全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2008 年
第 47 卷第 10期
2008年 10月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 47 No.10
Oct．，2008
收稿日期：2008－05－10
基金项目：国家民委科研项目（07HB03）；湖北省生物资源保护利用重点实验室开放课题项目（2007001）
作者简介：雷红灵（1967－），女，湖北恩施人，副教授，博士研究生，（电话）13986860035（电子信箱）leihl123366＠163．com；通讯作者，吴永尧。
恩施碎米荠（Cardamine enshiensis）是在恩施高
硒区生长的十字花科的碎米荠属（Cardamine Linn）
的一种具有超富聚硒能力的植物，其硒的蓄积量可
达 800～1 000 mg·kg－1［1］。 硒在植物中以有机硒和无
机硒两种形式存在 ［2］，植物中的有机硒形式多种多
样， 小分子形式主要是硒代氨基酸及其衍生物存
在，以大分子形式存在的硒则包括硒蛋白、含硒核
糖核酸、硒多糖等［3］，而硒蛋白是硒在生物体内存在
的一种主要功能大分子形式。 有效地分离和鉴定植
物体内的硒蛋白，是了解其功能的前提，同时也可
为探讨富硒植物的富硒机理提供参考。 目前，对于
蛋白质的研究仍以双向电泳技术作为主要分离手
段和高通量生物质谱技术联用，对蛋白质进行分离
鉴定。 双向电泳技术自 1975年意大利生化学家 O’
Farrell等发明以来， 分辨率和可重复性在不断地改
进，特别是 1982 年 Bjellqvist 等 ［4］开始采用固相 pH
梯度胶（immobilized pH gradients，IPG）代替传统两
性电解质载体在电流作用下形成的 pH梯度， 消除
了传统 IEF 阴极漂移的问题，具有快速、重复性好
等优点。 所以本研究以双向电泳技术作为分离手
段，探讨恩施碎米荠的种子蛋白质样品的制备及其
双向电泳技术条件的建立，以了解其蛋白质组的组
成和分布，探索用双向电泳技术研究恩施碎米荠硒
蛋白组的可行性， 为进一步研究硒蛋白的分离纯
恩施碎米荠种子蛋白质双向电泳初探
雷红灵 1，2，付 明 3，吴永尧 2
（1．湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；
2． 湖北民族学院湖北省生物资源保护与利用重点实验室，湖北 恩施 445000；3． 怀化学院生物工程系，湖南 怀化 418008）
摘要：对湖北恩施高硒地区生长的具有超富硒能力的植物恩施碎米荠的种子蛋白质用 TCA－丙酮沉淀提
取，等电聚焦采用固相梯度胶条，双向电泳分离蛋白质。 结果表明，蛋白质样品制备的质量高；银染胶图
背景干净，蛋白点清晰，且呈现较好的聚焦结果，无明显拖尾或横纹现象；蛋白质集中分布在 pH5～10 的
范围之内，分子量主要在 20～60 kμ的范围之内。
关键词：恩施碎米荠；超富集硒植物；种子；蛋白质；双向电泳
中图分类号：Q949．748．3；Q946．1；Q503 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2008）10－1114-03
Study on Two－dimension Electrophoresis of Seed Proteins of Cardamine enshiensis
LEI Hong－ling1，2，FU Ming3，WU Yong－yao2
（1． College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；
2． Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province， Hubei University for Nationalities， Enshi 445000，
Hubei， China； 3． Department of Bioengineering， Huaihua University， Huaihua 418008， Hunan， China）
Abstract： TCA－acetprecipitation was adopted to extract seed protein of Cardamine enshiensis， a Se hyperaccumulator， which
was grown in the seleniferous area of Enshi，Hubei． Two－dimension Electrophoresis was adopted to separate seed protein and
the first－dimensional electrophoresis was immobilized pH gradients isoelectric focusing． The result showed that the quality of
