全 文 ：收稿日期:2014-05-06; 修订日期:2014-11-22
基金项目:国家药品标准提高暨 2015 版药典科研任务(国家药典委员会)
作者简介:王佰灵(1987-)，女(汉族)，河南商丘人，广东药学院中药分析
实验室硕士研究生，主要从事中药质量控制研究工作．
* 通讯作者简介:梁生旺(1954-)，男(汉族)，河南安阳人，广东药学院中
药分析实验室教授，学士学位，主要从事中药质量控制研究工作．
鸡骨香挥发油的 HPLC指纹图谱研究
王佰灵1，王淑美1，孟 江1，王国才2，黄天山1，梁生旺1*
(1．广东药学院中药分析实验室，广东 广州 510006;
2． 暨南大学中药及天然药物研究所，广东 广州 510632)
摘要:目的 利用高效液相色谱建立鸡骨香挥发油的指纹图谱。方法 采用 Phenomenex Luna(2)C18柱 (250 mm × 4． 6
mm，5 μm )，以乙腈 － 0． 1 %的磷酸溶液梯度洗脱，流速为 1． 0 ml·min －1，检测波长 225 nm，柱温 30 ℃。结果 以 Cypen-
renoic acid为对照，通过对 10 批鸡骨香样品进行测定，标定了 24 个共有峰，并通过“中药色谱指纹图谱想色度评价系统”
和聚类分析等辅助手段，计算相似度等相关参数。结论 该方法准确可靠，重现性好，为更好的控制鸡骨香药材挥发油内
在质量提供了科学依据。
关键词:鸡骨香挥发油; 指纹图谱; Cypenrenoic acid; 高效液相色谱
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 03． 018
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)03-0565-02
鸡骨香为大戟科巴豆属植物鸡骨香 Croton crassifolius geisel
的根，味辛、苦，性温，入心、肺、肝、胃、肾五经，具有理气止痛，祛
风除湿，舒筋活络的功效，主要用于风湿痹痛、腰腿痛、胃及十二
指肠溃疡、胃肠功能紊乱、胃肠胀气、咽喉肿痛、黄疸、疝痛、跌打
肿痛、外治毒蛇咬伤等［1，2］。鸡骨香主要含有萜类(倍半萜及其
衍生物占挥发油成分的 80 %以上)、氨基酸、有机酸以及 β －谷
甾醇、豆甾醇等成分［3 ～ 6］，其中挥发油含量达 3． 2 %，由于其分布
于我国海南、广东、广西、福建等南部地区以及越南、老挝、泰国等
国家，产地较广，受地理环境、贮存等因素的影响，鸡骨香中化学
成分的种类及含量不尽相同，为保证其稳定的质量，必须对鸡骨
香挥发油进行质量控制。本文采用对挥发油影响较小的 HPLC
法，以二极管阵列为检测器，建立了鸡骨香挥发油的指纹图谱，并
采用 SPSS聚类分析法，对 10 批鸡骨香挥发油进行评价，为全面
控制鸡骨香挥发油质量提供了依据。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪，Waters 2996 二极管
阵检测器，Sartorius BP211D 十万分之一电子天平;超声仪(昆山
市超声仪器有限公司，KQ －500E型)，移液管。
1． 2 试剂和药品 甘菊酸 Cypenrenoic acid对照品均由暨南大学
提供;鸡骨香药材购自广西及广州清平药材市场，经广东药学院
李书渊教授鉴定为大戟科巴豆属植物鸡骨香 C． crassifolius Geisel
的根;甲醇、乙腈均为欧普森色谱纯，其他试剂为分析纯，水为超
纯水。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex Luna(2)C18柱 (250 mm ×
4． 6 mm，5 μm )，流动相 A:乙腈，B:0． 1 %磷酸水，梯度洗脱，见
表 1。检测波长:254 nm;进样量 10 μl。
2． 2 Cypenrenoic acid对照品溶液的制备 精密称定对照品 Cypen-
renoic acid 10． 60 mg，放于 50 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，配成
浓度为 0． 212 mg·ml －1的对照品溶液。
表 1 梯度洗脱条件
时间 /min
流速
/ ml·min －1
流动相
乙腈 / % 0． 1 %磷酸水 / %
0 1． 00 50 50
40 1． 00 50 50
60 1． 00 70 30
110 1． 00 100 0
2． 3 供试品溶液的制备［7］ 取鸡骨香药材药材 25 g，按《中国药
典》挥发油的提取方法提取挥发油，将所得挥发油定容至 10 ml，
摇匀，过 0． 45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2． 4 方法学考察
2． 4． 1 分析时间考察 吸取供试品 10 μl，注入高效液相色谱仪，
运行 120 min，记录色谱图，发现 110 min 以后已无明显色谱峰，
因此分析时间定为 110 min。
