全 文 ：倒心盾翅藤对肾小管上皮细胞损伤的保护作用
宋美芳，李宜航，李学兰，张忠廉，吕亚娜，李光
(中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南省西双版纳傣族自治州傣药南药重点实验室，景洪 666100)
摘 要 目的 考察傣药倒心盾翅藤不同极性部位在体外对草酸钠致肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用，研
究其治疗尿石症的物质基础。方法 以草酸钠损伤 HK-2细胞模型体外活性筛选为导向，MTT 法检测倒心盾翅藤不同
极性部位对草酸钠致 HK-2细胞损伤的保护作用，初步确定活性部位。结果 倒心盾翅藤不同溶剂提取液可不同程度
提高草酸钠损伤后细胞活力，0．5和 1 mg·mL－1水提液组细胞活力分别上升至 86．17%和 95．42%;0．5和 1 mg·mL－150%
醇提液组细胞活力分别上升至 93．59%和 84．77%;95%醇提液各剂量组细胞活力均上升至 81．56%以上，与模型对照组比
较，均差异有统计学意义;0．5和 1 mg·mL－195%醇提乙酸乙酯部位组细胞活力分别上升至 82．53%和 91．58%;0．5 和
1 mg·mL－195%醇提正丁醇部位组细胞活力分别上升至 77．24%和 87．22%;0．5和 1 mg·mL－1水部位组细胞活力分别上
升至 95．46%和 81．36%，与模型对照组比较，均差异有统计学意义，其余部位各剂量组细胞活力与模型对照组比较，差异
无统计学意义。结论 倒心盾翅藤水提液和醇提液对草酸钠导致的 HK-2细胞损伤有明显保护作用，其中乙酸乙酯部
位、正丁醇部位以及水部位作用显著，可能是其体外抗结石活性的有效部位。
关键词 倒心盾翅藤;草酸钠;HK-2细胞;损伤，上皮细胞，肾小管;提取，不同溶剂
中图分类号 R286;R965 文献标识码 A 文章编号 1004－0781(2016)03－0249－04
DOI 10．3870 / j．issn．1004-0781．2016．03．008
Preventive Effects of Aspidopterys obcordata on Renal Tubular Epithelial Cells Injury
SONG Meifang，LI Yihang，LI Xuelan，ZHANG Zhonglian，LUY Yana，LI Guang(Yunnan Branch，Institute of
Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences;The Key Laboratory of Dai and Southern
Medicine of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture，Jinghong 666100，China)
ABSTRACT Objective To explore the preventive effects of different extracts from Aspidopterys obcordata on renal tubu-
lar epithelial cells injury induced by sodium oxalate in vitro，and initially identify the effective part for treating urolithiasis．
Methods The injury model of HK-2 cells induced by sodium oxalate was established to screen the active parts of Aspidopterys
obcordata by testing the protective effects of different polarity extracts on HK-2 injury cells through MTT method． Results Dif-
ferent extracts from Aspidopterys obcordata improved the activity of HK-2 injury cells，which were elevated to 86．17% and 95．42%
by 0． 5 mg·mL－1 and 1 mg· mL－1 aqueous extract，respectively． And the activity reached to 93． 59% and 84． 77% by