sample of protein was high， silver staining of protein spots in the polyacrylamide gel were clear， and isoelectric focusing was
effective， without tailing and transverse striation； most of proteins’ isoelectric points were between 5～10． The relative molec-
ular weight of most of proteins were in the range of 20～60 kμ．
Key words： Cardamine enshiensis； Se hyperaccumulator； seed； protein； two－dimension electrophoresis
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2008.10.002
第 10 期
化、硒在生化水平上对该植物生长发育的影响及植
物的富硒机理等提供参考依据。
1 材料与方法
1．1 材料、仪器和试剂
恩施碎米荠种子在 2007 年 9 月采于恩施市高
硒地区鱼塘坝 （海拔 800～1 000 m）； 主要仪器有
JY92－Ⅱ超声波细胞粉碎机 （宁波新芝），Ultrospec-
tr3000 紫外分光光度计 （Amersham Pharmacia），
5417R 台式高速冷冻离心机（Eppendroff），IPGphor
等电聚焦仪 （Amersham），Ettan II 垂直板电泳仪
（Amersham），ZP－200 脱色摇床（江苏太仓市实验设
备厂），Power look 2100xl 凝胶成像仪（Amersham）
等；主要试剂有 CHAPS（3－［（3－胆酰胺丙基）二乙
胺］丙磺酸（Calbiochem 公司），尿素、三羟甲基氨基
甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）为 GibcoBRL 公
司产品，二硫苏糖醇（DTT）为 Promega 公司产品，考
马斯亮蓝 G－250、IPG 缓冲液（pH 3～10 NL）、固相
pH 梯度胶条 （pH3～10 NL，24cm） 为 Amersham
Pharmacia公司产品，考马斯亮蓝 R－250、丙烯酰胺、
SDS、甲叉双丙烯酰胺、N，N，N’，N－四甲基乙烯二胺
（TEMED）、溴酚蓝均为 Sigma 公司产品，过硫酸胺
（北京化工厂 ）， 低分子量标准蛋白 （Amsheram
Biotech 公司），PMSF （深圳赛泰克生物科技有限公
司），BSA 标准品（北京原平皓生物技术公司），其他
试剂均为国产分析纯。
1．2 方法
1．2．1 种子蛋白质样品的制备 ①TCA－丙酮沉淀。
称取恩施碎米荠种子 2 g， 砸碎， 液氮研磨至粉末
状，按 1∶10 加入－20℃预冷的 10％ TCA－丙酮，加入
终浓度为 1 mmol·L－1 PMSF，2 mmol·L－1 EDTA，10
mmol·L－1 DTT，－20℃沉淀过夜 ，25 000 g 离心 30
min，弃上清液。向沉淀中加入－20℃预冷丙酮，－20℃
沉淀 30 min，离心 15 min，弃上清液，重复以上操作
两次。 沉淀真空干燥约 5 min，除尽有机溶剂，－20℃
保存备用。②蛋白质的裂解。按 10 mg干粉加入 200
μL 蛋 白 裂 解 液 [7 mol 尿 素 、2 mol 硫 脲 、4％
CHAPS、0．5％两性电解质 （pH 3～10）]、40 mmol·L－1
Tris base（pH 8．5）的比例，加入 1 mmol·L－1 PMSF、2
mmol·L－1 EDTA、10 mmol·L－1 DTT， 冰浴超声 5 min
（功率 24％，2s ／ 4s），35 000 g 离心 15 min，上清即为
所需的蛋白溶液，小量分装，－80℃保存备用。
1．2．2 蛋白质的定量 参考 Bradford 法 ［4］ 进行改
良，以牛血清白蛋白（BSA）制作标准曲线，计算提取
液中蛋白质的质量分数。
1．2．3 双向电泳 根据定量结果， 取含蛋白质 50
μg 的提取液，加入 350 μL 水化液中（水化液配方：
40 mmol·L－1 Tris－HCl，pH 8．0，8 mol·L－1 尿素，2％
CHAPS）， 另外加入 DTT 至终浓度 65 mmol·L－1，pH
3～10 的电解缓冲液至终浓度 0．5％ ，充分混匀 ，
14 000 r·min－1、4℃离心 10 min。 ①一相等电聚焦。
选用 18 cm、pH3～10 的线性胶条（Bio－rad），水化槽
上样，程序见表 1。其聚焦总伏小时数为 60 000V·h－1。
②二相 SDS－PAGE 电泳。 12％聚丙烯酰胺凝胶电
泳，5～10 mA 开始， 溴酚蓝到达分离胶后加大电流
到 10～15 mA。 标准分子量蛋白质（14、20、31、43、
66、97 kμ）在胶条的碱性端上样。 ③染色。 银染法
（与质谱兼容）［6］。
