口 n um s ien 邢e . P o P u la -
t io n e o d
e s a
er g i
v e n in T ab l
e 1
.
WXFD
WSBDxszG
4
.
8 5丽一 万肠一一” 2 . 能” ” 1 .助” ’ ` 。 . 1
说明丰都居群与其他居群间的遗传差异较大 。
聚类结果 ( 图 3) 表明裸芸香的 6 个自然居群明
显聚为两大支 : 一支仅含丰都居群 ( FD ) ; 另一支包
括以巴东居群 ( B D )为地理中心的其他 5 个星散状
分布的居群 。 巫溪 ( WX ) 和巫 山 ( WS) 居群 、 兴 山
( X S )和株归 ( Z G )居群极近缘 ,最先聚类 ;然后这 4
个居群聚在一起 ;最后与巴东 ( B D )居群相聚 。 结果
显示地理距离较近的居群遗传上很 明显地优先聚
类 。
2
.
4 居群间遗传距离与地理距离的相关性
为了进一步验证裸芸香居群间的遗传距离与地
理距离的关系 ,我们借助于 M an elt ( 19 67 )检验方法
进行了分析 。 结果表明裸芸香 6 个自然居群间的地
理距离与遗传距离呈显著的正相关 ,相关系数 ( : =
0
.
9 3 0 9 4
,
P = 0
.
9 8 6 1 ) [ P (
r a n d o m Z < o b s e vr e d Z )
,
尸 > 95 % 为显著相关 , 尸 > 90 % 为弱显著相关〕。 丰
都居群 ( FD )与其他 5 个居群间地理距离相对较远 ,
遗传距离亦相对较远 。 除丰都以外的 5 个居群 , 以
巴东 ( B D )居群为地理中心 , 呈星散状分布 ,地理距
离均较近 ,遗传一致度较大 , 遗传距离较小 。 这种结
果表明裸芸香居群间的基因多样性有着显著的地域
性差异 。
图 4 裸芸香 6 个自然居群间的地理距离聚类图
Fi g
.
4 D e n d
r o 盯 a m o f U PG M A b a s e d o n g e o g r a p h i e d i s t a n e e of
th
e s i x n a t u r a l p
o p u l
a t io n s o f sP il叩` g口 n u m s i en sn e
3 讨论
3
.
1
3
。
1
.
1
遗传多样性
较高的遗传多样性
群间的遗传一致度最小 ( 0 . 7 284 ) 。 除丰都外 , 其他
5 个居群间的遗传一致度均相对较大 ( 0 . 8 6 7 6 盛 I 簇
0
.
9 5 5 5 )
, 尤其是 巫 山 ( W S ) 与 巫溪 ( WX ) , 株归
( ZG )与兴山 ( X )S 居群间的遗传一致度很高 , 分别
为0 . 9 5 5 5与 0 . 9 5 4 4 : 巴东 ( B D ) 与巫山 ( W S )居群间
的遗传一致度在 5 个居群中最低 ( 0 . 8 676 ) 。 这些
一般来说 ,特有或濒危物种往往遗传变异下降 ,
具有较低的遗传多样性 ( H a m r i e k & G o d t , 19 9 0 ;
F a lk & H o l s i n g e r
,
19 9 1 :
,
19 9 5 ;裴颜龙等 , 19 9 5
B r a u n e r 。 t a l
. ,
19 9 2 ;洪德元
; W a n g e t a l
. ,
1 9 9 7 ; Y a n e t
19 7 ; iL
。 t al
. ,
2 0 2 )
。 但是也有一些报道表明
等.al
有些特有种甚至濒危种也可能保持较高水平的遗传
2期 宋卫华等 : 三峡库区稀有植物裸芸香的遗传多样性和保育策略
