全 文 ：吕庆银，赵 伟，李 岑，等． 臭常山理化特征及其脂溶性生物碱的提取工艺［J］． 江苏农业科学，2016，44(1):279 － 282．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 01． 083
臭常山理化特征及其脂溶性生物碱的提取工艺
吕庆银1，赵 伟1，李 岑2，李 雄1，张 振2
(1．贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025;2．贵州理工学院制药工程学院，贵州贵阳 550025)
摘要:先对臭常山的水分、总灰分、醇浸出物及其 TLC、HPLC指纹图谱进行研究，明晰试验药料的理化特征，然后
采用超声波辅助乙醇提取法对臭常山脂溶性生物碱的提取工艺进行正交优化。结果表明，本试验材料臭常山的水分、
醇溶性浸出物、总灰分含量分别为 8． 21%、6． 22%、6． 20%;在单因素的基础上，正交试验确定的最佳提取工艺条件为
臭常山粗粉 400 g，料液比 1 g ∶ 20 mL，65% 乙醇超声提取 80 min /次，超声提取 3 次，脂溶性生物碱的提取率为
0． 385%。
关键词:臭常山;指纹图谱;脂溶性生物碱;正交试验
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)01 － 0279 － 04
收稿日期:2015 － 07 － 10
基金项目:贵州省科技项目(编号:黔科合 J 字［2011］3004);中国科
学院 2013 年度“西部之光”人才培养计划。
作者简介:吕庆银(1989—)，男，湖北孝感人，硕士研究生，主要从事
天然产物方面的研究。E － mail:nihao_xiaolv@ 163． com。
通信作者:张 振(1972—)，博士，教授，主要从事天然产物方面的研
究。E － mail:zhangzhen@ git． edu． cn。
芸香科(Ｒutaceae)臭常山属臭常山(Orixa japonica
Thunb．)，别称日本常山、臭山羊，其主要化学成分为香豆素
和喹啉类生物碱。目前关于其研究主要集中在所含化学成分
方面［1］，现从臭常山的根、茎、叶等部位分离到的已知喹啉类
生物碱有:常山碱、香草木碱、茵芋碱、月芸香酮碱、香草木碱、
去甲和常山碱、加锡弥罗果碱、花椒毒素等［2 － 4］。试验前期研
究发现，这些化学成分中的一些喹啉类脂溶性生物碱具有抗
肺炎克雷伯氏杆菌及金黄色葡萄球菌等抑菌活性［5］。作为
贵州民间中药材，常用来治疗风热感冒、咳嗽、风湿关节痛等
病症［6］，其理化特征和提取工艺方面的研究未见国内外文献
报道。为富集其有效成分，在对试验臭常山理化特征进行研
究后，进行有效成分的提取分离工艺研究，以期明确试验材料
的理化特征，并获得脂溶性生物碱的最佳提取工艺途径，为推
进臭常山中药现代化研究提供一定的理论基础。
1 试验材料
1． 1 材料与试剂
新鲜植物整株经贵州大学苟光前教授鉴定为芸香科植物
臭常山(Orixa japonica Thunb．);色谱乙腈及色谱甲醇(美国
天地公司)、超纯水(浙江杭州哇哈哈集团有限公司);蒸馏
水;其余试剂均为分析纯。
1． 2 仪器和设备
UltiMateTM 3000 DGLC 双三元液相色谱仪，富集柱(Ther-
mo Fisher HyperSep Ｒetain － CX，20 mm ×3． 0 mm)，DAD检测
器，分析柱(Acclaim 120 PAⅡ，C18，5 μm，4． 6 mm ×250 mm)，
以上均为美国 Thermo Fisher Scientific 公司产品;变色龙 7． 2
工作站;SPJX － 4 － 10 型高温箱式电阻炉(上海锦昱科学仪器
有限公司);WT5001 电子天平(江苏常州万泰天平仪器有限
公司);ES － E210B电子分析天平(河南郑州南北仪器设备有
限公司);洁康 PS － 100A 超声波清洗机(广东东莞市洁康超
声波设备有限公司);SHZ － D(Ш )型循环水式真空泵、ＲE －
501升降恒温水浴锅、ＲE －501型旋转蒸发器及 DLSB －10 /20 ℃
型低温冷却循环泵(均为上海鹰迪仪器设备有限公司);
GF254 硅胶板(山东青岛海洋化工厂)，ZF － 2 型三用紫外仪
