全 文 ：道 Tan ⅡA能抑制促炎递质如 NO、TNF-α、IL-1β 等
的产生［7］，结合本实验结果，考虑 Tan ⅡA 在 BM-
SCs增殖和分化过程中可以给细胞提供一个更加稳
定的微环境，利于细胞的代谢，起到保护和支持等积
极的作用。
综上所述，Tan ⅡA 能够提高体外培养的 BM-
SCs增殖速率，对 BMSCs 向成骨细胞分化有明确的
诱导作用，且随着 Tan ⅡA浓度的提高，这种作用更
加明显。但 BMSCs的增殖和分化机制较为复杂，有
较多的因子和信号通路参与其中，Tan ⅡA 在这个
过程中可能存在更多的干预机制和影响因素，还有
待进一步的实验研究。
参考文献:
［1］张欣，张蒲蓉，陈洁，等．丹参酮ⅡA对乳腺癌抑制作用的体内实
验研究［J］．四川大学学学报(医学版) ，2010，41(1) :62-67．
［2］Yang R，Liu A，Ma X，et al． Sodium tanshinoneⅡA sulfonate pro-
tects cardiomyocytes against oxidative stress-mediated apoptosis
through inhibiting JNK activation ［J］． J Cardiovasc Pharmacol，
2008，51(4) :396-401．
［3］魏沙，闫福曼，周乐全，等．丹参酮ⅡA磺酸钠对骨髓间充质干细
胞促增殖作用的研究［J］．辽宁中医药大学学报，2010，12(12) :
56-58．
［4］Wang L，Huang Y，Pan K，et al． Osteogenic responses to different
concentrations / rations of BMP-2 and bFGF in bone formation［J］．
Ann Biomed Eng，2010，38(1) :77-87．
［5］Ebara S，Nakayama K． Mechanism for the action of bone morphoge-
netic proteins and regulation of their activity［J］． Spine，2002，27
(16 Suppl 1) :10-15．
［6］ Jeon EJ，Lee KY，Choi NS，et al． Bone morphogenetic protein-2
stimulates Runx2 acetylation［J］． J Biol Chem，2006，281(24) :
16502-16511．
［7］Chen TH，Hsu YT，Chen CH，et al． Tanshinone IIA from Salvia
miltiorrhiza induces heme oxygenase-1 expression and inhibits li-
popolysaccharide-induced nitric oxide expression in RAW 264． 7
cells［J］． Mitochondrion，2007，7(1-2) :101-105．
(收稿日期:2011-05-11)
粗糠柴霉素抑制碘帕醇诱导的大鼠
肾小管上皮细胞凋亡
李晓宁，喻明霞，郑茗丹，水 华，吴小燕
(武汉大学中南医院，武汉 430071)
摘要:目的 研究粗糠柴霉素(Rottlerin)对碘帕醇诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响，并探讨其机制。方
法 体外培养的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分别用 0． 5 ～ 2 μmol /L 的 Rottlerin 与 100 mgI /ml 碘帕醇共同处
理 2 h，或在碘帕醇处理的同时加入 2 μmol /L Rottlerin处理不同时间，或以 2 μmol /L Rottlerin预处理 1 h后再用碘
帕醇处理 2 h。以相同渗透浓度的甘露醇处理 2 h的细胞作为对照。Hoechst 33342 染色观察凋亡细胞核形态并计
算凋亡细胞百分比;以 DEVD-AFC 为荧光底物测量 caspase 酶活性;用 DCFH-DA 荧光探针检测细胞内活性氧
(ROS)水平;Western blot检测 PKC-δ蛋白表达。结果 碘帕醇可诱导 NRK-52E细胞 PKC-δ蛋白表达、细胞内 ROS
生成、caspase酶激活及细胞凋亡。Rottlerin可抑制以上变化，呈剂量依赖性抑制细胞凋亡，但 Rottlerin 预处理不能