变异 ,具有较高的遗传多样性 ( C os ne r & C ar w fo dr ,
19 9 4 ; 郎萍 , 黄 宏文 , 19 9 9 ; 邱英雄 , 傅承新 , 2 0 0 1 :
M a t t n e r 。 t a l
. ,
2 0 0 2 ;李作洲等 , 2 0 0 3 ) 。
本研究结果表明裸芸香作为主要分布于三峡库
区的华中地区特有种 ,具有较高的遗传多样性水平
( 尸尸乙 = 6 7 . 0 6% ; H = 0 . 2 0 8 2 : I = 0 . 3 19 6 ) 。 与芸香
科其他物种相 比 , 遗传多态水平也较高 ( H og ib n &
P e a k a l l
, 一9 9 9 ;张太平等 , 2 0 0 1 ;陈秉初等 , 2 0 0 2 ) 。 但
是裸芸香种内居群水平上 的遗传多样性水平较低
( 尸产从 = 犯 . 1 1% ; H = 0 . 10 9 4 : I = 0 . 16 4 1 ) 。 其中巫
山和丰都居群遗传多样性水平最低 , 这可能与生境
片断化 ,并且与其他居群交流 困难有关 。 而巴东居
群因为生境较为复杂 ,株归居群因为分布较广 、 个体
数量较大 ,它们都具有相对较高的居群遗传多样性
水平 。
根据结果 ,我们推测 , 裸芸香很可能是一个古老
物种 ,具有比较丰富的遗传基础 。 但随着人类活动
的日益频繁 ,加剧了其生境的片段化 ,居群间的交流
逐渐变得困难 ,所以虽然保留了其祖先丰富的总体
遗传多样性 ,但由于各个居群个体数量变小 ,近交程
度加深 (有可能存在相当程度 的 自交 ) ,遗传基础趋
于一致 ,造成了居群水平遗传多样性较低的现状 。
3
.
1
.
2 居群间遗传分化与基因流
H a m r i e k & G o d t ( 19 9 0 )运用统计学方法分析了
涉及种子植物 16 5 属 4 49 种共 6 53 篇酶电泳的资
料 ,并探讨了分类地位 、 生活型 、分布范 围 、 分布地
区 、 繁育系统 、种子扩散 、 生殖模式和演替阶段 8 个
内外因素对居群间遗传分化程度的影响 。 统计的结
果表明双子叶植物 、 一年生草本或短命多年生草本 、
特有种 、 自交 、靠重力或破裂扩散种子的植物 、 分布
于温带和亚热带的植物 、 处 于演替早期阶段的植物
具有较大的群体分化 。 裸芸香居群具有较大的遗传
分化 ( cs t 二 0 . 5 39 1 ) , 大致符合上述规律 。 裸芸香是
一种短命多年生的双子叶草本 、 华中特有单种属植
物 ,其果实为普英果 ,顶部呈 口状凹陷 , 果实成熟时
开裂 ,种子长约 1 . 5 m m , 厚约 1 m m , 表面无翅 、 无
刺 ,仅具有疵状突起 ( 应俊生 , 张 玉龙 , 1 994 ; 黄成
就 , 1997 ) , 符合重力散播的特征 。 此外 , 对裸芸香
花蕾期植株套袋实验结果表明 ,裸芸香自交可 以结
实 ,但繁殖方式是否 以自交为主尚需进一步研究确
定 。
现代越来越多的研究证明 , 基因流强弱对群体
遗传分化具有重要影响 。 居群遗传学理论认为 , 不
管居群大小 , 只要基因流是多向性的 , 当每世代居
群间迁移者多于 1 时 (刀爪 > 1 ) , 基因流就可以防止
由遗传漂变 引起 的居群间 的 遗传分化 ( W isr ht ,
19 3 1 ; H a rt l & c l a r k
,
19 5 9 )
。 当基因流小于 l 时 ,就
不足 以抵制居群内因遗传漂变而引起的居群间遗传
分化 ( S l a tk i n , 19 8 5 ) 。 裸芸香 的基 因流 小 ( 刀刀乙 =
0
.
