全 文 ：2016　第十八卷　第七期　★Vol.18 No.7
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1159
　　　收稿日期：2016-06-19
　　　修回日期：2016-06-19
＊　　 国家自然科学基金委面上项目（81274187）：基于藏药余甘子酚酸类成分体内动态变化的抗癌药效物质与质量控制研究，负责人：张兰珍。
＊＊　 通讯作者：张兰珍，本刊编委，研究员，博士生导师，主要从事中药和民族药药效物质研究。
余甘子（Phyllanthi Fructus）为大戟科植物余甘
子 Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实，系藏族习
用药材 [1]。鞣质及酚酸类成分为其主要成分，具有抗
脂质过氧化、抗肿瘤、抗癌、护肝益肾、抗病毒、抗菌
等作用 [2]。
藏药主要以复方形式应用，也作为辅助药物与
西药同时服用。藏药成分间的相互作用以及藏药 -
西药药物相互作用报道较少。抑制或诱导 P450酶
都可能产生相应的药物 -药物相互作用，增加患者
的治疗风险。在临床用药过程中，药物对 P450酶抑
制作用的危害远大于诱导作用，尤其是与部分治疗
窗狭窄的药合用会导致中毒 [3]。CYP450各亚型活
性的变化会导致由相关亚型代谢的药物血浆浓度过
高或过低，从而影响临床治疗效果 [4-7]。
本实验采用“Cocktail”探针药物法，结合 HPLC
技术进行余甘子鞣质部位大鼠肝微粒体体外温孵研
究，评价其对 P450酶活性的影响，为研究余甘子鞣
质部位体内成分代谢提供实验依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters 1525 型高效液相色谱仪（PAD 检测器；
Empower软件）；氮吹仪（EYELA MG -2200）；水浴
锅（科伟 HH-4）；涡旋混合器（北京北德科学器材有
限公司）。
1.2 试药
甲醇（美国 Fisher公司，色谱纯）；蒸馏水（哇哈
哈纯净水）；氨苯砜（批号：142160）、氢溴酸右美沙
芬（批号：KGC1-4EJ3）、香豆素（批号：1001833416）、
非那西丁（批号：77440）、氯唑沙宗（批号：481850）、
甲苯磺丁脲（批号：301955）、五味子醇甲（批号：
110857-201111）、酮康唑（批号：973125）、奎尼丁
（批号：216807）、反苯环丙胺（批号：834733）、α-
萘黄酮（批号：1001977041）、二乙基二硫代甲酸
钠（批 号：100183505）、氟 康 唑（批 号：433638）等
原 料 药；NADPNa2（批 号：11012231001）、六 磷 酸
藏药余甘子鞣质部位对大鼠肝微粒体代谢酶
P450 活性的影响＊
崔雅萍，杨光辉，亓 旗，吴玲芳，陈文静，梁文仪，李 师，张兰珍＊＊
（北京中医药大学中药学院  北京  100102）
摘 要：目的：考察藏药余甘子鞣质部位对大鼠肝微粒体代谢酶 P450 活性的影响。方法：采用
“Cocktail”探针底物与大鼠肝微粒体体外温孵法，通过 HPLC同时测定 6种探针药物氨苯砜、氢溴酸右美
沙芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的代谢消除率，评价余甘子鞣质部位对 P450酶中 CYP3A4、
CYP2D6、CYP2A6、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9 亚酶活性的影响。结果：余甘子鞣质部位对 P450酶影响
较小，CYP3A4，CYP1A2的 IC50值超过 200 μg·mL
-1，CYP2C9的 IC50值超过 500 μg·mL
-1。结论：藏药余
甘子鞣质部位对肝 P450酶活性影响较弱。
关键词：余甘子鞣质部位 大鼠肝微粒体 代谢酶 P450 活性
doi：10.11842/wst.2016.07.013　　中图分类号：R282　　文献标识码：A
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世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：藏药余甘子的药理作用研究
葡萄糖（批号：B6146）、六磷酸葡萄糖脱氢酶批号
（1001293755）、MgCl2（批号：2105-100）均购于北
京拜尔迪医药技术有限公司；SD大鼠肝微粒体为实
验室自制，蛋白含量为 34.52 mg·mL-1。
余甘子药材购自于西藏藏医院，产地尼泊尔。经
北京中医药大学阎玉凝教授鉴定为大戟科叶下珠属
植物余甘子 Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实。
2 方法与结果
2.1 “Cocktail”探针药物法的建立
2.1.1 溶液的配置
取氨苯砜、氢溴酸右美沙芬、香豆素、非那西丁、
氯唑沙宗、甲苯磺丁脲适量于 10 mL 容量瓶中，
甲醇定容，配成各探针浓度分别为 10 mmol·L-1、