2． 4． 2 专属性试验 为考察流动相中是否有杂质干扰样品分析，
故先用流动相走空白梯度，试验结果表明流动相中几乎没有杂质
干扰样品分析。
2． 4． 3 精密度试验 取采自清平东药材市场(2013030101)的同
一份供试品溶液，连续进样 6 次，记录指纹图谱，以 Cypenrenoic
acid为参照，计算指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间和相对
峰面积，结果各色谱峰的相对保留时间和峰面积 ＲSD 分别小于
1． 00 %，5． 00 %，相似度≥0． 999，表明精密度良好。
2． 4． 4 稳定性试验 取采自清平东药材市场(2013030101)的同
一份供试品溶液，分别于 0，4，8，12，24h 进样 10 μl，记录指纹图
谱，以 Cypenrenoic acid为参照，计算指纹图谱中主要色谱峰的相
对保留时间和相对峰面积，结果各色谱峰的相对保留时间和峰面
积 ＲSD分别小于 1 ． 00 %，5． 00 %，相似度≥0． 999，说明供试品
在 24 h内稳定。
2． 4． 5 重复性试验 取采自清平东药材市场(2013030101)的同
一份供试品溶液，按“2． 3”项下供试品溶液制备方法平行制备 6
份供试品溶液，进样 10 μl，记录指纹图谱，以 Cypenrenoic acid 为
参照，计算指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面
积，结果各色谱峰的相对保留时间和峰面积 ＲSD 分别小于
1． 00%，4． 97%，相似度≥0． 999，表明重复性良好。
2． 5 指纹图谱的建立
2． 5． 1 参照峰的选择及共有峰的标定 精密吸取 Cypenrenoic
acid对照品溶液和供试品溶液各 10 μl注入高效液相色谱仪，记
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录色谱图，发现 Cypenrenoic acid 对照品色和供试品在保留时间
相同处有相同的色谱峰且 Cypenrenoic acid 色谱峰扥分离度较
好，稳定，因而选择 Cypenrenoic acid 为参照峰。通过对 10 个批
次的色谱图分析比较，共标定了 24 个共有峰，确定为共有特征
峰，结果见图 1。
图 1 鸡骨香挥发油参照峰及供试品 HPLC图
2． 5． 2 共有峰的相对峰面积的计算 以各批次的 Cypenrenoic
acid峰为参照峰，计算同一图谱中各共有峰的相对峰面积，其结
果见表 2。
表 2 样品共有峰的相对峰面积
No．
批次
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
平均值
1 0． 9727 0． 7464 1． 1742 1． 3549 1． 1085 2． 0128 0． 8291 0． 5568 0． 8046 0． 7714 0． 9210
2 0． 9270 3． 6075 6． 8127 1． 4447 2． 0979 16． 9498 1． 6488 0． 5067 0． 8439 4． 9127 3． 6713
3 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000 1． 0000
4 0． 6651 0． 6529 0． 6642 0． 7508 0． 6868 1． 1977 0． 6362 0． 3942 0． 5391 0． 4428 0． 6044
5 1． 3897 0． 9803 1． 2062 2． 3324 2． 2954 2． 1800 2． 0200 0． 9407 1． 3503 0． 7379 1． 2881
6 0． 6234 1． 6101 1． 9122 0． 9340 0． 8761 3． 9609 0． 7886 0． 5183 0． 6001 1． 4440 1． 2658
7 0． 6389 0． 8122 1． 0078 0． 3813 0． 5902 2． 3620 0． 3666 0． 2398 0． 3510 0． 6917 0． 7005
8 6． 8072 7． 4199 7． 9548 14． 3501 11． 3391 17． 7284 10． 1723 6． 9632 9． 3814 5． 3509 8． 2881
9 0． 7022 0． 8869 1． 3434 2． 4703 2． 2878 3． 0587 2． 1681 1． 0770 1． 6691 0． 9943 1． 3617
10 0． 9084 0． 8276 0． 8953 1． 9921 1． 2195 1． 7032 1． 2262 0． 6075 0． 9195 0． 5472 0． 9013
11 0． 7037 0． 5212 0． 6583 1． 9354 1． 3693 1． 9678 1． 7839 0． 9092 1． 1937 0． 5022 0． 9197