减少细胞凋亡。结论 Rottlerin可抑制碘帕醇诱导的 NRK-52E细胞凋亡，为造影剂肾病的治疗提供了新药物 。
关键词:造影剂;肾小管;凋亡;粗糠柴霉素
中图分类号:R692． 9 文献标志码:B 文章编号:1002-266X(2011)44-0040-03
近年来，随着放射诊断和介入治疗技术的发展，
X线造影剂的使用越来越广泛，造影剂相关性肾病
(CIN)的发病率也逐年上升，尤其在糖尿病、充血性
心衰、慢性肾脏病和老年患者等高危人群中，CIN的
发病率可高于 20% ～ 30%［1］。然而，CIN 的防治手
段十分有限。粗糠柴霉素(Rottlerin)是从印度和中
国传统药物粗糠柴中提取，可通过抑制 PKC-δ 活性
减少肾小管上皮细胞凋亡［2］。2010 年 5 月 ～ 2011
年 6 月我们进行本研究，拟观察 Rottlerin 对碘帕醇
(低渗非离子型造影剂)诱导的大鼠肾小管上皮细
胞(NRK-52E)凋亡的影响，并探讨其机制。
1 材料与方法
1． 1 主要试剂 胎牛血清(FBS)和 DMEM 培养基
(美国 Gibco) ，碘帕醇(上海博莱科信谊药业) ，Rot-
tlerin(美国 Calbiochem) ，Hoechst 33342(美国 Sig-
ma) ，Free AFC 和 DEVD-AFC(美国 Enzyme Systems
04
山东医药 2011 年第 51 卷第 44 期
Products) ，多克隆兔抗 PKC-δ 抗体(美国 Calbio-
chem) ，抗兔及抗鼠二抗(武汉博士德) ，鼠抗 β-actin
单克隆抗体和 DCFH-DA 活性氧检测试剂盒(上海
碧云天)。
1． 2 细胞培养 参照本研究小组以前的方法［3］。
NRK-52E细胞(美国 ATCC)用含 10% FBS、100 IU /
ml 青霉素、100 μg /ml 链霉素的 DMEM，在 37 ℃、
5% CO2 培养箱中培养和传代。本实验使用第 3 ～ 6
代细胞，实验前接种于 35 mm培养皿，接种密度 1 ×
106 /皿，细胞生长至 90%融合时进行实验，每个实
验至少重复 3 次。
1． 3 造影剂诱导 NRK-52E细胞凋亡 用含有碘帕
醇(100 mgI /ml，渗透浓度 207 mOsm /kg)的 DMEM
完全培养基处理 NRK-52E 细胞 2 h，渗透浓度为
220 mOsm /kg的甘露醇(4% w /v)作为渗透压对照，
未加任何处理因素的 DMEM 完全培养基作为空白
对照。
1． 4 Rottlerin 干预 在碘帕醇处理的同时加入不
同浓度(0． 5、1、1． 5、2 μmol /L)的 Rottlerin;或者加
入 2 μmol /L Rottlerin处理不同时间(0． 5、1、1． 5、2、
4 h) ;部分细胞以 2 μmol /L Rottlerin 预处理 1 h 后
更换培养基并用碘帕醇处理 2 h(预处理组)。
1． 5 Hoechst 33342 检测 染色及凋亡细胞形态学
检测 碘帕醇处理后的细胞用 4%多聚甲醛固定，10
μg /ml Hoechst 33342 孵育使细胞核着色，于倒置相
差和荧光显微镜下观察细胞及细胞核形态并显微摄
影记录。凋亡的形态学分析方法参照我们以前的工
作［2］，在每个平皿中随机选择 4 个视野，每个视野
约 200 个细胞，依据典型的凋亡形态特点计数凋亡
细胞并计算凋亡率。
1． 6 蛋白水解酶活性测定 处理后的细胞以含
1% Triton X-100 的细胞裂解液冰上裂解取上清，将
含有 12． 5 μg蛋白的细胞裂解液加入含 50 μmol /L
DEVD-AFC的酶反应体系中，37 ℃条件下在激发光
360 nm、发射光 530 nm下连续检测反应所产生的荧
光值共 60 min。以游离 AFC 制定标准曲线。通过
计算将所读取的酶反应荧光值换算成蛋白水解酶活
性［2］。
1． 7 细胞内活性氧(ROS)检测 细胞内 ROS 水平
用荧光探针 DCFH-DA 的 ROS 检测试剂盒检测。
NRK-52E细胞先与荧光探针共孵育 25 min，再用不
同条件处理后收集细胞，用流式细胞仪测定细胞内
相对荧光强度，表示为相对于正常对照组的倍数。
1． 8 Western blot 用含 2% SDS 的细胞裂解液裂
解细胞，收集上清，每孔上样等量蛋白(通常为 20
μg) ，在还原状态下电泳。样品分离后电转印至
PVDF膜，并用含 2% BSA 的缓冲液阻断非特异性
结合位点。经一抗 4 ℃孵育过夜和 HRP 标记的二
