全 文 ：4 续 6第二军 医 大学学报19 6 8年第7 卷第 6期
小扁豆凝集素的双缩眠法测定
王琦钧 (药学系附属药厂 )
我系利用国产原料研制成功了小扁豆凝
集素 (L ent i lL e et i n ), 对于小扁豆凝集素的
分析法 , 国内未见报道 , 亦未查见国外的有
关资料 。 为解决其含量测定方法 , 我们 曾用
紫外吸收法 、 福林 一酚试剂法和双缩脉 法 等
测定蛋 自质的方法进行预试 , 并用凯氏定氮
法做对照 , 分别与上述三法进行比较 , 发现
除双缩脉法外其余二法均与凯氏定氮法所测
偏离较远 , 不适应用 , 因此用双缩脉法进行
了反复试验 , 找出了用本法测定小扁豆凝集
素的适宜条件 , 得到了较为满意的结果 。
仪器和试剂
仪器 : 国产 72 1分光光度计 。
试剂 :
1
. 牛血清自蛋 白标准液 : 精确称 取 由
瑞士 lF u ka 公司进 口的牛血清白蛋 白适量 l(1 匕
号 2 4 1 9 9 2 , 含量 9 9 . 6 6%经凯氏 定 氮 法 测
知 ) , 用 0 . 0 5 N N a O H 液配制成 1 0m g /m l l均
标准液 。
2
. 双缩脉试剂 :取 0 . 75 9硫酸铜 ( C u S O 4
·
S H
: O )和 3 . 0 9 酒石酸二钠 (N a : C 4 H 4 O 。 ·
4 H
Z
O )
, 用 2 5 0m l 蒸馏水溶解 , 再加入 1 0 ;石
N a O H 溶液 1 50 m l , 边加入边搅拌 , 最后 用
蒸馏水稀释成 s o om l 。
测定方法
一 、 标准曲线的绘制 取玻塞量筒 7只 ,
分别精密量取 。 、 0 . 2 0 、 0 . 3 0 、 0 . 4 0 、 0 . 5 0 、
0
.
60
、
o
.
70 m l 牛血清白蛋 白标准液 于各 只
量筒中 , 并用 o . 05 N N a O H 溶液将各 量 伪
内容物的体积补足到恰 为 1 . 0 m l ( 各量筒内
所含牛血清 自 蛋 自分 别 为 O、 2 . 0 、 3 . 0 、
4
.
0
、
5
.
0
、
6
.
0
、
7
.
o m g )
。 于各量筒内准确
加入双缩脉试剂 4 . 0 m l , 摇匀 , 在 35 ℃恒温
水 浴 内 放 置 3 o m i n , 取 出 , l o m i n 后 在
5 4 o n m 波长处 , 以水调零 , 分别测读空白液
及各管标准液的吸收度 , 以各管标准液的吸
收度减去空白液吸收度 , 所得之差值即为标
准液的吸收度 , 然后求出回归方程和相关系
数 (表 1和图 一) 。
A
/ /
/ /
/ /
,
/
兰 」 6 以 川 门 l)
图 1 牛血洁 自蛋 白标准液 曲线
表 1 标准曲线测得数值
标准液 ( m g /m l ) 0 2 . 0 3 . 0 4 . 0 气 . 0 C . O 7 . 0
吸收度 .
去空白后的吸 收度
0
.
0 5 8 0
.
17 5
0
.
1 1 7
0
.
2 3 3
O
。
1 7 5
2 92
2 34
3 4 3
2 9 0
4门4
3委6
0
。
4 巧8
0
。
4 9口
. 为 5 次测定的平均值 . 辛 为空 自液 的吸收度
· 苗 4了 ·
性是比色测定的重要条件 , 我们将同一比色
液每隔 10 m in 测读一次吸收度 , 绘 制 稳 定
曲线如图 2 。
。 一一 - . 一 - - . 一 一 一 一 - - - ~ - 一 . 一一一
~下了一一 ~一鑫一 一六厂一`川护
一ùǔ产一。一ù
l卜厂口二
其回归方程 A = 0 . 0 0 5 2 4 5 + o . 0 5 6 6 9 C
相关系数 Y = 0 . 9 9 9 8
从绘制的标准曲线看 , 最佳测定范围为
2 6m g
。
二 、 样品的测定 精密称取样品适量 ,
月J 0 . 0 5 N 、 N a O H制备成 s m g /m l的测定液 , 精
密测取此液 o . 60 m l (相 当 小 扁 豆 凝 集 素
3m g)
, 按上述测定标准曲线的操作进 行 吸
收度测定 , 求出扣去空白后 的吸收度 , 应用