0．5 mg·mL－1 and 1 mg·mL－1 50% alcohol extracts，reached above 81．56% by 95% alcohol extracts，all of which showed sig-
nificant difference compared with the model group． The HK-2 cells viability were elevated to 82． 53% and 91． 58% by
0．5 mg·mL－1 and 1 mg·mL－1 95% alcohol extracted ethyl acetate parts，and increased to 77．24% and 87．22% by 0．5 mg·
mL－1and 1 mg·mL－1 of 95% alcohol isolated n-butanol extracts，approached to 95．46% and 81．36% by 0．5 mg·mL－1 and 1
mg·mL－1 water extracts，all of which showed significant difference compared with the model control group． Conclusion The
aqueous extracts and alcohol extracts from Aspidopterys obcordata have obvious preventive effects on HK-2 cells injury，among
which the ethyl acetate extracts，n-butanol extracts and water extracts present the remarkable effects，which are supposed to be
the active parts for inhibiting calcium oxalate stone formation in vitro．
KEY WORDS Aspidopterys obcordata Hemsl．var．obcordata;Sodium oxalate;HK-2 cells;Injury，epithelial cells，renal tubu-
lar;Extract，different solvent
倒心盾翅藤是傣药中的一味解药，入水塔，是傣医
传统经方五淋化石胶囊的主要组方药材，也是目前傣
医临床用量最大的一味药材。该药来源于金虎尾科植
收稿日期 2014－09－25 修回日期 2014－10－22
基金项目 * 中央级公益性科研院所基本科研业务专项
(YZYN-14-04，YZYN-15-06)
作者简介 宋美芳(1981－) ，女，山西晋中人，助理研究员，
硕士，研究方向:傣药南药研发。E-mail:songmeifang1981@ 126．
com。
通信作者 李光(1985－) ，男，河北安国人，助理研究员，硕
士，研究方向:傣药南药研发。E-mail:178511647@ qq．com。
物倒心盾翅藤(Aspidopterys obcordata Hemsl． var． obcor-
data)的干燥藤茎［1-3］，分布于云南省西南、南部至东南
部，具有消炎利尿、清热排石的功效，主要用于治疗尿
路感染、尿路结石等疾病，且具有显著的抗结石作
用［4-5］。然而目前关于其治疗泌尿系结石的活性物质
仍不清楚，笔者未见文献报道。为阐明其治疗尿石症
的物质基础，笔者考察了倒心盾翅藤不同极性部位对
草酸钠致 HK-2 细胞损伤的保护作用，初步确定其活
性部位。
·942·医药导报 2016年 3月第 35卷第 3期
1 材料与方法
1．1 试药 倒心盾翅藤采集于云南省西南部，由本所
李学兰研究员进行基源鉴定。标本存放于阴凉干燥通
风处。噻唑蓝(MTT，阿拉丁试剂，批号:L1331024)、
达尔伯克改良伊格尔培养液(Dulbecco minimum essen-
tial medium，DMEM/F12，Hyclone 公 司，批 号:
NZB1075)、胎 牛 血 清 (FBS，Gibco 公 司，批 号:
1133067)、二甲基亚砜(DMSO，Gibco，批号:1138657)、
2．5%胰蛋白酶(Gibco公司，批号:1369113)、双抗(Hy-
clone公司，批号:J130071)、L-谷氨酰胺(阿拉丁试剂，
批号:J1318016)、D-Hank’s 缓冲液(Hyclone 公司，批
号:20130824258) ，以上试剂均购自于塞默飞世尔生物
