全 文 ：中国药物警戒第 13卷第 4期 2016年 4月 April,2016,Vol.13,No.4
193
基础与临床研究中图分类号 :R916.696 文献标识码 :A 文章编号 :1672-8629-(2016)04-0193-04
藏药余甘子鞣质部位对人肿瘤细胞凋亡与周期的影响
陈静 冯光远 李登科 石璐缘 孙震晓 * 张兰珍 ( 北京中医药大学中药学院 , 北京 100102)
摘要 :目的 研究藏药余甘子鞣质部位的体外抗肿瘤作用机制。方法 余甘子鞣质部位 40 、80 、160 μg·mL-1 作用
于人肿瘤 A549 及 BEL-7402 细胞 48 h, MTT 法测定剂量反应曲线 ; 倒置相差显微镜下观察两种细胞形态学的变化 ;
流式细胞术测定细胞周期及凋亡的情况。结果 不同浓度的余甘子鞣质部位作用 48 h 对 A549 和 BEL-7402 细胞均
表现明显的细胞毒作用 ; 倒置镜下可见加药组细胞生长受到明显抑制 , 细胞收缩变小 ; 流式细胞术测定发现余甘子
鞣质部位具有显著的诱导细胞早期凋亡和 G2/M 期阻滞作用。结论 余甘子鞣质部位可通过诱导肿瘤细胞凋亡和对
细胞周期阻滞而发挥其体外抗肿瘤作用。
关键词 :余甘子鞣质部位 ; 抗肿瘤 ; 细胞凋亡 ; 细胞周期
Effects of Tannin Part of Tibetan Medicine Phyllanthi Fructus on Apoptosis and Cell Cycle of Human Tumor
Cells
CHEN Jing FENG Guang-yuan LI Deng-ke SHI Lu-yuan SUN Zhen-xiao* ZHANG Lan-zhen (School of Chinese Pharmacy,
Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)
Abstract: Objective To investigate the mechanism of antitumor activity of tannin part of Tibetan medicine Phyllanthi Fructus
on human tumor cells in vitro . Methods The human tumor A549 cells and BEL-7402 cells were treated with tannin part of
Tibetan medicine Phyllanthi Fructus with 40, 80 and 160 μg·mL-1 for 48 h. They were detected by MTT assay.Morphology
changes in cells were examined under the inverted phase contrast microscope. Cell cycle and apoptosis in both cells were
determined by flow cytometry. Results MTT assay showed a significant cytotoxicity on A549 cells and BEL-7402 cells in
different concentration of tannin part of Tibetan medicine Phyllanthi Fructus for 48 h. Signifi cant growth inhibition and cells
shrinkage were observed in cells that received treatment. Signifi cant cells early apoptosis and G2/M phase block were induced
by tannin part of Tibetan medicine Phyllanthi Fructus . Conclusion Tannin part of Tibetan medicine Phyllanthi Fructus showed
antitumor activity in vitro. Inducing tumor apoptosis and cell cycle block contribute to this activity .