(上海市安亭电子仪器厂)。
2 试验方法
2． 1 材料预处理
将新鲜的臭常山整株截短、洗净，然后晾干、粉碎，自然风
干后备用。
2． 2 臭常山水分、总灰分、醇浸出物的测定
水分含量测定采用中国药典一部附录Ⅸ H 水分测定法
项下的烘干法［7］;醇浸出物测定采用药典一部附录 X A 项下
醇提取物热浸法［7］;灰分测定采用药典附录Ⅸ K 项下的总灰
分测定法［7］。
2． 3 TLC指纹图谱
准确称取臭常山全株粗粉 100 g，以 1 g ∶ 5 mL的料液比
加入 70%乙醇，超声提取 30 min，过滤，浓缩，吸取少许浓缩
液点于硅胶 GF254 板，以石油醚:丙酮 = 8 ∶ 2 为展开剂，展
开，晾干，于紫外灯(257． 5 nm)下检视。
2． 4 HPLC指纹图谱
2． 4． 1 测试样品制备 准确称取过二号筛的臭常山粉末
2． 408 9 g，加 70%乙醇 60 mL置 250 mL锥形瓶中，密塞称定
质量，静置 1 h，然后连接回流冷凝管，并保持微沸 1 h，放冷
后，取下锥形瓶，密塞，再称定质量，用 70%乙醇补足减失的
质量，摇匀，用干燥过滤器过滤，取滤液过 0． 45 μm 针头过滤
器，即得测试样品。
2． 4． 2 对照品制备 分别精确称取月芸香酮碱、香草木碱
(实验室自制，纯度 ＞ 95%)，加入甲醇后制成 100 μg /mL 的
对照品溶液。
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2． 4． 3 色谱条件 色谱柱为 C18(250 mm × 4． 6 mm，5 μm)，
流动相为乙腈 －水(体积比 1 ∶ 1)，体积流量 1． 00 mL/min，进样
量 20 μL，柱温 30 ℃，检测波长 266 nm。
2． 5 脂溶性生物碱的制备及定量测定
(1)醇粗提物提取。准确称取臭常山粗粉 400 g，4 层纱
布包裹，按试验所需的浓度和料液比加入乙醇进行超声提取，
然后过滤，滤渣进行重复提取，滤液浓缩成浸膏，干燥，即得粗
提物。(2)脂溶性生物碱的制备和测定。取适量的 2% HCl
溶解上述浸膏，滤清酸水，等体积的乙酸乙酯萃取酸水 3 次，
弃去乙酸乙酯层，25%氨水调节 pH 值为 9 ～ 10，等体积氯仿
萃取 3 次，合并氯仿层，浓缩，回收氯仿，残留物即为脂溶性生
物碱［8］，干燥，称质量。
2． 6 脂溶性生物碱的定性检测
生物碱的定性鉴定方法有很多［8 － 9］，本试验采用碘化铋
钾显色法［10］和薄层色谱法［8］，具体方法如下:(1)取“2． 5”节
下制得的脂溶性生物碱 3 ～ 5 mg，适量氯仿溶解;(2)毛细吸
管吸取上述溶液点于硅胶 GF254 板上;(3)以石油醚 －丙酮
(8 ∶ 2)为展开剂展开，取出，晾干，紫外灯(257． 5 nm)下检
视;(4)喷碘化铋钾显色液，晾干，日光下观察;日光下有多个
橘黄色或橙色斑点，紫外灯下有多个荧光亮点，即可判断酸碱
处理结合溶剂萃取后得到的是脂溶性生物碱［8］。
3 结果与分析
3． 1 试验用臭常山的水分、总灰分、醇浸出物含量比较
由表 1 可知，本试验用臭常山的 7 次测试样品中，最高水
分含量和最低水分含量相差 0． 07 百分点，两者相差不到 0． 1
百分点，表明水分含量测定方法重复性良好;总灰分含量最高
的为 6. 30%，最低的为 6. 11%，两者相差 0． 19%，这可能是每
次取样量的多少不同，导致需要高温炽灼的次数不同，而测试
的精确度只需到 0． 01 g，所以操作误差相对会变大，试验重复
性差些;70% 醇浸出物含量最高的为 6． 27%，最低的为
6． 11%，两者相差不到 0． 2 百分点，醇浸出物含量测定稳定性
和重复性良好。
表 1 试验药材理化特征的比较
药材样品
水分
(%)
总灰分
(%)
醇浸出物
(%)
1 8． 21 6． 22 6． 14
2 8． 23 6． 30 6． 23
3 8． 17 6． 17 6． 17
4 8． 19 6． 26 6． 27
5 8． 20 6． 25 6． 11
6 8． 21 6． 11 6． 21
7 8． 24 6． 23 6． 25
平均值 8． 21 6． 22 6． 20
3． 2 指纹图谱
