全 文 ：南 方 农 业 学 报
收稿日期：2013-03-22
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻0992021-3）；广西教育厅资助项目（200809MS152）
作者简介：*为通讯作者，禤维言（1963-），博士，副教授，主要从事作物化学调控、植物细胞工程和基因工程研究工作，E-mail：
xuanweiyan_1@163.com。王磊（1988-），研究方向为植物生理生化和分子生物学，E-mail：wanglei671561@126.com
石栗accD基因全长cDNA的克隆及序列分析
王 磊，禤维言*，张 艳，冯 斗，刘紫戈
（广西大学 农学院，南宁 530005）
摘要：【目的】克隆石栗幼嫩叶片accD基因的全长cDNA序列，为今后利用该基因和提高油料作物种子含油量提供
参考。【方法】根据已知植物麻疯树、蓖麻等accD基因的保守区域设计简并引物，以石栗幼嫩叶片为材料，利用简并
PCR和RACE技术克隆accD基因的全长cDNA序列，扩增其编码序列。【结果】扩增获得的石栗accD基因全长cDNA序
列长1789 bp，包含1509 bp的开放阅读框，可编码503个氨基酸，GenBank登录号为KC255250，并命名为amaccD。石栗
accD基因序列经BLASTx比对后，发现其与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树氨基酸序列的同源性分别为90%、90%和89%。
【结论】克隆获得的石栗accD基因全长cDNA序列与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树等具有较高同源性。
关键词：石栗；乙酰辅酶A羧化酶；accD基因；克隆；序列分析
中图分类号：S794.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2013）10-1602-05
0 引言
【研究意义】石栗（Aleurites moluccana L.）属于大
戟科石栗属多年生木本油料植物，又名烛果树、黑桐
油树，是一种野生的阔叶常绿乔木（刘昌盛等，2008）。
石栗果仁油脂含量高于一般的油料植物，如花生
（Arachis hypogaea）、油菜（Brassica campestris L.）、蓖
麻（Ricinus communis）、油茶（Camellia oleifera）等，是
具有极大发展潜力的生物柴油树种。乙酰辅酶A羧化
酶（ACCase）是脂肪酸生物合成的限速酶（王伏林等，
2011）和关键酶（任波和李毅，2005），是碳流进入脂肪
酸生物合成途径的重要调控位点。Gengenbach等
（2001）发现在早期种子发育过程中，ACCase基因表达
Cloning and analysis of full length cDNA sequence of accD gene
from Aleurites moluccana
WANGLei，XUANWei-yan*，ZHANGYan，FENGDou，LIUZi-ge
（Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530005，China）
Abstract：【Objective】The full length cDNA sequence of accD gene of acetyl coenzyme A carboxylase （ACCase） β-CT
subunit from Aleurites moluccana tender leaves was cloned to provide references for using this kind of gene and improving
the oil content of oil-bearing crops seeds. 【Method】Degenerate primers were designed based on the conserved region
of known accD gene of plants， such as Jatropha curcas and Ricinus communis. Tender leaves of Aleurites moluccana were
used as the materials. PCR and RACE technology were used to clone and amplify the full length cDNA sequence of accD
gene. 【Result】We obtained a 1789 bp sequence of full length cDNA of accD gene， which contained 1509 bp open reading
frame and could encode 503 amino acids. The accession number of GenBank was KC255250， which was named as amac-
cD. The results of BLASTx comparison showed that the homlolgy of the amino acid sequence among accD gene of Aleurites
moluccana and the known homologous plants Hevea brasiliensis， Ricinus communis and Jatropha curcas was 90%， 90%
and 89%， respectively. 【Conclusion】The full length sequence of accD gene in Aleurites moluccana had high homology with
Hevea brasiliensis， Ricinus communis and Jatropha curcas.