Key words: tannin part of Phyllanthi Fructus ; antitumor; apoptosis; cell cycle
藏药余甘子（Phyllanthi Fructus）为大戟科植物余甘
子Phyllanthus emblica L. 的干燥成熟果实 , 系藏族习用
药材 , 2010 版药典记载其具有清热凉血、消食健胃、生
津止渴的功效 [1]。余甘子果实富含酚类化合物 , 其中以
鞣质类、黄酮类、多糖和维生素 C 含量较多。余甘子鞣质
是余甘子水提物的重要组成部分 , 研究表明余甘子中含
有的鞣质成分主要为诃黎勒酸 , 鞣云实精等可水解鞣
质 [2]。黄清松在对小鼠移植性肿瘤的研究中发现 , 对 S180
和 H22 小鼠移植性肿瘤生长也有明显的抑制作用 , 且对
环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核发生和丝裂霉素诱发
的小鼠睾丸细胞染色体畸变均有明显的抑制效果 [3]。罗
春丽通过在体及离体实验发现 , 余甘子果汁对小鼠 S180
腹水肿瘤有明显的抑制作用 [4]。Yang B 等 [5] 发现余甘子
果实及提取物有潜在的抑制肿瘤细胞生长的作用。本课
题组前期研究发现余甘子鞣质部位对 H22 荷瘤小鼠以
及 S180 荷瘤小鼠肿瘤生长有明显抑制作用 [6]。本研究采
用流式细胞术考察余甘子鞣质部位对人肺腺癌上皮细胞
（A549）和人肝癌细胞（BEL-7402）周期和凋亡的影响 ,
进一步探究余甘子鞣质部位抗肿瘤的作用机制。
1 材料与方法
1.1 余甘子药材与鞣质部位
余甘子药材（购自北京藏医院 , 产地尼泊尔）, 经
北京中医药大学生药系阎玉凝教授鉴定为大戟科植物
Phyllanthus emblica L. 的干燥果实。取余甘子药材粉碎 ,
基金项目 :国家自然科学基金资助项目（81274187）; 北京中医药
大学自主选题项目 (2014JYBZZ-XS-097)。
作者简介:陈静,女,在读硕士,天然抗癌活性成分筛选与药理学研究。
* 通讯作者 :孙震晓 ,女, 博士 , 教授 ,天然抗癌活性成分筛选与药
理学研究。E-mail:sunzxcn@hotmail.com
中国药物警戒第 13卷第 4期 2016年 4月 April,2016,Vol.13,No.4
194
用乙醇提取、旋蒸得浓缩液 , 离心 , 取上清液过预先处
理好的大孔树脂 , 乙醇洗脱富集 , 浓缩后蒸干研磨 , 得
余甘子鞣质部位粉末。提取物有效成分为鞣质部位 , 含
量测定为 58.53%。余甘子总鞣质含量的测定方法为磷
钼钨酸 / 干酪素分光光度法 , 以磷钼钨酸为显色剂 , 在
760 nm 波长下检测余甘子中总鞣质含量 [7]。
1.2 仪器与试剂
RPMI1640 培养基、胎牛血清、双抗均为 Gibco 公
司产品 ; PI（碘化丙啶）为 Sigma 公司产品 ; 细胞凋亡检
测试剂盒为 keyFluor594-Annexin V/PI 细胞凋亡检测
试剂盒 , 凯基生物公司产品 ; 细胞培养箱（Sanyo 公司 ,
MCO-18AIC(UV) 型）; 倒置显微镜（Nikon 公司 , Nikon
ECLIPSE TE2000-S 型）; 流 式 细 胞 仪（美 国 Beckman
Coulter 公司 , Epics XL 型）。
1.3 人肿瘤细胞及培养
人肺癌 A549 和人肝癌 BEL-7402 细胞株均购自中
国医学科学院基础医学研究所细胞库 , 现在北京中医药
大学生物制药系冻存 ; A549 和 BEL-7402 细胞均采用常
规培养,在含l0%(V/V)灭活胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1
青霉素和100 μg·mL-1 链霉素的RPMI-1640培养液中 ,
37℃、5% CO2 的饱和湿度培养箱中培养 , 2~3 天换液传
代 1 次 ,取对数生长期细胞为实验对象。
1.4 细胞形态学观察
分别在倒置显微镜下观察余甘子鞣质部位对 A549
和 BEL-7402 细胞形态的影响。
1.5 MTT法测定余甘子鞣质部位对A549和 BEL-7402 细
胞的生长抑制作用
MTT 法参考文献 [8], 取对数生长期的肿瘤细胞常规