4 2 7 5 )
, 很容易发生遗传漂变 , 因此 , 遗传漂变可
能是影响裸芸香遗传分化的重要因素 。 而有限的基
因流可能是由于花粉传播方式 (有小型昆虫传粉 ,
且是一种辅助蜜粉源植物 )和种子散播机制 (可能
靠重力和果实破裂散播 )造成的 。
此外 ,居群间遗传距离与地理距离的 M an elt 检
验正相关性表明 ,地理距离是影响裸芸香居群内部
遗传结构的重要因素之一 。 说明裸芸香遗传分化具
有一定的地域性差异 ,地理隔离也对其居群遗传分
化有着比较显著的影响 。
3
.
2 濒危原因和保护措施
3
.
2
.
1 濒危原 因初探
有研究表明遗传多样性贫乏可造成居群或物种
繁衍障碍或难 以适应环境 的变迁而 沦为濒危 种
( D e M a u or
,
19 9 3 : H u a n g e t a l
. ,
19 9 8 )
。 裸芸香虽然
具有较高的遗传多样性水平 ( P P L = 67 . 06 % ) ,但在
种内居群水平上遗传多样性却较低 (平均 尸产忆 =
32
.
H % )
,而且居群间缺乏 有效的基因流 ( 刀爪 =
0
.
4 27 5 )
,使得小群体的遗传多样性降低 , 危及整个
居群的生存 。 巴东居群虽然在 6 个自然居群中具有
最高的基因多样性 (尸尸乙二 43 . 21 % ) ,但其分布和数
量有限 ,如果不能有效维持居群的大小和 自然更新 ,
极有可能引起居群的退化甚至整个居群的灭绝 , 使
物种的濒危程度加深 。 此外 ,套袋实验观察结果表
明裸芸香可 自交结实 ,因而可能存在自交衰退现象 ,
不利于它适应较宽的生态幅 。 因此 , 居群内的低遗
传多样性和可能的自交衰退是裸芸香濒危的重要内
在因素 。
亦有研究表明造成植物濒危的原因是人为因
素 ,尤其是生境丧失 、 生境破坏以及过度开发利用对
物种生存的威胁最为严重 ( Lan de , 19 8 8 ) 。 野外考
察中发现 ,裸芸香 的 自然 生境遭到 了严重 的破坏
(如丰都开垦 田地使得裸芸香生存地变得狭小 ) 。
而且三峡竣工后势必进一步破坏其生境 ,使得它 的
栖息地更加狭小 。 栖息地的减少将造成个体数量的
生 物 多 样 性 Bi 口以i次 , 3 ixt sc ic cen 12 卷
减小 ,而个体数量变小所导致的遗传漂变和自交 、 基
因流水平下降则可能是许多濒危物种的致濒因素
( E
r ik s s o n 。 r a l
. ,
1 9 9 5 )
。 所以生境片断化是裸芸香
居群分化和缩小的根本原因 。
一个物种的濒危是由许多内外因素综合作用的
结果 。 由于我们对裸芸香知之甚少 , 尚需进一步深
人探讨裸芸香的进化历史 、 自然选择 、 繁育系统 、
演替阶段等问题 ,以进一步揭示它的濒危机制 。
3
.
2
.
