全 文 ：作者简介:李忠红 , 博士 , 副主任药师;研究方向:药物分析;Tel:(025)83307598;E-mail:liz hh402@sohu.com
HPLC法测定硝酸一叶萩碱注射液的有关物质及含量
李忠红 , 黄秀梅1 , 童维佳2 , 蔡美明 , 樊夏雷 (江苏省食品药品检验所 , 南京　210008;
　1 青海省药品检验所;　2南京医科大学)
摘要:　目的 建立测定硝酸一叶萩碱注射液的有关物质及含量测定的高效液相色谱法 。方法 色谱柱 VP-
ODS , 流动相为甲醇-40mmol·L-1乙酸铵溶液 (45∶55), 流速 1.0 mL ·min-1 , 检测波长 256nm 。结果
一叶萩碱经强酸 、强碱 、 高温 、氧化等剧烈条件破坏 , 所产生的降解产物峰与一叶萩碱峰能很好地分离。
在 3.2 ～ 3200μg ·mL-1浓度范围内具有良好的线性关系 , r=0.9999 (n =7)。含量测定平均回收率为
99.0%(n=9), RSD为 0.5%。结论 该方法可用于硝酸一叶萩碱注射液的质量控制 。
关键词:　硝酸一叶萩碱注射液;HPLC
中图分类号:R917;R927.2　　文献标识码:A 　　文章编号:1002-7777 (2009)09-0917-03
Determination of Securinine Nitrate Injection by HPLC
Li Zhonghong , Huang Xiumei1 , Tong Wei jia2 , Cai M eiming and Fan Xialei(Jiang su Insti tute fo r Food and
Drug Contro l ,Nanjing 210008;1Qinghai Institute fo r Drug Control;2Nanjing M edical University)
ABSTRACT:　Objective To establish a HPLC me thod fo r determination o f related substances and assay of
Securinine Ni trate Injection.Methods The separation w as perfo rmed on a VP-ODS column with a mobile
phase o f methanol-40mmol·L-1 ammonium acetate so lution (45∶55).The f low rate w as 1.0mL ·min-1 ,
and the detecting w aveleng th w as 256nm.Results The degradat ion peaks produced by dest ro ying securinine
wi th st rong acid , alkali , high temperature and oxidation respectively could be w el l separated f rom that of
securinine by this method.The linear range w as 3.2 ～ 3200μg · mL-1 , r =0.9999(n =7).The mean
recovery of the assay w as 99.0%(n=9)and RSD was 0.5%.Conclusions T he method can be used in the
quali ty cont rol of securinine nit rate injection.
KEYWORDS:　Securinine Ni trate Injection;HPLC
　　一叶萩碱 (Securinine)系自大戟科植物一叶
萩 (叶底珠) [ Securinega su f f rut icosa (Pall.)
Rehd.] 叶中分离得的一种生物碱[ 1-2] 。一叶萩碱
和硝酸一叶萩碱注射液标准均收录于 《卫生部药品
标准》 第一册 , 一叶秋碱质量标准中采用薄层色谱
法对其他生物碱进行控制 , 而硝酸一叶萩碱注射液
未再进行有关物质的控制 。对于硝酸一叶萩碱注射
液的有关物质考察及其方法笔者均未见文献报道 。
本文建立了适宜的 HPLC 法 , 对硝酸一叶萩碱注
射液的有关物质和含量进行了考察 。
1　仪器和材料
Agilent 1100高效液相色谱仪 , 二极管阵列检
测器 (DAD)。硝酸一叶萩碱注射液 (批号:
0704241 , 0601141 , 规格:2mL ∶8mg)和一叶萩
碱对照品 (批号:070105 , 含量 98.6%, HPLC