抗室温孵育 1 h后，用 ECL显影蛋白于 X光胶片上
扫描胶片，用 Photoshop软件对蛋白表达进行定量分
析。
1． 9 统计学方法 数据用 珋x ± s 表示，统计学分析
采用 GraphPad Prism 软件。两组间均数比较采用
student’s t检验，多组间均数比较经方差齐性检验
后采用 Tukey’s post-tests。以 P≤0． 05 为差异有统
计学意义。
2 结果
2． 1 碘帕醇诱导 NRK-52E 细胞凋亡及 Rottlerin 对
其的保护作用 碘帕醇可诱导 NRK-52E 细胞凋亡，
而作为渗透压对照的甘露醇不引起细胞凋亡(见插
页Ⅱ图 7A)。凋亡细胞计数显示，随着碘帕醇处理
时间的延长，凋亡细胞增加。在碘帕醇处理的同时
加入 2 μmol /L Rottlerin，明显抑制细胞凋亡(见插页
Ⅱ图 7B)。0、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0 μmol /L Rottlerin 与
100 mgI /ml碘帕醇共同处理细胞 2 h，细胞凋亡率分
别为(25． 83 ± 1． 44)%、(20． 50 ± 1． 80)%、(13． 00
± 0． 87)%、(9． 17 ± 1． 44 )%、(8． 33 ± 1． 44 )%，统
计结果显示 Rottlerin在低浓度(0． 5 μmol /L)时即可
抑制碘帕醇诱导的 NRK-52E细胞凋亡，其抑制作用
呈剂量依赖性(P ＜ 0． 05 或 ＜ 0． 01)。蛋白水解酶活
性分析显示对照组、甘露醇组、碘帕醇组、碘帕醇 +
1． 0 μmol /L Rottlerin 组、碘帕醇 + 2． 0 μmol /L Rot-
tlerin组蛋白水解酶活性分别为(－1． 32 ± 2． 52)、
(－ 0． 77 ± 1． 65)、(37． 71 ± 3． 08)、(21． 01 ± 3． 19)、
(14． 44 ± 1． 77)nmol AFC /(mg pr·h) ，结果表明
1． 0和 2． 0 μmol /L的 Rottlerin都可以明显抑制碘帕
醇诱导的 caspase 激活，且呈 Rottlerin 剂量依赖性
(P ＜ 0． 01)。
2． 2 Rottlerin预处理对 NRK-52E 细胞凋亡的影响
预处理组、100 mgI /ml碘帕醇组、100 mgI /ml碘帕
醇 + 2 μmol /L Rottlerin组细胞凋亡率分别为(25． 00
± 2． 50)%、(25． 83 ± 1． 44)%、(8． 33 ± 1． 44)%，碘
帕醇 + Rottlerin组与碘帕醇组比较 P ＜ 0． 01。
2． 3 碘帕醇和 Rottlerin 对 PKC-δ 表达的影响 碘
帕醇可诱导 PKC-δ 表达上调，作为 PKC-δ 抑制剂
Rottlerin可抑制 PKC-δ的表达上调。见图 1。
2． 4 Rottlerin 对碘帕醇诱导的细胞内 ROS 生成的
影响 对照组、甘露醇组、100 mgI /ml碘帕醇组、100
mgI /ml碘帕醇 + 2 μmol /L Rottlerin 组细胞内 ROS
水平分别为 1． 00 ± 0． 00、0． 89 ± 0． 17、4． 28 ± 0． 23、
14
山东医药 2011 年第 51 卷第 44 期
图 1 Rottlerin对造影剂刺激后 PKC-δ表达的影响
注:CT为空白对照组;M 为甘露醇组;I 为碘帕醇组;I + R 为碘
帕醇 + 2 μmol /L Rottlerin组
1． 54 ± 0． 22，碘帕醇组与其他 3 组比较 P均 ＜ 0． 01。
3 讨论
CIN的发病机制复杂，造影剂诱导的肾小管上
皮细胞凋亡和氧化应激，以及继发于缺血缺氧和血
管内皮损伤的氧化应激，在其中发挥主要作用［4］。
目前针对 CIN 的预防和治疗手段有限。造影前水
化治疗和使用抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸(NAC)对
预防 CIN具有一定的临床意义。
研究证实，细胞凋亡参与造影剂诱导的肾小管
损伤［3］。本研究小组发现 PKC-δ 参与白蛋白［2］和
化疗药物(结果尚未发表)诱导的肾小管上皮细胞
凋亡。在本研究中造影剂刺激后 PKC-δ 总蛋白水
平上调，说明 PKC-δ参与了造影剂诱导的 NRK-52E
细胞凋亡。有研究表明，PKC-δ 可以从多个方面参
与氧化应激过程［5］，并促进 ROS 生成，PKC-δ 活化
和 ROS 生成之间呈正反馈［6］。基于氧化应激在