4 mmol·L-1、4 mmol·L-1、10 mmol·L-1、10 mmol·L-1、
4 mmol·L-1的混合探针溶液，作为储备液备用。五
味子醇甲（内标物）：取4.01 mg，10 mL容量瓶中
甲醇定容。
NADPH 再 生 系 统：含 2 mmol·L-1NADPNa2，
20 mmol·L-1六磷酸葡萄糖，2 u·mL-1六磷酸葡萄
糖脱氢酶，20 mmol·L-1 MgCl2。
2.1.2 肝微粒体体外温孵反应
将混合探针储备液适量稀释 200倍后，取 100 μL
于2 mLEP管中，氮气吹干，加入Tris-HCL缓冲液
溶解的肝微粒体（2 mg·mL-1）100 μL，于37 ℃水
浴中预温孵5 min，加入100 μL NADPH再生系统
启动反应，反应体系总体积为200 μL，包含SD大
鼠肝微粒体蛋白1 mg·mL -1，NADPH 再生系统
（1 mmol·L-1NADPNa2、10 mmol·L
-1六磷酸葡萄
糖、1 u·mL-1六磷酸葡萄糖脱氢酶、10 mmol·L-1
MgCl2）以及6种混合探针底物：氨苯砜、氢溴酸右美沙
芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲（终
浓度分别为: 25、10、10、25、25、10 μmol·mL-1），
温孵时间30 min。
2.1.3 样品处理方法
温孵 30 min后在反应体系中按 1:3比例加入冰
甲醇结束反应，加入内标物（五味子醇甲 0.4 mg·mL-1）
50 μL，涡旋3 min，4 ℃，12 000 g·min-1离心
20 min，取上清液，氮气吹干，200 μL50%甲醇复溶，
4 ℃，12 000 g·min-1离心20 min，20 μL进HPLC分析。
2.1.4 色谱条件
Diamonsil C18（2）色 谱 柱（4.6 mm×250 mm，
5 μm），流速：1 mL·min-1，柱温：35 ℃，流动
相：甲醇-0. 2%冰醋酸溶液，梯度洗脱，进样量：
20 μL。
2.1.5 专属性考察
按照 2.1.4 HPLC-UV条件，测定空白肝微粒体、
空白肝微粒体中加入探针底物和内标物。实验结果
如图 1。
实验结果显示，空白肝微粒体所含内源性物质
不干扰探针药物和内标物的测定，7个被测成分峰形
良好，符合测定要求。
2.1.6 肝微粒体温孵体系酶浓度和温孵时间的确定
控制肝微粒温孵时间，以探针药物氨苯砜为底
物，设置体系肝微粒体浓度分别为 0.25、0.50、1.00、
1.50、2.00 mg·mL-1考察肝微粒体浓度对代谢反应的
影响。结果如表 1和图 2所示。
控制肝酶浓度，以探针药物氨苯砜为底物，设
置温孵时间分别为 5、10、20、30、60、120 min 考察
温孵时间对代谢反应的影响。结果如表 2 和图 3
所示。分析实验结果可得，反应体系中肝酶浓度达
1 mg·mL-1、温孵时间为30 min时，底物代谢趋于
平缓，因而确定为实验条件。
2.1.7 方法学验证
（1）标准曲线的制备
采用倍半稀释法，将探针药物的储备溶液
配制成一系列梯度浓度的“Cocktail”探针混合
溶 液：氨 苯 砜（6.25、10.00、16.70、25.00、50.00、
1 0 0 . 0 0 μm o l·L - 1）；氢溴酸右美沙芬（2 . 5、
4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）；香豆素
（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）；
非那西丁（6.25、10.00、16.70、25.00、50.00、
100.00 μmol·L-1）；氯唑沙宗（6.25、10.00、
16.70、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1）；甲苯磺丁
脲（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）。
取稀释梯度浓度的混合探针，用灭活的肝微粒
体按 2.1.2项下温孵方法进行温孵实验。分别绘制 6
种探针药物标准曲线，结果见表 4。
（2）精密度和稳定性实验
分别取低、中、高 3个浓度的混合探针药物 100 μL
于EP管中，氮气吹干，加入灭活肝酶200 μL溶解，
按2.1.3项下方法处理样品，配置探针药物低、中、
高三个浓度的基质混合对照品，每个样本平行制备
3份。同一样品于同日内测定连续测定6次，计算日
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图 1 空白肝微粒体加混合探针和内标物 HPLC 色谱图
注：a.空白肝微粒体，b.空白加探针药物和内标；1.氨苯砜，2.氢溴酸右美沙芬，3.香豆素，4.非那西丁，5.氯唑沙宗，6.甲苯磺
丁脲，7.内标物。
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图 2 混合探针代谢率变化图 图 3 混合探针代谢率变化图
表 1 肝微粒体浓度对探针底物代谢消除率的影响 /%
肝微粒体浓度 /mg·mL-1