归一化法测定)(江苏鹏鹞药业有限公司);甲醇和
乙腈为色谱纯 , 水为 Mil li-Q 纯化水 , 其余试剂均
为分析纯。
2　方法和结果
2.1　有关物质检查
2.1.1　色谱条件 　色谱柱 VP-ODS (4.6mm ×
250mm);流动相:甲醇-40mmol ·L-1乙酸铵溶液
(45 ∶ 55), 流 速 1.0mL · min-1 ;检测 波长
256nm;进样量 10μL;柱温为 25℃;理论板数按
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DOI :10.16153/j.1002-7777.2009.09.017
一叶萩碱峰计算为 11000 , 各杂质峰与主峰的分离
度均大于 1.5。
2.1.2　专属性试验　由于硝酸一叶萩碱注射液为
一叶萩碱加硝酸适量制成的灭菌水溶液 , 因此加速
破坏试验取原料药一叶萩碱进行试验 。 ①酸破坏:
称取一叶萩碱对照品约 0.4g , 置 250mL 碘瓶中 ,
加 0.1mol · L-1 HCl 溶液 100mL , 水浴加热 1h ,
放冷 , 加氢氧化钠试液调节 pH 至约 6.0。 ②碱破
坏:称取一叶萩碱对照品约 0.4g , 置 250mL 碘瓶
中 , 加0.1mol·L-1 N aOH 溶液 100mL , 水浴加热
1h , 放冷 , 加盐酸试液调节 pH 至约 6.0。 ③加热
破坏:称取一叶萩碱对照品约 0.4g , 置 250mL 碘
瓶中 , 加水 100mL , 水浴加热 1h , 放冷 , 滴加稀
硝酸使一叶萩碱恰好完全溶解 。④氧化破坏:称取
一叶萩碱对照品约 0.4g , 置 250mL 碘瓶中 , 加双
氧水 2mL , 加水 98mL , 水浴加热 1h , 放冷 。各
溶液均进样 10μL 试验 , 结果见图 1 。
a.酸破坏;b.碱破坏;c.高热破坏;d.氧化破坏;1.一叶萩碱峰。
图 1　专属性试验 H PLC 色谱图
　　试验结果表明 , 此液相色谱条件能够将一叶萩
碱在强酸 、强碱 、高温 、 氧化等剧烈条件下破坏产
生的降解产物峰与一叶萩碱峰很好地分开 , 结果还
显示本品对热和酸相对稳定 , 对碱 、氧化破坏均不
稳定 。
2.1.3　辅料的干扰试验　在选定的流动相系统中 ,
已知辅料聚山梨酯 80和氯化钠对试验结果均没有
干扰 。
2.1.4　供试品有关物质的考察　精密吸取硝酸一
叶萩碱注射液 1mL , 置 10mL 量瓶中 , 加流动相
稀释至刻度 , 摇匀 , 作为供试品溶液;再精密吸取
上述溶液 1mL , 置 100mL 量瓶中 , 加流动相稀释
至刻度 , 摇匀 , 作为对照溶液 。精密量取上述 2种
溶液各 10μL , 注入液相色谱仪试验 , 供试品溶液
记录色谱图至主峰保留时间的 2倍 。对 2批样品的
考察结果显示 , 单个杂质分别为1.0%和0.3% , 均
未超过 1.0%;杂质总量分别为 1.4%和 0.6%, 均
未超过 1.5%。图2为供试品有关物质检查色谱图。
1.一叶萩碱峰。
图 2　供试品有关物质 H PLC 图谱
2.2　含量测定
2.2.1　色谱条件　同有关物质检查 。
2.2.2　线性关系考察　取一叶萩碱对照品 0.32g ,
精密称定 , 加流动相溶解并稀释至 100mL;精密
量取此溶液适量 , 分别用流动相稀释制成每 1mL中
含 3.2 , 6.4 , 16.2 , 32.4 , 64.8 , 161.8 , 3200μg ·
mL-1的溶液 , 精密量取10μL 注入液相色谱仪 , 记录
色谱图;以峰面积对浓度进行回归 , 得回归方程:
A=3.604×10C+2.6686×102 　r=0.9999
样品溶液在 3.2 ～ 3200μg ·mL-1浓度范围内具有良
好的线性关系。
2.2.3　检测限与定量限　取线性试验中浓度最低
的对照品溶液进行逐级稀释 , 再分别精密量取
10μL 注入液相色谱仪 , 记录色谱图;以信噪比
3∶1确定本法检测限为 0.1μg · mL-1 , 以信噪比
10∶1确定本法定量限为 0.3μg ·mL-1 。
2.2.4　回收率试验　取一叶萩碱对照品 25 , 31 ,
37mg 各 3份 , 精密称定 , 加流动相溶解并稀释至
100mL;分别精密量取对照品溶液 10mL 和已测定
含量的硝酸一叶萩碱样品溶液 1mL , 置 200mL 量
瓶 , 用流动相稀释至刻度 , 作为供试品溶液 , 照含
量测定方法测定 , 计算回收率 , 结果见表 1 。
表 1　回收率试验结果
对照品加入
量(μg·mL-1)
样品加入量
(μg·mL-1)
测得量