Key words： Aleurites moluccana； ACCase； accD gene； cloning； sequence analysis
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2013.10.1602
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2013，44（10）：1602-1606
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.cn
量的增加与种子成熟时含油总量的增加具有相关性。
accD是定位于叶绿体或质体基因组上的基因（Kode et
al.，2005），其编码产物是ACCase中的β-CT亚基；accD
的表达水平与ACCase活性和油脂的合成积累密切相
关。分离石栗accD的编码序列是研究该基因功能和进
行SNP分析的前提和基础，对今后该基因的利用和提
高油料作物种子含油量具有重要参考价值。【前人研
究进展】ACCase是植物油脂合成过程中具有重要调
控作用的调节酶之一。异质型ACCase由BC、BCCP、
α-CT和β-CT等4个亚基组成，其中β-CT亚基是ACCase
活性的限制因子，其编码基因accD表达水平的高低，
与植物油脂的形成、积累密切相关，且对植物叶片的
生长有正调控作用（Sasaki and Nagano，2004；Kode
et al.，2005；Hu et al.，2009；Gu et al.，2011）。目前，已
有多种植物如豌豆、大豆、拟南芥、油菜、棉花、麻疯
树、甘蓝等的accD基因被分离和克隆（Sasaki et al.，
1993；Reverdatto et al.，1999；武玉永等，2004；戴晓峰等，
2007；王伏林等，2008；张煜星，2009；Gu et al.，2011；
Zeng et al.，2012）。【本研究切入点】目前，关于石栗的
研究主要集中于生理生化等方面，尚未见有关石栗ac-
cD基因全长cDNA序列克隆的报道。【拟解决的关键问
题】以石栗嫩叶片为材料，在GenBank中找到已注册且
具有高度同源性的植物accD基因的氨基酸序列设计
简并引物，采用同源克隆与RACE技术克隆accD基因
全长cDNA序列，并对其序列进行生物信息学分析，为
研究该基因的生物学功能提供依据。
1 材料与方法
1.1试验材料
供试材料为广西大学校园内多年生石栗树，采集石
栗嫩叶置于-80℃冰箱保存备用。
主要生化试剂及酶类:克隆载体pUCm-T、质粒快
速提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒、Taq DNA聚合酶、
dNTPs、DNA分子量参照物（Marker）均购自生工生物
工程（上海）服务有限公司，引物合成和测序也由生工
生物工程（上海）服务有限公司完成；RACE试剂盒
（CAT#:101105-10）购自北京天恩泽基因科技有限公
司；逆转录试剂盒（#K1621，#K1622）购自Fermentas公
司；宿主菌大肠杆菌DH5α由广西大学农学院保存。
1.2试验方法
1. 2. 1 石栗总DNA和总RNA的提取 以石栗嫩叶为材
料，采用CTAB法提取总DNA，RNA提取按刘洋等
（2006）的方法进行。获得的总DNA和总RNA用1.2%琼脂
糖凝胶电泳（缓冲液1×TAE，DNA染料EB）进行检测，并
用凝胶成像系统进行拍照，或用微量分光光度计测OD
值，检测总DNA的质量和总RNA的完整性。使用
DNA/RNA酶分别对总DNA和总RNA进行消化，便于
后续试验的顺利进行。
1. 2. 2 石栗accD基因中间片段的克隆 根据具有高
度同源性的多种近缘植物accD基因的氨基酸序列（麻
疯树ADN52611、蓖麻AEJ82564、山茶ACS14664、花生
ACX69849和陆地棉ABU53028），利用CODEHOP在线
软件设计1对简并引物accD1（5-CGTTGGTGTCAATG
CGAAAAYTGYTAYGG-3）和accD2（5-GCAGAAGA
AATCTTAGCCATYTGCATNA-3）。以石栗叶片总
DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（20.0 μL）：
10×PCR Buffer（含Mg2+）2.0 μL；2.5× dNTP 1.0 μL，
10 μmol/L accD1 0.5 μL，10 μmol/L accD2 0.5 μL，模
板DNA 0.5 μL，ddH2O 15.3 μL，Taq DNA聚合酶 0.2
μL（最后加入）。PCR反应程序：95 ℃预变性 5 min；95
℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，进行35个循环；72 ℃ 7