消化制成单细胞悬液 , 调整细胞浓度至 1×105 个·mL-1
左右 , 接种于 96 孔培养板中 , 每孔 100 mL, 置 37℃、5%
CO2 培养箱中培养 24 h 后给药。以 RPMI 1640 培养基
溶解余甘子鞣质部位至 40 、80 、160μg·mL-1 三种浓
度 , 分组给药测定其 pH 值均在 7.2~7.4 之间 , 酸碱度对
细胞的生长无影响。给药后置于培养箱孵育 48 h, 将 96
孔板中液体吸出 , 然后加入用 PBS 稀释的终浓度为 0.5
mg·mL-1 的 MTT 工作液 , 5%CO2, 37℃孵育 4 h 后 , 终
止培养。将 96 孔板中液体倾出 , 再于每孔加入 150 mL
二甲基亚砜（DMSO）, 置摇床上低速振荡使蓝紫色结晶
物充分溶解,10 min内测定550 nm波长下吸光度值(OD)。
抑制率计算公式 : 抑制率 =(1- 加药组 OD 值 / 不加
药组 OD 值 )×100%
1.6 流式细胞术测定余甘子鞣质部位诱导A549和BEL-7402
细胞凋亡情况
在正常细胞中 , 磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质
双层的内侧 , 而在细胞凋亡早期 , 细胞膜中的磷脂酰丝
氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种 35~36kD
的 Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白 , 与磷脂酰丝氨酸有高度亲
和力 , 故可通过细胞外暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期
细胞的胞膜结合 , 因此 Annexin V 为检测细胞早期凋亡
的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行荧光素标记 , 以标
记了的 Annexin V 作为荧光探针 , 利用流式细胞术可检
测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是
一种核酸染料 , 它不能透过完整的细胞膜 , 但对凋亡中
晚期的细胞和死细胞 , PI 能够透过细胞膜而使细胞核染
红。因此将 Annexin V 和 PI 匹配使用 , 就可以将处于不
同凋亡时期的细胞区分开来 [9]。
A549 和 BEL-7402 细胞接种培养 , 分别收集余甘子
鞣质部位（40、80、160μg·mL-1）作用48 h 及溶剂对照
组培养 48 h 的 A549 和 BEL-7402 全细胞 , 2 000 rpm 离
心 5 min 后 , 弃上清。加入 1 mL 预冷的 PBS, 2 000 rpm
离心 5 min后 , 弃上清 , 重复洗两次。按照细胞凋亡检测
试剂盒使用说明书操作 , 将细胞重悬于 500 mL Binding
buffer, 加入 5 mL Annexin V-FITC 和 PI 轻轻混匀后 , 避
光室温反应 10 min 后流式细胞仪检测。
1.7 流式细胞术结合细胞周期分析考察余甘子鞣质部位
诱导 A549 和 BEL-7402 细胞周期阻滞情况
检测细胞周期的方法参考文献 [10], 人肿瘤细胞接种
及培养、加药情况同 1.6, 分别收集余甘子鞣质部位（40 、
80 、160 μg·mL-1）作用 48 h 及溶剂对照组培养 48h
的 A549和 BEL-7402全细胞 , 2 000 rpm离心 5 min后 , 弃
上清。加入1 mL预冷的PBS重悬, 2 000 rpm离心5 min后,
弃上清 , 重复洗两次 , 加 1 mL70% 冰乙醇固定 , 4 ℃保
存过夜。测定前 1 000 rpm 离心 10 min 弃去固定液 , 加
入 1 mL 预冷的 PBS, 1 000 rpm 离心 2 min 后 , 弃上清 ,
重复洗两次 , 500 μL PBS 重悬 , 加入 RNaseA 至终浓度
20μg·mL-1, 37℃孵育 30 min, 加入 5 mL PI 染液避光染
色 10 min 后流式细胞仪检测 , ModFit LT 软件分析细胞
周期。
1.8 统计学处理