探针底物代谢消除率
氨苯砜 氢溴酸右美沙芬 香豆素 非那西丁 氯唑沙宗 甲苯磺丁脲
0.25 2 3 1 1 2 1
0.5 7 3 2 3 9 3
1.0 10 7 8 5 13 6
1.5 11 14 16 5 11 5
2.0 11 15 18 6 20 5
表 2 肝微粒体温孵时间对探针底物代谢消除率的影响 /%
温孵时间 /min
探针底物代谢消除率
氨苯砜 氢溴酸右美沙芬 香豆素 非那西丁 氯唑沙宗 甲苯磺丁脲
5 3 13 4 2 4 2
10 7 17 10 3 5 4
20 8 21 13 6 15 8
30 10 22 15 7 11 6
60 10 20 14 5 11 6
120 11 24 19 10 14 13
表 3 肝微粒体中各探针药物标准曲线方程式
探针药物 标准曲线 r 线性范围 /μmol·mL-1
氨苯砜 Y = 0.654 1X - 4.281 1 0.999 4 6.25-100.00
氢溴酸右美沙芬 Y = 0.054 1X - 0.109 5 0.998 6 2.50-40.00
香豆素 Y = 0.200 5X - 0.434 1 0.997 2 2.50-40.00
非那西丁 Y = 0.068 5X - 0.346 2 0.998 1 6.25-100.00
氯唑沙宗 Y = 0.298 9X - 1.538 7 0.998 1 6.25-100.00
甲苯磺丁脲 Y = 1.044 9X - 2.145 9 0.997 1 2.50-40.00
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内精密度，连续3天内测定3次，计算日间精密度。
将样本放置24 h后测定，考察样本在24 h内的稳定
性。结果显示6种探针药物测定的日内精密度和日
间精密度良好，RSD均小于6%，样本24 h稳定性良
好，RSD均小于5%，符合样本含量测定的要求。
（3）回收率实验
按（2）项下方法制备混合探针药物低、中、高 3
个浓度的基质混合对照品，平行 3组，另取相应浓度
的标准溶液直接进样，计算绝对回收率。结果显示 6
种探针药物的绝对回收率均大于 73.08%，且 RSD均
小于 5%，符合样本含量测定要求。
2.2 阳性抑制剂对大鼠肝微粒体代谢酶 P450 活性
影响
2.2.1 阳性抑制剂对 P450 酶活性的抑制
选取添加阳性抑制剂与未加抑制剂的对照组进
行比较，以探针底物的代谢率来反映酶的活性，每个
阳性抑制剂系列浓度均为 0.01/0.1/1/10/100 μmol·L-1，
平行做3份。
2.2.2 酶活性（control activity）的计算
使用已建立的 HPLC法测定 6种探针底物的峰
面积，将其与内标峰面积的比值代入各探针底物的
肝微粒体标准曲线中计算出各探针底物浓度，以未
加阳性抑制剂和受试中药提取物的空白对照的活性
为 100%，计算各 CYP450亚型在不同药物作用下的
相对酶活性。
2.2.3 抑制曲线及 IC50 值
采用 Graphpad prism 5.0软件进行非线性回归
分析，将酶相对活性对各抑制剂浓度的对数值作图，
并计算 IC50值。结果如表 4和图 4所示。实验结果
表明，选用的各抑制剂的 IC50值均小于 5 μM，抑制
作用效果良好。
2.3 余甘子鞣质部位对肝微粒体代谢酶 P450 活性
的影响
以余甘子鞣质部位替换 2.2项下孵育体系中的
阳性抑制剂。余甘子鞣质部位提取物的梯度终浓度
为 0.102、1.020、10.170、101.720、1 017.200 μg·mL-1。
表 4 添加阳性抑制剂后各 P450 酶亚型的相对酶活性（n=3）
抑制剂浓度 /μM
P450酶亚型相对酶活性
CYP3A4 CYP2D6 CYP2A6 CYP1A2 CYP2E1 CYP2C9
0.01 89.86% 89.65% 81.34% 51.89% 76.62% 57.22%
0.10 78.11% 62.38% 95.04% 46.06% 77.50% 44.35%
1.00 25.30% 40.30% 4.51% 32.35% 69.02% 19.85%
10.00 12.77% 51.80% 13.29% 2.379% 44.26% 28.34%
100.00 7.08% 18.34% 9.17% 4.25% 33.95% 8.69%
IC50 0.330 70 0.086 95 0.973 20 4.68 30 3.91 20 0.158 50
表 5 余甘子鞣质部位对 P450 酶亚型的相对酶活性的影响（n=3）
鞣质部位浓度 /μg·mL-1
P450酶亚型相对酶活性
CYP3A4 CYP2D6 CYP2A6 CYP1A2 CYP2E1 CYP2C9
0.102 88% 87% 81% 87% 83% 78%
1.020 89% 78% 88% 78% 89% 57%
10.170 87% 83% 79% 57% 78% 48%
101.720 73% 73% 78% 69% 67% 58%
1 017.200 46% 63% 72% 47% 53% 38%