12 0． 5859 1． 2906 1． 9507 2． 3443 1． 3463 4． 8953 1． 7787 0． 8119 1． 2949 1． 4400 1． 5057
13 1． 1409 0． 9093 0． 5803 0． 5536 1． 1319 1． 0128 0． 3360 0． 1363 0． 2067 0． 7187 0． 6610
14 0． 4260 0． 3672 0． 4469 0． 4949 0． 4536 0． 9819 0． 5229 0． 3745 0． 5253 0． 3090 0． 4403
15 2． 4447 0． 4657 0． 6850 4． 6220 3． 6464 1． 1294 2． 0241 0． 7994 1． 4645 0． 3412 1． 2802
16 0． 4142 0． 1238 0． 3085 1． 7512 0． 9034 0． 6608 0． 4825 0． 5050 0． 4919 0． 2685 0． 4339
17 0． 2757 0． 2347 0． 5219 2． 0304 0． 6409 1． 6242 0． 8058 0． 4672 0． 5561 0． 3476 0． 5410
18 0． 7504 0． 8150 1． 0843 1． 5783 1． 2575 2． 1895 1． 2936 0． 8410 1． 0338 0． 7386 1． 0011
19 3． 3917 9． 4730 10． 5864 4． 5600 3． 9378 32． 2561 4． 1057 2． 6675 4． 2221 13． 1362 8． 5132
20 2． 1318 1． 8279 4． 1487 9． 8565 4． 9429 10． 2176 6． 2583 3． 7126 4． 2344 2． 5346 3． 8982
21 0． 3601 0． 4590 1． 1604 1． 3419 0． 7260 2． 7896 0． 6138 0． 2944 0． 5066 0． 7122 0． 7352
22 0． 5512 0． 9744 2． 7826 1． 9361 1． 1174 5． 3017 1． 7501 0． 5892 0． 9941 1． 7043 1． 5497
23 0． 5886 0． 6868 2． 6172 1． 5755 1． 1354 4． 1215 1． 3046 0． 5755 1． 0081 1． 3875 1． 3332
24 2． 5665 1． 6367 3． 9997 6． 0489 4． 7358 7． 1763 4． 0659 2． 2881 3． 5322 2． 0155 3． 1286
2． 5． 3 相似度计算 将 10 批样品色谱图导入《中药色谱特征图
谱相似度评价系统》(2004A版)，采用中位数法，选取时间窗宽
度为 0． 1 min，生成对照图谱，进行校正后，得出样品与对照谱图
的匹配图，结果见图 2。计算各谱图的整体相似度，结果见表 3。
直观观察可以将指纹图谱分为 4 个区即Ⅰ区(相对保留时间为
0． 43 ～ 0． 52)，Ⅱ区(相对保留时间为 1． 00 ～ 1． 69) ，Ⅲ区(相对保
留时间为 1． 99 ～ 2． 12)，Ⅳ区(相对保留时间为 2． 29 ～ 2． 85)。其
中峰数主要集中在Ⅱ区和Ⅳ区，Ⅰ区和Ⅲ区较少。参照峰在Ⅱ
区，该区排列较为紧密，为强吸收峰群且分离度较好，Ⅳ区结构同
Ⅱ区，但分离度稍差。计算各谱图的整体相似度，结果见表 3。
2． 6 系统聚类分析 应用 SPSS 20． 0 统计软件，采用组间均联法
(between － groups linkage)，选用夹角余弦(cosine)为测度［8，9］，
对 10 批鸡骨香挥发油进行聚类分析，结果见图 3。由聚类分析
结果表明，10 批鸡骨香挥发油共分为两大类，其中第 3、10、6 批
为一类，其余聚为第二类。在后者中，7、8、9、4、5 批的亲缘关系
较近，1、2 批的亲缘关系也较近。从以上果还可看出，相似度结
果和聚类分析也不完全一致，进一步证实了鸡骨香挥发油的质量
受环境、贮存等因素的影响较大。
图 2 鸡骨香挥发油共有模式指纹图谱
表 3 相似度计算结果
批号 样品批次 相似度
S1 清平东药材市场(2013030101) 0． 958
S2 清平中药材市场(20130509) 0． 84
S3 清平中药材市场(20120905) 0． 785
S4 广州采芝林(20130518) 0． 969
S5 清平中药材市场(20130301) 0． 979
S6 清平中药材市场(20120905) 0． 735
S7 致信(20130321) 0． 99
S8 清平中药材市场(20130509) 0． 994
S9 清平东药材市场(2013030102) 0． 997
S10 广西(20130403) 0． 717
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 3