使用 SPSS 17.0 统计处理软件分析 , 多个样本均数
的比较采用单因素方差分析 , 以P<0.05 为差异有统计
意义。
2 结果
2.1 余甘子鞣质部位对人肺癌 A549 细胞和人肝癌
BEL-7402 细胞活力的影响
如图 1 所示 , 余甘子鞣质部位作用 48 h, 人肺癌
A549 细胞和人肝癌 BEL-7402 细胞活力明显下降 , 与对
照组相比 , 余甘子鞣质部位浓度为 160 μg·mL-1 时 , 对
A549和BEL-7402细胞的增殖抑制率分别为（77.4± 3.4）%
和（71.2±4.2） %。
中国药物警戒第 13卷第 4期 2016年 4月 April,2016,Vol.13,No.4
195
图 1 余甘子鞣质部位作用 48 h 对 A549 和 BEL-7402 细胞活力
的影响
2.2 余甘子鞣质部位对 A549 和 BEL-7402 细胞形态学
的影响
如图 2~3 所示 , 倒置相差显微镜（物镜倍数 10×）
下观察 , 余甘子鞣质部位处理的 A549 和 BEL-7402 细
胞与对照组 A549 和 BEL-7402 细胞比较 , 在形态学上
发生了显著变化 , 经余甘子鞣质部位处理的 A549 和
BEL-7402细胞生长较稀疏,胞体皱缩,细胞内颗粒增多。
图2 余甘子鞣质部位作用48 h对A549细胞生长形态的影响（物
镜 10×）
注 :A 为对照组 ;B、C、D分别为终浓度为 40 、80 、160 μg·mL-1 余甘子
鞣质部位处理组。
A B
C D
A B
C D
图 3 余甘子鞣质部位作用 48 h 对 BEL-7402 细胞生长形态的影
响（物镜 10×）
注 :A 为对照组 ; B、C、D分别为终浓度为 40 、80 、160 μg·mL-1 余甘
子鞣质部位处理组。
2.3 余甘子鞣质部位可诱导 A549 和 BEL-7402 发生细
胞凋亡
不同浓度的余甘子鞣质部位作用 A549 和 BEL-7402
细胞经 48 h 后 , 流式细胞术检测其细胞凋亡。如表 1~2,
A549 和 BEL-7402 细胞经 40 、80 、160 μg·mL-1 余甘
子鞣质部位处理48 h, 早期凋亡率分别为1.25%、2.70%、
36.45% 和 2.65%、3.15%、33.05%, 与 对 照 组（A549,
BEL-7402）相比 , 160 μg·mL-1 组均具有极显著差异
（P<0.01）。表明余甘子鞣质部位具有显著诱导 A549 和
BEL-7402 细胞凋亡的作用（表 1~2）。
表 1 余甘子鞣质部位作用 A549 细胞 48 h 细胞凋亡测定结果
组别 坏死 Q1 早期凋亡 Q4 晚期凋亡 Q2 活细胞 Q3
对照组
40 μg·mL-1
1.25±0.07
1.65±0.07
0.65±0.07
1.25±0.64
2.20±0.85
2.20±.014
95.95±1.06
94.95±0.78
80 μg·mL-1 1.50±0.14 2.70±0.14* 2.50±0.85 93.35±1.20
160 μg·mL-1 3.00±0.42 36.45±3.75** 12.90±2.55 47.65±5.87
注 : 与对照组比较 , *P<0.05; **P<0.01。
表 2 余甘子鞣质部位作用 BEL-7402 细胞 48 h 细胞凋亡测定结
果
组别 坏死 Q1 早期凋亡 Q4 晚期凋亡 Q2 活细胞 Q3
对照组
40 μg·mL-1
1.95±1.63
5.40±1.41
4.40±3.68
2.65±0.78
2.90±0.99
6.50±3.11
90.80±0.99
85.45±2.47
80 μg·mL-1
160 μg·mL-1
5.60±3.11
0.80±0.99
3.15±2.47
33.05±0.35**
5.00±3.25
4.45±5.44
86.2±2.83
61.75±6.72
注 : 与对照组比较 ,*P<0.05; **P<0.01。
2.4 余甘子鞣质部位对 A549 和 BEL-7402 细胞周期的
影响
A549 和 BEL-7402 细胞经不同浓度的余甘子鞣
质部位作用 48 h 后 , 利用流式细胞术检测细胞周期分
布。如表 3~4 所示 : 不同浓度的余甘子鞣质部位作用于