2 保护措施
裸芸香居群有相当一部分分布在长江三峡库区
消涨带 。 2 0 03 年 6 月长江水位上升至 135 m ,虽然
我们已经对巫山 ( W S )和株归 ( Z G )居群海拔 13 5 m
线以下的部分个体进行了抢救性迁地保护 , 但仍会
有一些自然居群被淹没 。 对于三峡库区内即将被淹
没的裸芸香自然居群 ,进行迁地保护是唯一可行的
方法 。 19 95 年有 5 0 多株裸芸香被迁至武汉植物
园 ,但并不算成功 。 它们虽然可 以开花结果至 n 月
底 ,但至今仍没有一株实生苗 , 且旧植株不 断死亡
(而野外考察中各个 自然居群均有实生苗 ) 。 这种
情况说明裸芸香适应新生境的能力较差 ,或者生长
发育的某环节甚至是繁育系统出现了障碍 。 所以最
好是在与它的原始生境相似的地区建立迁地保护基
地 。 因为如果迁移地在它们的生态幅范围内 , 实行
迁地保护比较容易成功 。 值得注意的是株归居群个
体较多 ,遗传多样性较高 ,迁地保护中应受到高度重
视 。
由于对植物实行迁地保护要耗费较多的资源 ,
而且它们离开了原来的生态系统 ,必然遇到诸如繁
殖能力 、 授粉问题 、 迁地保护基地的容量问题 ;并且
物种在植物园中存活率低 , 需要考虑如何保持原来
的遗传多样性 、 尽 量避免驯化等问题 (许再富 ,
19 8 )
。 所以对不被淹没 的居群施行就地保护是最
佳的选择 。
由于裸芸香居群间的遗传变异大于居群内遗传
变异 , 因此任何一个居群的丧失都将导致遗传变异
的严重流失 。 无论迁地保护还是就地保护 ,都要保
护尽可能多的居群 。 在居群水平上 , 巴东 ( B D )居群
具有最高的遗传多样性 , 所以应是重点保护居群之
一 ;丰都 ( FD )居群与其他居群相比 , RA P D 带型较
特殊 ,常会有独特的特征标记或者缺少其他居群所
具有的共有标记 ,而且有时相应带的强度也会与其
他居群有显著的差别 ,反映 了丰都居群不同于其他
居群的较大的遗传变异与遗传分化 ,具有稀有基因
型 , 因此丰都居群具有特有标记居群的价值 。 优先
保护巴东的高遗传多样性和丰都居群的遗传特有性
为保护裸芸香物种遗传多样性所必需 ,建议最好保
护这两个居群的全部植株 。
针对裸芸香总体多样性水平较高 , 居群内多样
性水平较低 、 地理隔离程度较大 , 基 因流较小 的情
况 ,可以采用不同居群进行混合繁殖和相互移植来
促进该种居群的恢复 。 同时加强对遗传流失和易危
性的检 测 及就地 、 迁地保育技术研究 (黄宏 文 ,
19 98 )
。 另外要提高当地居 民的保护意识 , 开发与
保护并重 ,维持居群的自然更新 ,保证资源的持续利
用 。
致谢 : 本实验在中国科学院武汉植物 园植物保育遗
传学开放实验室完成 。 本研究得 到了赵子恩 、 何子
灿 、姜正旺和李作洲的帮助 ,特此致谢 !
参考文献
B r e t t
,
5
.
C
.
H
.
a n
d K
o
h
n , J
.
R
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199 1
.
G
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-
a叮 e o n s e q u e n e e s o f s m a l l p o p u la t io n s i z e i n p la n t s : im p l i -
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展— 首届全国生物多样性保护与持续利用研讨会论文集 ) , e h in e s e s e i e n e e a n d T e e h n o lo 郡 p re s s , B e ij in g ,
12 5 一 13 3
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(黄成就 ) . 1 9 9 7 . lF o ar eR 华 u 乙l ie ae l卜z〕 u la r众 s i n i-
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( 黄宏文 ) . 19 98 . C o n s e vr a t io n g e n e t i e s a n d
s t ra t e留 fo r p la n t g e n e t ie re s o u r e e s . oJ u rna l of 饥h a n B o -
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s e a rc h (武汉植物学研究 ) , 16 ( 4 ) : 3 4 6 一 3 58 .
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多样性 ) , 9 ( 2 ) : 15 1 一 15 6 . ( i n C h in e s e )
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(王诗云 )一 995 . T is s u e e u lt u er a n d p l a n t l e t er g e n e ar t i o n
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