(μg·mL-1)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
12.291 15.039 27.129 98.37
12.330 15.039 27.154 98.26
12.315 15.039 27.306 99.61
15.154 15.039 30.034 98.95
15.193 15.039 30.135 99.36 99.0 0.5
15.277 15.039 30.154 98.94
18.239 15.039 33.138 99.23
18.278 15.039 33.191 99.31
18.185 15.039 33.078 99.20
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2.2.5　精密度试验　取同一批样品 , 重复测定 6
次 , 记录峰面积 , 计算含量 , 测定结果的 RSD 为
0.4%。
2.2.6　稳定性试验　含量测定项下的供试品溶液 ,
室温放置 12h后再次进样 , 结果基本不变 。
2.2.7　样品含量测定 　精密量取本品 2mL , 置
20mL 量瓶中 , 用流动相稀释至刻度 , 摇匀 , 精密
量取 10μL 注入液相色谱仪 , 记录色谱图;另取一
叶萩碱对照品适量 , 精密称定 , 加流动相溶解并定
量稀释制成每 1mL 中约含 31μg 的溶液 , 同法测
定 , 按外标法以峰面积计算 , 并将结果乘以
1.2900 , 结果:批号为 0601141 , 含量为 100.9%;
批号为 0704241 , 含量为 97.0%。
3　讨论
3.1　色谱条件的建立
原料药一叶萩碱质量标准中有其他生物碱检查
项 , 方法为薄层色谱法。经试验 , 硝酸一叶萩碱注
射液直接点样展开后主斑点呈现为 2个 , 因此薄层
色谱法无法直接应用于硝酸一叶萩碱注射液的有关
物质检查;文献报道对一叶萩碱的检测方法有比色
法 、 高效毛细管电泳法 、 气相色谱和气相色谱-质
谱联用法[ 3-4] 等 , 未见这些方法应用于一叶萩碱及
硝酸一叶萩碱注射液的有关物质检测文献报道。本
文建立了适宜的 HPLC 方法来进行注射液的有关
物质检查 。
一叶萩碱和硝酸一叶萩碱注射液均未见有
HPLC 测定的方法报道。对于生物碱类样品的
HPLC测定 , 固定相多采用 C18柱 , 流动相中有机
相为甲醇或乙腈 , 水相一般会含有一定浓度的缓冲
盐 、 具有适宜的 pH , 或含有离子对试剂 , 或含有
三乙胺 、乙二胺或二丁胺等试剂[ 5-11] 。有机相与水
相以一定比例混合组成流动相 。本文在 HPLC 条
件建立过程中 , 固定相采用 C18柱 , 试验了 4 种流
动相:①甲醇-20mmol · L-1磷酸二氢钾溶液 (每
1000mL 含三乙胺 1.4mL , 用磷酸调节 pH 至 3.1)
(10∶90), ②甲醇-40mmol·L-1乙酸铵溶液 (50∶
50), ③甲醇-乙腈-水 (6∶1∶3), ④乙腈-水-三乙
胺 (25∶74∶1), 用冰醋酸调节 pH 至 7.0。
试验结果显示在比例较高的有机相存在的情况
下 , 水相中不添加缓冲盐或胺类试剂一叶萩碱也可
出峰 , 但峰形拖尾相对较严重 , 流动相中添加缓冲
盐或胺类试剂均可改善峰形 , 已能满足试验的要
求 , 因此未再试验流动相中添加离子对试剂对峰形
的影响。
试验结果还显示流动相的 pH 对一叶萩碱的色
谱保留时间有较大的影响 , 因而选用缓冲盐溶液以
调节流动相的 pH 。通过使用 3种不同牌号的色谱
柱 , 考察 2种不同流动相缓冲盐类型 、 流动相 pH
对各种加速破坏样品中杂质峰与主峰分离度的影
响 , 结果显示流动相②的色谱系统条件下 , 杂质与
主峰分离度均达到良好分离 , 色谱系统条件具有更
好的通用性 , 故选择了流动相②进行注射液的有关
物质和含量测定检查 , 实验过程中对有机相和水相
的比例进行了适当地调整 , 最终确定流动相为甲醇
-40mmol·L-1乙酸铵溶液 (45∶55)。
3.2 　测定波长的选择
经试验 , 在选定的色谱分离条件下 , 一叶萩碱
峰的最大吸收波长为 256nm , 各加速降解出的有
关物质以及注射液中检出的有关物质的最大吸收波
长为 252 ～ 260nm , 因此将 256nm作为测定波长。
现行标准中硝酸一叶萩碱注射液的含量测定方
法为分光光度法中的吸收系数法 , HPLC 法与其相
比具有更好的专属性。本文所建立的色谱方法不仅
具有良好峰形 , 且流动相组成较为简单 , 适用于硝
酸一叶萩碱注射液的有关物质检测及含量测定 。
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