A549 和 BEL-7402 细胞 48 h, 细胞逐渐表现 G2/M 期阻
滞 , 随浓度增加阻滞作用增强。与对照组（8.38±0.48）
相 比 , A549 160μg·mL-1 组 的 G2/M 期 细 胞 比 率 为
（15.75±0.93）%, 有极显著差异（P<0.01）, BEL-7402

药物浓度 (μg·mL-1)
O
D
中国药物警戒第 13卷第 4期 2016年 4月 April,2016,Vol.13,No.4
196
80 μg·mL-1 组的G2/M期细胞比率为（27.80±1.13）%,
有极显著差异（P<0.01）, 40 μg·mL-1 组的 G2/M 期细
胞为（22.93±0.71）%, 与对照组相比也有显著性差异
（P<0.05）。
表3 余甘子鞣质部位作用 A549 细胞 48 h 细胞周期测定结果
组别 G1 G2/M S
对照组
40μg·mL-1
57.34±1.22
55.74±2.14
8.38±0.48
7.45±0.82
34.28±1.28
36.81±2.77
80μg·mL-1
160μg·mL-1
55.71±3.62
49.24±4.23
8.50±0.60
15.75±0.93**
35.78±3.20
35.00±4.68
注 : 与对照组比较 , *P<0.05; **P<0.01。
表4 余甘子鞣质部位作用BEL-7402细胞 48 h细胞周期测定结果
组别 G1 G2/M S
对照组
40 μg·mL-1
45.79±0.18
43.96±2.78
19.24±0.70
22.93±0.71*
34.99±0.87
34.62±1.36
80 μg·mL-1 34.18±1.80 27.80±1.13** 38.75±0.67
注 : 与对照组比较 , *P<0.05; **P<0.01。
3 讨论
藏药余甘子作为藏族习用药材 , 其抗肿瘤作用的研
究近年受到关注。关于其水提物及果汁的抗肿瘤作用国
内外已有相关报道 [4,11-12], 但有关其主要组成成分的鞣质
部位的抗肿瘤作用目前尚缺乏研究。我们前期实验证明[6],
余甘子鞣质部位对荷肉瘤 S180 和肝癌 H22 移植瘤小鼠
肿瘤有明显的抑制作用 , 对荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数没
有明显影响 , 说明余甘子鞣质部位有一定开发前景 , 值
得进一步研究。
目前已有众多研究发现 , 引起细胞周期阻滞和诱导
细胞凋亡是一些抗肿瘤药物的重要机制。正常细胞和肿
瘤细胞的增殖都依赖于细胞周期的运行 , 肿瘤治疗的中
心环节就是干扰肿瘤细胞的细胞周期 , 从而使肿瘤细胞
增殖速率减慢或诱导肿瘤细胞走向死亡 [13]。
Jeean 等 [11] 报道 , 余甘子水提物能剂量依赖性抑制
体外培养的 L929 细胞的生长、延长荷 EAC 或 DLA 细胞
腹水癌小鼠生存期及抑制 DLA 细胞诱导的实体瘤的生
长 , 并推测这种抑制作用与细胞周期阻滞有关。另有人
研究发现 , 余甘子提取物对人肝癌细胞 HepG2 和人肺癌
细胞 A549 都有一定程度的抑制作用 , 而且其抑制作用
和阿霉素以及顺铂有协同效果 [14]。因而我们选取了人
肿瘤细胞 A549 和 BEL-7402, 进一步研究余甘子鞣质部
位抑制人肿瘤细胞的生长情况及机制。
本研究在前期研究基础上 , 采用体外细胞培养、形
态学观察和细胞活力测定技术研究了余甘子鞣质部位对
人肿瘤细胞活力的影响 , 进一步利用流式细胞术检测了
余甘子鞣质部位作用后 , A549 和 BEL-7402 细胞凋亡和
周期的变化情况 , 发现余甘子鞣质部位体外对人肿瘤细
胞 A549、BEL-7402 均有明显的生长抑制作用 , 而这种
抑制作用与诱导肿瘤细胞凋亡及细胞G2/M期阻滞有关 ,
初步阐释了余甘子鞣质部位的体外抗肿瘤作用机制 , 另
外 , 课题组前期实验还发现 , 余甘子鞣质部位能够显著
抑制人纤维肉瘤细胞 HT1080 的迁移和侵袭 [15], 这些均
为余甘子在抗肿瘤领域的进一步研发奠定了基础。对于
余甘子鞣质部位抗肿瘤作用的分子机制尚需进一步深入
研究。
参考文献 :
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].化学工业出版社,
2010:167.