2 结果与分析
2．1 种子中蛋白质的质量分数
在 Excel 工作表中，以吸光度为横坐标，以反应
蛋白量为纵坐标， 则得到的标准曲线方程为 y＝
7．057 7x－0．226 8，R2＝0．991 7。根据标准曲线计算，提
取液中蛋白质的质量分数为 12．465μg·μL－1。可见，提
取样品中蛋白质的质量分数还是较高的。 在蛋白质
的裂解时采用了低功率超声波破碎细胞，进一步增
加了蛋白质的溶解。
2．2 双向电泳图谱分析
由图 1 可以看出，银染胶图背景干净，蛋白点
清晰，且呈现较好的聚焦结果，无明显拖尾或横纹
现象。 说明该样品通过 TCA－丙酮沉淀、3 次丙酮洗
表 1 一相等电聚焦水化程序
水化步骤
S1
S2
S3
S4
S5
S6
电压/V
50
500
1 000
4 000
8 000
8 000
时间
4 h
8 h
30 min
30 min
30 min
30 min
方式
S（快速）
S（快速）
S（快速）
G（梯度）
G（梯度）
S（快速）
14 kμ
21 kμ
33 kμ
43 kμ
66 kμ
97 kμ
3 pH 10
图 1 碎米荠种子双向电泳图谱
雷红灵等：恩施碎米荠种子蛋白质双向电泳初探 1115
湖 北 农 业 科 学 2008 年
（责任编辑 王 珞）
涤后，可以有效地去除其他杂质；该样品的蛋白集
中分布在 pH5～10 的范围之内， 分子量主要在 20～
60 kμ； 且蛋白呈现明显的高丰度和低丰度的区分，
这可以认为是由于样品为完整的种子蛋白，所以子
叶中的储存蛋白会占据蛋白样品的大部分，由于这
些高丰度蛋白影响显色时间的控制，所以，致使一
些其他丰度相对较低的蛋白在胶图上呈现较弱的
斑点。
3 小结与讨论
双向电泳的蛋白质有效分离很大程度取决于
样品的制备，本试验采用目前常用的植物蛋白质提
取方法 TCA 丙酮沉淀， 并用多次丙酮洗涤除去
TCA，达到了有效去除其他杂质的目的，且在每一步
操作过程中均加入蛋白酶抑制剂、还原剂等，以尽
量减少蛋白质的降解；蛋白质裂解液添加尿素和硫
脲，且采用了低功率的冰浴超声处理，有效增加了
样品蛋白的溶解。 所以得到了分辨率较好的图谱，
为后续的进一步研究蛋白质表达差异提供了参考。
种子作为一种繁殖器官，蛋白质的质量分数较
高，但由于高丰度的贮存蛋白会影响低丰度蛋白的
分离和显色，所以最好能将高丰度蛋白和低丰度蛋
白在样品的提取过程中进行预分离， 分别电泳，对
于低丰度蛋白要增加上样量，从而对其蛋白进行一
定的富集并分离。 此外，若想进一步更好的分离蛋
白， 可以考虑选择 pH 范围较小的一向胶条 ，如
pH4～7 或 pH 6～10。 从另一方面来看，种子中含有
大量的贮存蛋白，且野生恩施碎米荠种子硒含量也
较高（450 mg·kg－1）［1］。 硒可以硒代半胱氨酸和硒代
蛋氨酸的形式直接掺入蛋白质中， 形成硒蛋白，所
以进一步探讨种子中硒蛋白的组成和分布，可以将
这些高丰度蛋白作为研究对象，这对于硒蛋白的分
离纯化及硒蛋白的开发利用有着重要的意义。 此
外，本研究双向电泳条件的建立可以用于该植物叶
片蛋白质组的分离，对于后续利用叶片蛋白质组研
究该植物富硒条件下的差异表达提供了参考依据。
硒超富集植物，不仅可以用于修复生态环境污
染，而且可用于开发富硒补硒保健产品，甚至于提
取有效的抗癌药物，具有重要的研究利用价值。 代
表性的硒超富集植物为豆科的双槽紫云英（Astragal
us bisulcat us）和十字花科的 Stanley apinnata，其主
产于美国西南部和南部［7］。而在我国，恩施碎米荠是
首次发现的生长在高硒地区含硒最高的超富聚硒
植物 ［1］，因此对此植物的研究及其应用开发十分必
要。 我们将以该植物的蛋白质作为研究对象，对硒
蛋白的组成和分布、硒蛋白的分离纯化、硒蛋白的
生化活性等方面做进一步的研究和探讨。
参考文献：
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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
襄樊市农业科学院选育 。 品种审定编号为鄂审麦
2008004。
特征特性：属弱春性品种。 株型较紧凑，植株较高，分蘖
力较强，成穗率中等。 茎秆无腊粉，旗叶下披。 穗纺锤形，长
芒，白壳，红粒，子粒长圆形。后期熟相较好。 抗倒性一般。 生
育期 193.9 d。区域试验平均每公顷产量 6 304.5 kg，比对照郑
麦 9023 增产 4.94%。 主要品质指标达到国家专用小麦中筋
标准。 中感赤霉病、条锈病、白粉病和纹枯病。 适于湖北省小
麦产区种植。
栽培要点：①鄂北 10 月 18 日至 10 月 28 日播种，鄂东
及江汉平原 10 月 28 日至 11 月 7 日播种， 公顷基本苗 180
万~240 万株。 ②一般每公顷施纯氮 150~180 kg、五氧化二磷
90~105 kg、氧化钾 90~120 kg，其中氮肥 60%作底肥、40%作
追肥。 ③注意清沟防渍；5 叶 1 心期看苗适量喷施多效唑，防
止倒伏。 ④注意防治病虫害并适时收获。
小麦新品种——襄麦 25
1116