图 3 10 批鸡骨香挥发油聚类分析树状图结果(以相对峰面积聚类)
3 讨论
3． 1 挥发油的指纹图谱 文献大多采用气相色谱法，程序升温
时，较高的温度对其成分的稳定性产生影响。鸡骨香中的挥发
油，大多具有紫外吸收。本研究采用 HPLC 法，二极管阵列为检
测器，建立了挥发油的指纹图谱，在避免了高温对挥发油稳定性
影响的同时，又保证了实验结果的准确性。
3． 2 色谱条件的考察 主要比较了甲醇 －水、乙腈 －水、乙腈 －
磷酸 4 种体系;0． 8，1． 0 ，1． 2 ml · min －1 3 种流速;25 ℃、30 ℃、
35 ℃ 3 个柱温;225、254 、270 nm 3 个检测波长，结果表明:以乙
腈 － 0． 1 %磷酸梯度洗脱、流速为 1． 0 ml · min －1、柱温为 30
℃、225 nm为检测波长时色谱图基线较为平稳，漂移较小，色谱
峰的个数和面积较为适宜。该方法可为鸡骨香挥发油质量的控
制提供参考。
从 10 个批次的鸡骨香的相对峰面积数值可以看出，10 个产
地的鸡骨香挥发油色谱图中特征峰的峰面积因样品的批次不同，
差异较大，该差异主要可通过各特征峰的相对峰面积表达出。本
研究在统一了挥发油提取方法、分析仪器和分析方法的基础上，
得到的各批次指纹图谱仍然有较大差异，可以推测鸡骨香挥发油
化学组分种类及其含量受到贮存时间、生长环境等因素的影响，
批次不同，差异较大。笔者建议，为了更好控制鸡骨香挥发油的
质量，有必要建立其挥发油指纹图谱，从而为该药材的质量标准
的制定及规范化种植提供科学依据与参考。
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［9］ 宋 媛．聚类分析中确定最佳聚类数的若干问题研究［D］．延边大
学硕士论文，2013．
收稿日期:2014-04-29; 修订日期:2014-10-19
基金项目:国家自然科学基金(No． 81300688);山东省自然科学基金(No． ZＲ2009CQ013) ;山东省中医药管理局资助项目(No． 2013 － 237)
作者简介:刘江月(1979-)，女(汉族)，山东龙口人，潍坊医学院讲师，硕士学位，主要从事病理生理教学及糖尿病并发症的防治研究工作．
降糖调脂灵抑制核因子 кB核转位
对 T2DM血管内皮的损伤作用
刘江月
(潍坊医学院，山东 潍坊 261053)
摘要:目的 研究降糖调脂灵抑制氧化应激诱导的核因子 кB核转位对 T2DM早期血管内皮的损伤作用。方法 以高糖高
脂饮食 +腹腔注射 STZ诱发糖尿病，将 40 只糖尿病 Wistar大鼠随机分为 4 组:模型组、吡格列酮组、中药高剂量组、中药
低剂量组，另以 10 只正常 Wistar大鼠作为对照组。造模同时分别给予相应药物灌胃，吡格列酮组给予吡格列酮 5mg·
kg －1·d －1，中药组低剂量组和高剂量组分别给予降糖调脂灵低、高剂量浓缩液各 5 ml·kg －1·d －1，对照组、模型组均给
予生理盐水 5mg·kg －1·d －1。6 周后观察离体胸主动脉环内皮依赖性血管舒张反应;透射电镜观察主动脉血管内皮细
胞超微结构的改变;检测血清一氧化氮(NO)、内皮素(ET)、氧化，低密度脂蛋白(oxLDL)、晚期糖基化终末产物(AGEs)、
血管内皮细胞黏附分子 － 1(VCAM －1)、单核细胞趋化蛋白 － 1(MCP － 1)水平;检测血清及肝脏丙二醛(MDA)、总抗氧
化能力(T － AOC)的水平及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH － Px)活性;检测主动脉组织核因子 － кB
(NF － кB)、IкB蛋白表达。结果 中药高剂量组大鼠内皮依赖性血管舒张功能损伤明显减轻，内皮细胞超微结构损伤明
显改善，血清 NO水平明显升高，ET显著降低;血清及肝脏 MDA、TAS水平明显降低，SOD、GSH － Px 活性明显升高;血清
LOX － 1、AGEs、TNF － α及 MCP － 1 水平显著降低;主动脉细胞核内 NF － кB 蛋白表达明显减少而 IкB 蛋白表达明显增
多，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 05)。结论 降糖调脂灵对 T2DM血管损伤具有保护作用，其机制可能与其阻止氧化应激
诱导的 NF － кB 核转位抑制炎症反应有关。
关键词:2 型糖尿病; 氧化应激; 核因子 кB
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 03． 019
中图分类号:Ｒ543． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)03-0567-04
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 3 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 3 期