[2] 张兰珍 ,赵文华 ,郭亚健 ,等 . 藏药余甘子化学成分研究 [J]. 中国
中药杂志 , 2003,28(10):46-49.
[3] 黄清松 , 林元藻 , 李红枝 , 等 . 余甘子抗突变和抗肿瘤作用研究
实验 [J]. 实用医技杂志 , 2007,14(25):3456-3457.
[4] 罗春丽 . 余甘子对肿瘤细胞抑制作用及免疫调节的研究 [J]. 中
国实验方剂学杂志 ,2010,16(13):155-158.
[5] Yang B, Liu P. Composition and biological activities of hydrolyzable
tannins of fruits of phyllanthus emblica[J]. Journal of agricultural and
food chemistry, 2014, 62(3): 529-541.
[6] 冯光远 , 李登科 , 吴玲芳 , 等 . 藏药余甘子鞣质部位对小鼠移植
性肿瘤的抑制作用 [J]. 中国药物警戒 , 2015,4(12):193-196.
[7] 吴玲芳 , 张鸿雁 , 王坤风 , 等 . 不同产地藏药余甘子总鞣质含量
测定 [J]. 中国实验方剂学杂志 , 2013, 19(15): 61-63.
[8] 赵晨 , 付莹 , 林华英 , 等 . 毛蚶抗癌活性蛋白对 K562 细胞增殖和
凋亡的影响 [J]. 中国药理学与毒理学杂志 , 2016,30(3): 221-228.
[9] 李子木 , 孙震晓 . 伊立替康联合去甲斑蝥素对人胃癌细胞作用的
考察及协同作用机制研究[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics,
2015, 42(2): 169-181.
[10] 崔宝弟 , 王敏 , 孙震晓 . 去甲斑蝥素对人肺腺癌 A549 细胞的抑制
作用 [J]. 癌变 . 畸变 . 突变 , 2015, 27(1): 21-25.
[11] Jeena K.Jose,Girija Kuttan,Ramadasan Kuttan. Antitumor activity of
Emblica offcinalis [J].Journal of Ethnopharmacology,2001,75(2):65-69.
[12] 崔炳权 , 何震宇 , 杨泽民 , 等 . 余甘子提取物对小鼠免疫功能的
影响[J].时珍国医国药 , 2010,21(8):1920 -1922.
[13] Debatin K M. Apotosis pathway in cancer and cancer therapy[J].
Cancer Immunol Immunother, 2004,53(3):153-197.
[14] Pinmai K, Chunlaratthanabhorn S, Ngamkitidechakul C, et al. Synergistic
growth inhibitory effects of Phyllanthus emblica and Terminalia
bellerica extracts with conventional cytotoxic agents: Doxorubicin and
cisplatin against human[J].World Journal of Gastroenterology,
2008,14( 10) : 1491-1497.
[15] 赵海娟 , 龚曼 , 常青 , 等 . 藏药余甘子鞣质部位对 HT1080 细胞
迁移与侵袭能力的影响研究[J]. 中国药物警戒,2014,11(5):264-267.
（收稿日期 :2016-02-15 编辑 :范燕）