化学制品(北京)有限公司。
1．2 细胞 HK-2细胞株购买于中国科学院昆明动物
研究所细胞库。
1．3 仪器 二氧化碳培养箱(型号:HF160W，上海力
申科学仪器有限公司)、超净工作台(型号:SW-CJ-1F，
苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)、酶标仪(Ther-
mo，型号:Multiskan MK3，塞默飞世尔仪器有限公司)、
countstar自动细胞计数仪(型号:IC1000，上海睿钰生
物科技有限公司)。
1．4 HK-2细胞生长曲线的绘制 取生长良好的 HK-2
细胞，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于 24孔培养
板，24 h后开始计数细胞，间隔 24 h计数 1次，每天取 3
孔细胞分别进行计数，计算其平均值，作为当天的细胞
增殖后总数，连续计数7 d。
1．5 倒心盾翅藤提取物的制备及溶解 将倒心盾翅
藤分别以水、50%乙醇、95%乙醇回流提取，每种溶剂
分别提取 3，2，1 h，过滤，合并滤液，浓缩，得 3 种粗提
浸膏。将上述 3种粗提浸膏分别以石油醚、乙酸乙酯
和正丁醇分步萃取，萃取液浓缩至浸膏状，得到不同极
性部位提取物。上述提取物浸膏，加入 DMSO 研磨溶
解，并用无血清 DMEM/F12培养液依次稀释成 2，1，0．
5，0．25，0．125 mg·mL－1溶液，实验前用孔径 0．22 !m
微孔滤膜过滤除菌。
1．6 倒心盾翅藤不同提取物对 HK-2 细胞的毒性作
用 取生长良好的 HK-2细胞，胰蛋白酶消化，制成 1×
105·mL－1细胞悬液，接种于 96 孔板，每孔 100 μL，
24 h后吸弃培养液，换成不含血清的 DMEM/F12 培养
液，使细胞处于静止期;空白对照组不加药物，药物组
分别加入不同浓度倒心盾翅藤提取物，使终浓度分别
为 0．062 5，0．125，0．25，0．5，1 mg·mL－1，每个浓度设 4
个复孔;37 ℃培养箱内孵育 24 h，MTT 法检测倒心盾
翅藤提取物对 HK-2细胞的毒性作用。
1．7 不同浓度草酸钠和一水草酸钙结晶对 HK-2细胞
的毒性作用 HK-2 细胞培养同“1．4”项，空白对照组
接种正常细胞，药物组分别加入不同终浓度草酸钠
(1，3，5 mmol·L－1)、一 水 草 酸 钙 结 晶 (1，3，
6 mmol·L－1)或草酸钠(1，3，5 mmol·L－1)+一水草酸
钙结晶(3 mmol·L－1) ，每个浓度设 4 个复孔，37 ℃培
养箱内孵育 12 h 后，采用 MTT 法检测草酸钠或一水
草酸钙对 HK-2细胞的毒性作用。
1．8 倒心盾翅藤不同溶剂提取物对草酸钠致 HK-2细
胞损伤的保护作用 HK-2 细胞培养同“1．4”，空白对
照组接种正常细胞，药物组分别加入不同终浓度(1，
0．5，0．25，0．125 mg·mL－1)倒心盾翅藤水提液、50%醇
提液和 95%醇提液，除空白对照组细胞外，其他组均
加入终浓度为 3 mmol·L－1草酸钠建立 HK-2 细胞损
伤模型，每个浓度设 4 个复孔，37 ℃培养箱内孵育
24 h后，MTT法检测各组细胞活力。
1．9 倒心盾翅藤不同极性部位对草酸钠致 HK-2细胞
损伤的保护作用 HK-2细胞培养同“1．4”项，空白对照
组接种正常细胞，药物组分别加入不同浓度(1，0．5，
0．25，0．125 mg·mL－1)倒心盾翅藤不同极性部位提取
液，除空白对照组细胞外，其他组均加入 3 mmol·L－1草
酸钠建立 HK-2细胞损伤模型，每个浓度设 4 个复孔，
37 ℃培养箱内孵育 24 h后，采用 MTT法检测各组细胞
活力。
1．10 统计学方法 采用 SPSS10．0 版统计软件对实
验结果进行单因素方差分析，以 P＜0．05表示差异有统
计学意义。
2 结果
2．1 HK-2细胞生长周期的确定 HK-2 细胞培养第
3～4 天处于生长旺盛期，生长状态良好，增殖较快，适
宜进行实验;培养第 5～7天细胞生长缓慢，状态较差，
不宜进行实验，见图 1，2。
图 1 HK-2细胞生长曲线
Fig．1 Growth curve of HK-2 cells
2．2 倒心盾翅藤不同提取物对 HK-2细胞的毒性 见
·052· Herald of Medicine Vol. 35 No. 3 March 2016
表 1。结果提示，倒心盾翅藤水提液、50%醇提液和 95%
醇提液在 0．062 5～1 mg·mL－1范围内无细胞毒作用。
2．3 草酸钠和一水草酸钙结晶对 HK-2细胞的毒性 不
同浓度草酸钠和一水草酸钙对 HK-2细胞的毒性作用见