回归方程计算出样品的含量 。
三 、 主要的实验条件
(一 ) 样品的称取 : 本品疏松 多 孔 、 吸
水性强 , 如干燥后称样 , 在称量过程中很快
引湿 , 导致较大的称量误差 , 因此必须称取
含水样品 , 同时另取一份样品置五氧化二磷
干燥器 中减压干燥至恒重 , 求出水份 , 然后
从称得之样品中扣除水份 。
(二 ) 样品测定液的制备: 本品溶 解 度
随溶剂 p H 值的 不 同 而 异 , p H 7 . 5 以上易
溶 , p H 6 以下难溶 , 因此 , 我们将 样 品 溶
于稀碱洛液 ` }, 。 此碱性液不 影响 本 法 的 测
定 。
(三 ) 比色液的稳定性 : 比色液的 ,稳 定
图 2 比色 液 的 稳定性曲线
一 · 一 · 一 · 一 · 牛血 清白蛋自
` ” ’ “ ` ’ ` ’ …… 小扁豆 凝集素
从图 2 看 , 标准液与样品二者的比色液
稳 定情况是一致的 , 均为 显 色 3 o m in 后 吸
收度即达稳定 , 自此到 70 m in 稳 定 不 变 ,
70 m i n 后 吸收度逐渐降低 , 故此样品显色后
最佳测定时间为 30 m in 后并在 70 m in 前测读
完毕 。
(四 )显色反应所需的温度 : 我们用标准
液 与样品液各一份 , 加入显色剂后 , 分别于
不 同温度放置 3 Om in , 测得的吸收度如表 2 。
表 2 对照液和样品经不同温度 ( ℃ )显色后的比色液的吸收度
一一 , , , 甲朋 .一 , ~ 门. . 胡 , 月一 . . . 亡 -一一 . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 口. , 曰. . . .一 ~一一一 闷. . . . 盆. . . . 闰 ,- .一 . . ~ . . 一~ 加 ~ ~ 刁产 . .一一 一甲 . . . . . . . , . . . . . ~ . . , . 勘2 0 2 5 3 0 3 5 3 7 4 2
牛血 清白蛋 自对照 液
样 品液
0
。
2 8 7
0
。
2 2 8
.
2 9 0
.
2 3 0
.
2筋 0 . 2肠
。
2 3 3 0
.
2 3 4
O
。
2 95
0
.
2 3 3
混浊
混浊
从表 2 看 , 对照品与样品在 30 ~ 37 ℃时
的吸收度均为最高而且稳定 , 而 20 一 25 ℃时
偏低 , 42 ℃时出现混浊无法测定 , 故显色温
度控制在 30 一 37 ℃为宜 。
表 3 小扁豆凝集素的含最测定结果
含重 (% ) 标准差 (肠 ) 变异系数 (% )样 品批号
(三次平 均值 )
0
4
8 1
0
.
8 7
。
3 8
。
8 5
0
。
8 6
0
.
3 7
0
。
8 8…1土nù尸」O0Q`ù11结果与讨论
按上述方法测定小扁豆凝集 素 样 品 三
批 , 侮批重复测定三次 , 其精密度均能符合
比色分析的要求 , 标准差和变异 系 数 均 在
1%以 卜, 结果见表 a3
第 1 0批
第 1 2批
第 1 3批
~一 .一 . 一一 .一一旧. . . . . . . . . . . 口巴 . . . ~ .一 . . . . . ~ . . . . . . . . . . . .函当为检查本法的 ,丁犯程度 , 我们采用了半
微 最凯氏定氮法对上述三批祥品进行了含量
测定 , 以作参考 , 结果见表 4
· 星荃 8.
表 4凯氏定氮法所测含蛋结果
含显 (% )标 准差 (% )
样 品批号
(四 次平均 位 )
变异系数 (% )
第 1 0批
第 1 2批
第 1 3批
9 6
.
(, 2 ( )
.
1 3 0 一【4
9 6
。
9 9 ( )
。
16 0
。
1 6
9 0
.
9 0 0一14 0 . 15
据报道小扁豆凝集素含氮量为 1 6 . 6% ,
亦即每克氮相当 6 . 0 2 4 9 小扁豆凝集素 , 故
表 4内所列数值均为测得的含氮量乘 以 6 . 0 24
所得 。
从 以上测定结果看 , 双缩脉法所测分别
相当对 照 品 牛 血 清 自 蛋 自 的 10 1 . 0% 、
10 2
.
4 %
、
9 5
.