min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回
收试剂盒回收目的片段，然后与pUCm-T连接，转化大
肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，并对阳性克隆进行
PCR鉴定，选取PCR阳性克隆进行测序，将所得片段序
列进行BLASTx比对分析，确定所获得片段是否为目
的基因片段，目的基因片段的连接和重组质粒的转化
及筛选参照试剂盒说明进行操作。
1. 2. 3 石栗accD基因5末端RACE扩增 根据石栗
accD中间片段序列设计3个5RACE特异引物：accD5
GSP1（5-CGAGTGATTTTCTCCCCT-3）、accD5GSP2
（5-TGCCGTTTAGTTGACCTGTGC-3）和accD5GSP3
（5-TGTCTTCATCCATAGAATCCC-3）。5RACE反应
按照5RACE试剂盒说明进行。扩增产物电泳，回收目的
片段并连接到pUCm-T载体上，然后转化大肠杆菌，筛选
鉴定阳性克隆，并进行测序。第一轮PCR反应条件为：第1
次循环为94℃ 5 min，51℃ 2 min，72℃ 4 min；第2~30
次循环为94℃ 40 s，56℃ 1 min，72℃ 3 min；最后72℃延
伸 15 min。第二轮PCR反应条件为：第1~30次循环：94℃
40 s，56℃ 1 min，72℃ 3 min；最后72℃延伸15 min。
由于5RACE第一次延伸未达到起码密码子ATG位
置，故将5RACE第一次延伸片段长度、中间简并目的片
段长度和3RACE延伸片段长度拼接之后，根据获得的
序列设计引物：accD5GSPA（5-TGCCGTTTAGTTGA
CCTG-3）、accD5GSPB（5-ATCCATAGAATCCCAAG
TGCC-3）和accD5GSPC（5-CAATACAGACTTGAGA
GCGAA-3），进行第二次5RACE扩增，继续向5末端延
伸，直至延伸到起始密码子位置为止，其方法和操作步
骤与第一次5RACE扩增相同。
1. 2. 4 石栗accD基因3末端RACE扩增 根据石栗
accD中间片段序列设计两个 3RACE特异引物：
王磊等：石栗accD基因全长cDNA的克隆及序列分析 1603· ·
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accD3GSP1（5-GTCAACTAAACGGCATTCCC-3）和
accD3GSP2（5-CTTATTTTAGTGTGTGCTTCCG-3）。
3RACE反应按照3RACE试剂盒说明进行，将获得的扩
增产物连接到pUCm-T载体上，连接产物转化大肠杆菌，
筛选鉴定阳性克隆，并进行测序。第一轮PCR反应条件
为：第1次循环 55℃ 2 min，72℃ 40 min；第2~30次循环：
94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 3 min；最后72℃延伸15
min。第二轮PCR反应条件为：第1~30次循环 94 ℃
1 min，56℃ 1 min，72℃ 3 min；最后72℃延伸15 min。
1. 2. 5 RACE测序结果分析 根据测序结果用
Vector-NTI软件进行序列比对，将所得片段长度分别
拼接后置于NCBI在线软件进行分析，其中含有3个重
叠区，最终获得石栗ACCase中β亚基accD基因全长
cDNA序列。
2 结果与分析
2. 1石栗accD基因中间片段的克隆分析
以石栗幼嫩叶片的总DNA为模板，用引物accD1
和accD2进行PCR扩增，获得约500 bp的特异片段（图
1-a）。目的基因片段经过连接、转化、重组子鉴定及测
序结果比对，得到492 bp的中间目的片段，通过
BLASTx分析，结果显示该序列与蓖麻、麻疯树等均含
有较高的同源性（95%和94%），由此可初步判定其为
石栗幼嫩叶片accD基因的一个中间目的片段。
2. 2石栗accD基因中间片段的RACE扩增结果
2. 2. 1 石栗accD基因的5RACE扩增 以石栗总
RNA为模板，对accD基因的5末端进行两次RACE扩
增，分别获得两个长度约400（图1-b）和500 bp的目标
片段（图1-c），经测序后这两个片段的长度分别为407
和475 bp。
2. 2. 2 石栗accD基因的3RACE扩增结果 以石栗
总RNA为模板，对accD的3末端进行RACE扩增，获得
一个长约600 bp的目的片段（图1-d），测序后该片段的
长度为619 bp。
通过BLASTx对比分析，发现该序列与麻疯树、蓖
麻等均具有较高的同源性，由此可初步判定其为石栗
幼嫩叶片accD编码基因的一个片段，且延伸达到终止
密码子（TAA）位置。
图 1 石栗accD基因片段扩增结果
Fig.1 Amplified results of accD gene segments in Aleurites moluccana L.