CIN发生机制中的重要作用，以及 PKC-δ 在氧化应
激中的作用，本研究检测碘帕醇处理后 NRK-52E 细
胞内 ROS 水平的变化。结果显示，碘帕醇处理后
ROS 水平明显上升，在处理后 2 h达到基础值的 4． 2
倍。其变化与 PKC-δ的变化是一致的。
Rottlerin多年来一直被作为一种 PKC-δ 抑制剂
用于研究 PKC-δ 的功能。另据报道，Rottlerin 可抑
制 ROS产生和清除氧自由基［7］。因此，从理论上讲
Rottlerin有可能通过抑制氧化应激和抑制细胞凋亡
来减轻造影剂引起的肾小管损伤。Rottlerin 分子包
含 5 个酚式羟基基团，可以作为氢的供体清除自由
基［8］。但是，Rottlerin 除了作为氢供体减轻氧化应
激外，其对 PKC-δ的抑制作用是否也可以间接发挥
抑制氧化应激的作用，目前还未见报道。本研究认
为，Rottlerin 在造影剂诱导的急性肾小管上皮细胞
损伤中的保护作用可能还有其他机制参与，其对
ROS生成的影响可能既有其直接作用，又有通过
PKC-δ而发挥的间接作用。如果 Rottlerin 预处理可
以减少碘帕醇诱导的 NRK-52E细胞凋亡，则有可能
在体内实验中进行造影剂注射前的预防，减少 CIN
的发生。但本研究结果显示，单独的 Rottlerin 预处
理不能减少细胞凋亡。
综上所述，本研究发现了从植物中提取的 PKC-
δ抑制剂 Rottlerin对碘帕醇处理的肾小管上皮细胞
的保护作用。Rottlerin 的这一保护作用与其抑制
PKC-δ 表达和细胞内 ROS 生成密切相关。这些结
果提示，PKC-δ 可能成为 CIN 治疗的靶目标，Rot-
tlerin可能成为治疗 CIN的药物。
参考文献:
［1］Tepel M，Aspelin P，Lameire N． Contrast-induced nephropathy:a
clinical and evidence-based approach［J］． Circulation，2006，113
(14) :1799-1806．
［2］Li X，Pabla N，Wei Q，et al． PKC-delta promotes renal tubular cell
apoptosis associated with proteinuria ［J］． J Am Soc Nephrol，
2010，21(7) :1115-1124．
［3］杨定平，贾汝汉，丁国华，等．反向模式钠钙离子交换体抑制剂降
低造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡［J］．中华急诊医学杂志，
2008，17(7) :713-716．
［4］严红，张黔桓，靳立军，等．碘克沙醇与碘帕醇用于肾功不全患者
行冠状动脉介入术的肾毒性对比 ［J］． 中华急诊医学杂志，
2008，17(1) :72-75．
［5］Guo J，Cong L，Rybin VO，et al． Protein kinase C-delta regulates
the subcellular localization of Shc in H2O2-treated cardiomyocytes
［J］． Am J Physiol Cell Physiol，2010，299(4) :C770-778．
［6］Talior I，Tennenbaum T，Kuroki T，et al． PKC-delta-dependent ac-
tivation of oxidative stress in adipocytes of obese and insulin-resistant
mice:role for NADPH oxidase ［J］． Am J Physiol Endocrinol
Metab，2005，288(2) :E405-411．
［7］ Longpre JM，Loo G． Protection of human colon epithelial cells a-
gainst deoxycholate by rottlerin ［J］． Apoptosis，2008，13(9) :
1162-1171．
［8］Maioli E，Valacchi G． Rottlerin:bases for a possible usage in psori-
asis［J］． Curr Drug Metab，2010，11(5) :425-430．
(收稿日期:2011-06-28)
24
山东医药 2011 年第 51 卷第 44 期