3． 2． 1 TLC指纹图谱 按上述“2． 3”节的条件，毛细管分别
吸取 3 次样品溶液少许，点于同一块 GF254 板上，对试验材
料进行 TLC指纹图谱分析，结果(图 2)表明，同一样点在以
石油醚 －丙酮(8 ∶ 2)为展开剂，经展开后得到了多个荧光
点，表明此展开体系适用于本样品的 TLC指纹图谱构建;且 3
次点样得到的显荧光点位置几乎一致，表明试验重复性良好。
3． 2． 2 HPLC 指纹图谱 按上述条件，对试验材料进行
HPLC指纹图谱分析。分别吸取对照品和供试品溶液各 20 μL，
分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图 3 至图 5。
对照品香草木碱和月芸香酮碱的保留时间分别为 8 min 左右
和 11． 5 min左右，峰分离度好，峰形对称。
3． 2 脂溶性生物碱提取的单因素试验
3． 2． 1 乙醇浓度对脂溶性生物碱提取的影响 准确称取臭
常山粗粉 400 g 5 份，以料液比为 1 g ∶ 10 mL，分别加入体积
分数为55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，超声提取 30 min，
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按“2． 5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定性和定量测
定，考察不同浓度的乙醇对脂溶性生物碱提取率的影响，试验
结果见图 6。
由图 6 可知，脂溶性生物碱的提取率在乙醇体积分数为
65%时达到最大，当乙醇的体积分数超过 65%时，随着乙醇
体积分数的增大，脂溶性生物碱的提取率反而随之下降。这
可能是因为细胞在超声破碎后，内容物释放到溶液中，脂溶性
生物碱与其他内容物之间在这个极性段共溶性较好。以体积
分数 75%和 85%的乙醇作为提取溶剂，脂溶性生物碱的提取
率都比 55%的大，因此通过此单因素试验，宜选择体积分数
65%、75%、85%的乙醇作为正交试验中考察乙醇浓度影响的
3 个水平。
3． 2． 2 超声提取时间对脂溶性生物碱提取的影响 准确称
取 5 份臭常山粗粉各 400 g，在料液比为 1 g ∶ 10 mL、乙醇体
积分数为 65% 的条件下，分别超声提取 40、50、60、80、
100 min，按“2． 5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定性
分析和定量测定，考察不同超声提取时长对脂溶性生物碱提
取率的影响，结果见图 7。
由图 7 可知，臭常山脂溶性生物碱的提取率随着超声提
取时间的延长而增大，但当时间长达 80 min 时，再延长时间
脂溶性生物碱的提取率已变化不大，但超声提取时长 100 min，其
提取率由 80 min的 0． 288%增加到 0． 295%，提取率只提高了
0． 007 百分点，分析其可能原因是在超声进行到 60 min时，细
胞已经开始了大量破裂，细胞中所含生物碱大量释放到提取
液中。考虑到工艺要节能省时，故不考察超声提取 100 min
后继续延长超声提取时长的影响，所以正交试验在考察超声
提取时间对脂溶性生物碱提取率的影响时，只需考察 60、80、
100 min这 3 个水平。
3． 2． 3 料液比对脂溶性生物碱提取的影响 准确称取 5 份
臭常山粗粉各 400 g，在乙醇体积分数为 65%的条件下，分别
以料液比 1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25(g ∶ mL)，超声提
取 60 min，按“2． 5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定
性分析和定量测定，考察不同料液比对脂溶性生物碱提取率
的影响，结果见图 8。
由图 8 可知，超声提取过程中，脂溶性生物碱的提取率随
着提取过程中乙醇用量的增加而增大，当料液比为
1 g ∶ 15 mL 时，随着乙醇用量的增加，脂溶性生物碱的提取
率提高并不大，这是因为大部分细胞已经破碎，细胞中脂溶性
生物碱都已释放到溶液中，考虑到乙醇用量的增大会增加耗