81 %
, 均高于凯氏 定 氮 法 所
测 , 并与由 iS g m a C h e m . C O . 进 口 之小扁豆
凝集素的质量说 明书所列用同法测得的结果
相似 。 结果偏高的原因 , 可能是属结合蛋白
的小扁豆凝集素在结构和组成上与其对照 .钻
牛血清 白蛋白的差异所致 。 用紫外吸收法和
福林一酚试剂法 测 定 的 结 果 偏 高 程 度 更
大 。 凯氏定氮法虽较准确 , 但操作太繁 、 击
时太 长; 双缩脉法简便快速 (需时仅为 定 氮
法的抢 ) 。 耗样量小 , 又因该法 是 基于对蛋
白质肤键的测定 , 受蛋白质特异性影响小 ,
不同于紫外吸收法和福林 一酚试剂法是 基 于
测定蛋白质 中某氨基酸 的 某 种 基 团 , 后者
当样品与对照品所含的被测基团数童之差异
大时 , 则测定误差亦大 ; 因 此 , 对 结 构 复
杂 、 分子量庞大的小扁豆 凝 集 素 而 言 , 用
双缩脉法测其含量 , 尚为一个比较适宜的方
法 。
关键词 小扁豆凝集索 双缩脉法 比
色测定 凯氏定氮法
( 1 9 8 5年8 月 14 日收稿 , 1 9 8 6年 8月 2 5 日修回 )
. 如八 】由月 . . 产、 户灿 润` 川知钾 . .抽 . 、 翻七月、 映 . 阅` .场咬 气卜 闷 . 为七 . 吸产、 勺户知白如产 . 口、 户 勺产勺 ,妇 . 、 . 妇 , 曰、 曰 、 沪 、 . 知产场 . 加, 加 . ` . 加. 侧、 曰、 曰气曰、 . 目 , 沪、 产尹 甘, 俨、 产卜产 ` 闷` .
肛门部的血管配布
( 张东铭 , 等。 中国肛肠 病杂志 1 9 8 6 ; 6 ( 2 ) : 3一 7 )
本文取 30 例成人尸体及 46 例手术 叨除的直肠标本 , 用解音l和血管造影的方法 , 重点观察了肛门部诸 血
管在齿线区的配布。 结果如下 : 1 . 直肠上动脉的分支类型 , 个体差异很大 , 左右二 主支 型 的 出 现 率为
4 9
.
9%
, 其中如 M il es 描述的类型仅占6 % 2 . 直肠上动脉达痔区的终末血管 , 平均有2 . 65 士 0 . 60 簇 , 较多分
布于 皿租心 皿较少 。 3 . 直肠乙状结肠动脉的长降支有 1 9 . 7 %可达痔区 , 其终末血管有 1 . 3 士 0 . 6 簇 较多
分布于 V 、 正 , I 较少 。 4 . 直肠下动脉的出现率为 7 2 . 4 % , 其终末血管有 1 . 8 5 土 0 . 86 簇 , 较多分布于 V 、
卫、 双 , 正、 X较少 。 5 . 月工门动脉有 42 . 1%的前支可达痔区 , 其终末血管有 1 . 8 7 士 0 . 87 簇 , 较多分布于 丁、
租 ; F较少 。
肛门部诸血管尽管在齿线区 配布各异 , 但它们由于相互补充 , 致皮肛门全周的皿甘步J一配 均等 , 川 元 显
着差异 。 因此 , M il e s对痔核好发部位与痔区血管配布有关的说法 , 值得商榷 。
. 、 闷匆 八妇、 . . 、 , . . . 、 , 、 . 、 `怕 . ` 民 . 护 , . 、 ,妇 门知 , . 甸如叫如 , 州、 护、 . 如产、 产知、 了、 . .户 , ,灿 ,州 , . 月. 护、 尸卜 ,勺、 r 、 喻知 气日、 r 、 沪知 .丫 、 , 甲、 `“ . 电、 产、 .咐 , 、 , 、 、 、 . , 砂,甲 丫 、 .、 卢七 , , . 勺, 如, . , 、 产、 角 .户 . 、 、 、 叨呀 曰 , 曰 .护 、 中卜 . , . 加 . … 州、 . , 口 勺、 . 匆 . . , 、 , 丫气抽, ` 官 、 闷
( 上接第 4 4 5 页 )
他各种组织细胞及 良种胚胎库等有重大实用
价值 。
关键词 胎肝 骨髓 保存 降温仪
(感谢本科孟沛霖主任指导与协助 )
参 考 文 献
1
.
W
e l l s J R
, 。 t a ! . A t e e h n i q u e f o r t h e s e P a r -
a t i o n a n d c r y o P r e s e r v a t i o n o f m y
e l o i d s t e m
e e l l` f r o m h u m a n b o n e m a r r o w . C r y o b i o l o g y
1卜) 7 9 , _L6 ( 3 ) : 2 0 1 .
2
.
M
e G a n n L E
, e t a l
.
C r y o P r e s e r v a t i o n o f h u
-
m a n P e r i P h e r a l b l o o d s t e m e e l l s
:
O P t i m a l
e o o l i n g a n d w a r m i n g
e o n d i t i o n s
.
C r y o b i o l o g y
1 9 8 1 ; 1 8 ( 5 )
:
4 6 9
.
3
. 费瑞高 , 等 。 人胎肝造血组细胞的分离 和 保 存 。 中
华血液学杂志 1 9 8 2 , 3 ( 6 ) : 3 3 9 。
4
. 生物降温仪研制小组 。 生 物降温 仪研制鉴 定 资 料 。
l
_海 : 1 ’尽 {。
(上J 5 6 )卜 7 JJ 7 日收 偏 1口邑6 二l二 9 月 2 日修 曰 )