IC50 241.60 132.60 88.24 274.20 78.45 503.30
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图 4 阳性抑制剂抑制曲线（n=3）
图 5 余甘子鞣质部位抑制曲线（n=3）
空白对照组和实验组同时进行，分别计算相应的
IC50值，结果如表5和图5所示。实验结果表明：余
甘子鞣质部位对于肝微粒体代谢酶P450各亚型的
IC50值均大于50 μg·mL
-1，且对CYP3A4、CYP1A2
的IC50值超过200 μg·mL
-1，对CYP2C9的IC50值超过
500 μg·mL-1。
3 讨论
依照通用的 CYP450酶抑制剂强度分级规则 [8，9]：
当某种中药的提取物对 P450酶亚型的半数抑制浓
CYP2A6 CYP1A2
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度 IC50值小于 10 μg·mL
-1时，被认为有很强的抑制作
用，在临床使用过程中发生药物相互作用的可能性较
大，结果可能使其他由 CYP450酶代谢的药物疗效减
弱甚至失效；当 IC50值介于 10 μg·mL
-1到 50 μg·mL-1
时，被认为有明显的抑制作用；当IC50值介于100到
200 μg·mL-1时，被认为有微弱的抑制作用；当IC50
值大于200 μg·mL-1则认为抑制作用不明显，临床
联合用药相对安全。
本实验结果表明余甘子鞣质部位对于肝微粒体代
谢酶 P450各亚型抑制作用的 IC50值均大于 50 μg·mL
-1，
且对CYP3A4、CYP1A2的IC50值超过200 μg·mL
-1，
对CYP2C9的IC50值超过500 μg·mL
-1，说明余甘子
鞣质部位对于肝酶活性的抑制作用并不强烈，在临床
使用过程中发生药物相互作用的可能性较小。余甘子
鞣质部位对肝微粒体P450代谢酶6种主要亚型的抑制
作用不明显，不易产生相应的药物-药物相互作用。
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参考文献
Effects of Tannins Extracted from Phyllanthi Fructus on the Activity of Cytochrome P450 Enzymes
in Rats
Cui Yaping ,Yang Guanghui, Qi Qi,Wu Lingfang, Chen Wenjing, Liang Wenyi, Li Shi, Zhang Lanzhen
(School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)
Abstract: This study aimed to investigate the effects of tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi
Fructus on cytochrome P450 enzyme of liver microsomes in rats. Cocktail probe substrates were incubated with
liver microsomes in vitro. Metabolic elimination percentages of the six probe substrates, including dapsone,
dextromethorphan hydrobromide, coumarin, phenacetin, chlorzoxazone and tolbutamide, were determined by
HPLC. The effects of tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus on the enzymatic activity of rat
liver microsomal P450s was evaluated. It was found that tannins extracted from Phyllanthi Fructus did not impact
P450 enzymes. The IC50 values of CYP3A4 and CYP1A2 were over 200 μg·mL
-1, while the IC50 value of CYP2C9
was superior to 500 μg·mL-1. In conclusion, Tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus did not
significantly affect cytochrome P450 enzymes.
Keywords: Tannins extracted from Phyllanthi Fructus, rat liver microsomes, metabolic enzyme P450, activity
（责任编辑：姜月滢，责任译审：朱黎婷）