能和增长旋转蒸发仪减压浓缩浸膏的时间，耗能耗时，不符合
工艺优化的目的。因此通过此单因素试验，可以确定正交试
验考察料液比对脂溶性生物碱提取率的影响时，料液比的选择
范围应在 1 g ∶ 15 mL 左右。
3． 2． 4 超声提取次数对脂溶性生物碱提取的影响 准确称
取臭常山粗粉 400 g，在料液比为 1 g ∶ 10 mL、乙醇体积分数
65%的条件下，超声提取 60 min /次，分别提取 1、2、3、4 次，按
“2. 5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定性分析和定量
测定，分别考察超声提取次数对脂溶性生物碱提取效果的影
响，试验结果见图 9。
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由图 9 可知，随着超声提取次数的增加，脂溶性生物碱的
提取率亦在增大，当超声提取进行 1 次时，脂溶性生物碱的提
取率为 0． 28%，过滤后的药渣进行与第 1 次相同条件的重复
提取，与第 2 次提取率相比，第 3 次提高了 0． 04 百分点;第 4
次比第 3 次只提高了 0． 01 百分点，所以在优化臭常山脂溶性
生物碱提取工艺过程中，在考察了乙醇浓度、超声时间、料液
比 3 个因素的正交试验后，将得到优方案工艺进行检验，最后
将优方案工艺进行 3 次超声提取，即可达到试验的工艺优化
研究目的。
3． 3 脂溶性生物碱提取的正交试验
在考察了上述单因素试验的基础上，臭常山脂溶性生物
碱正交试验设计要考察的各因素与水平详见表 2，正交试验
结果及分析见表 3。
表 2 臭常山脂溶性生物碱提取因素及水平
水平
A:乙醇浓度
(%)
B:超声时长
(min)
C:料液比
(g ∶ mL)
1 65 60 1 ∶ 10
2 75 80 1 ∶ 15
3 85 100 1 ∶ 20
表 3 臭常山脂溶性生物碱提取正交试验结果分析
试验号 A B C 提取率(%)
1 1 1 1 0． 280
2 1 2 2 0． 318
3 1 3 3 0． 290
4 2 1 2 0． 218
5 2 2 3 0． 228
6 2 3 1 0． 213
7 3 1 3 0． 240
8 3 2 1 0． 201
9 3 3 2 0． 175
K1 0． 888 0． 738 0． 694
K2 0． 659 0． 747 0． 711
K3 0． 616 0． 678 0． 758
k1 0． 296 0． 246 0． 231
k2 0． 220 0． 249 0． 237
k3 0． 205 0． 226 0． 253
Ｒ 0． 091 0． 023 0． 022
从表 3 可知，影响臭常山脂溶性生物碱提取率的各因素
的主次顺序依次为:乙醇体积分数 ＞超声提取时间 ＞料液比，
较优方案是用体积分数为 65%的乙醇、在料液比 1 g ∶ 20 mL
的条件下超声提取 80 min。因为此方案在正交试验中没有，
故需进行补充试验进行验证。按照优方案设计试验，超声提
取 3次，结果得到臭常山脂溶性生物碱的提取率为 0． 385%。
4 讨论与结论
与一般文献报道的生物碱提取工艺不同，由于中药材植
物的理化特征容易受到生长地区、季节、年龄的影响，在进行
有效成分分离提取工艺前，首先对试验材料臭常山提取液进
行 HPLC、TLC指纹图谱和水分、总灰分、醇浸出物含量等理化
特征研究，其水分、总灰分、醇浸出物含量均值分别为 8． 21%、
6. 22%、6． 20%，水分含量和醇浸出物含量测定的稳定性和重
复性良好，可能是受取样量和试验精度要求的影响，醇浸出物
含量测定的稳定性要稍差些。
与关于臭常山所含化学成分的分离鉴定文献报道不同，
本研究重点在臭常山的理化特征和脂溶性生物碱的提取工
艺，影响其提取因素的顺序依次为:乙醇体积分数 ＞超声提取
时间 ＞料液比;正交试验确定的最佳工艺条件为:65%乙醇作
为提取剂，料液比 1 g ∶ 20 mL，超声提取时间 80 min，提取 3
次，脂溶性生物碱提取率为 0． 385%。富集到的脂溶性生物
碱抗肺炎球菌、金黄色葡萄球菌及其他抑菌活性可进行深入
研究。
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