M：Marker；a：accD基因简并引物PCR扩增结果；b：第1次5RACE扩增结果；c：第2次5RACE扩增结果；d：3RACE扩增结果
M：Marker；a：PCR amplified result of degenerate primers；b：The 1st 5RACE amplified results；c：The 2nd 5RACE amplified results；d：3RACE amplified
results
2. 3石栗accD基因全长编码序列的拼接和分析
将获得的石栗幼嫩叶片accD基因中间目的片段、
5RACE两次延伸片段和3RACE延伸片段进行拼接
后，获得了accD基因全长cDNA序列，将其命名为
amaccD，大小长度为1789 bp（图2），5非翻译区为50 bp，
3非翻译区为227 bp，编码区长度为1512 bp，编码503
个氨基酸。石栗accD基因序列经BLASTx比对分析，发
现其与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树的氨基酸序列同
源性分别为90%、90%和89%。该基因在NCBI上的登
陆号为KC255250。
M 1 2
500 bp
400 bp 492 bp
M 1 2 3 4
500 bp
400 bp 475 bp
M 1 2 3 4
500 bp
400 bp 407 bp
M 1 2 3 4
600 bp
500 bp
619 bp
1000 bp
a b
d
c
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图 2 石栗accD基因的全长cDNA序列及其推导氨基酸序列
Fig.2 Full length of cDNA sequence and deduced amino acid sequence of accD gene from Aleurites moluccana
3 讨论
在叶绿体中，转录后β-CT亚基的RNA编辑对AC-
Case功能的影响是目前研究的热点之一（Sasaki et al.，
2001）。RNA编辑是一个创造起始和终止密码并改变
编码序列的加工过程，一般是在三联体的第2个核苷
酸位置上胞嘧啶转变为尿嘧啶（Sugiura et al.，1998）。
15种陆生植物的accD基因推导氨基酸序列比对结果
表明，其中6种植物产生了相似的变化；这些植物本来
在相应位置没有亮氨酸密码子，而RNA编辑的结果制
造了亮氨酸密码子；通过研究证明，在特定位置上需
要一个亮氨酸密码子，accD编辑对有些植物是必需的
（Sasaki et al.，2001）。由此比较编辑和未编辑的重组
酶CT的活力，发现编辑后的酶具有活力，而未编辑的
酶没有活力。
也有研究认为，由质体编码的accD基因是四亚基
复合酶活性的限制因子，即质体中过量表达异质型
ACCase的accD基因，极有可能实现脂肪酸合成数量
的控制（王伏林等，2011）。Madoka等（2002）通过研
究发现，在烟草质体中过量表达异质型ACCase的accD
基因，其酶活性水平大幅度提高，脂肪酸的含量也随
之增加，说明质体accD基因的过量表达在提高作物含
油量中发挥重要的作用。
鉴于质体中异质型ACCase的重要性，许多植物
（麻疯树、蓖麻、油茶、花生和陆地棉等）ACCase中
β-CT亚基的accD基因全长cDNA序列已有报道，但关
于石栗accD基因的克隆研究未见报道。本研究采用同
源克隆方法成功分离获得accD的中间片段，该片段长
度与预期长度相一致，主要是因accD是叶绿体或质体
基因组基因，具有原核生物基因的特点，即不含有内
含子序列，这是与分离其他真核生物基因的主要区别。
同源克隆和RACE技术相结合分离目的基因全长
编码序列，因具有操作简便、快捷、廉价等优点而被广
泛应用，已成为克隆蛋白质编码基因全长编码序列的
常用方法。同源克隆通常是根据目的基因编码产物的
保守氨基酸序列设计简并引物，进行RT-PCR扩增，获
取目标片段，再用RACE技术扩增目的基因的两个末
端即可获得全长编码序列。本研究以石栗总DNA为模
板，通过同源克隆和RACE技术相结合的方法，成功克
王磊等：石栗accD基因全长cDNA的克隆及序列分析 1605· ·
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隆获得石栗accD基因全长编码序列，该基因与巴西橡
胶树、麻疯树和蓖麻的accD序列同源性高达89%~
90%。本研究结果对今后该基因的利用和提高油料作
物种子含油量具有重要参考价值。
4 结论
本研究采用同源克隆法结合RACE技术克隆得到
石栗幼嫩叶片ACCase中β-CT亚基的accD基因全长
cDNA序列，大小长度为1789 bp，与巴西橡胶树、蓖麻
和麻疯树等具有较高的同源性。
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