表 2。结果提示，3和 5 mmol·L－1草酸钠、3 mmol·L－1一
水草酸钙结晶、3 mmol·L－1草酸钠+3 mmol·L－1一水草
酸钙结晶和5 mmol·L－1草酸钠+3 mmol·L－1一水草酸钙
结晶均可导致 HK-2细胞损伤，与空白对照组比较，差异
有统计学意义。据此结果，后续试验选用3 mmol·L－1草
酸钠建立HK-2细胞损伤模型进行实验。
图 2 HK-2细胞(×20)
Fig．2 HK-2 cells(×20)
表 1 不同倒心盾翅藤提取物作用后 HK-2细胞活性
Tab．1 Activity of HK-2 cells treated with different ex-
tracts from Aspidopterys obcordata %，x±s，n= 4
组别 细胞活力 /%
空白对照组 100
水提液
1 98．9±1．2
0．5 95．3±2．6
0．25 100．0±3．1
0．125 95．6±3．4
0．062 5 100．0±3．8
DMSO对照组 99．2±2．3
50%醇提液
1 97．5±2．6
0．5 99．7±1．9
组别 细胞活力 /%
0．25 94．5±3．8
0．125 100．0±3．6
0．062 5 98．7±4．1
DMSO对照组 100．0±2．1
95%醇提液
1 95．7±3．4
0．5 97．1±4．1
0．25 98．1±2．7
0．125 94．7±2．9
0．062 5 99．1±3．6
DMSO对照组 98．4±2．4
2．4 倒心盾刺藤不同溶剂提取物对 HK-2细胞的保护
作用 见表 3。结果提示，与空白组比较，草酸钠组细
胞活力明显下降，提示草酸钠对 HK-2 细胞造成了一
定损伤;与草酸钠组比较，倒心盾翅藤水提液(1，
0．5 mg·mL－1)和 50%醇提液(1，0．5 mg·mL－1)以及
95%醇提液(1，0．5，0．25，0．125 mg·mL－1)组细胞活力
均明显提高，差异有统计学意义，提示倒心盾翅藤水提
液和醇提液对草酸钠导致的 HK-2细胞损伤均有明显
的保护作用。
表 2 草酸钠与一水草酸钙作用后 HK-2细胞活力
Tab．2 Activety of HK-2 cells treated with sodium ox-
alate or calcium oxalate monohydrate
组别 细胞活力 /%
空白对照组 100．00±0．00
草酸钠
1 mmol·L－1 98．24±1．30
3 mmol·L－1 62．91±2．60* 1
5 mmol·L－1 60．30±2．10* 1
一水草酸钙(COM)
1 mmol·L－1 88．10±3．00
3 mmol·L－1 68．43±2．90* 1
6 mmol·L－1 88．05±3．90
草酸钠+COM
1 mmol·L－1+3 mmol·L－1 92．12±3．40
3 mmol·L－1+3 mmol·L－1 64．41±4．00* 1
5 mmol·L－1+3 mmol·L－1 51．06±2．80* 1
与空白对照组比较，* 1P＜0．05
Compared with blank group，* 1P＜0．05
表 3 不同倒心盾翅藤提取液对草酸钠致 HK-2细胞损伤
的保护作用
Tab．3 Protective effect of different extracts from Aspi-
dopterys obcordata on HK-2 cells injuried by sodium oxalate
组别 细胞活力 /%
空白对照组 100．00±0．00
DMSO对照组
0．5% 97．53±2．89* 3
模型对照组
3 mmol·L－1 67．54±2．31* 1
水提液
1 mg·mL－1 95．42±3．10* 2
0．5 mg·mL－1 86．17±2．91* 3
0．25 mg·mL－1 76．35±3．28
0．125 mg·mL－1 65．93±2．37
50%醇提液
1 mg·mL－1 84．77±4．31* 3
0．5 mg·mL－1 93．59±3．69* 2
0．25 mg·mL－1 76．15±4．62
0．125 mg·mL－1 69．34±3．98
95%醇提液
1 mg·mL－1 81．56±3．49* 2
0．5 mg·mL－1 91．38±3．71* 3
0．25 mg·mL－1 97．25±4．26* 3
0．125 mg·mL－1 93．68±3．45* 3
与空白对照组比较，* 1P＜0．05;与模型对照组比较，* 2P＜
0．05，* 3P＜0．01
Compared with blank control group，* 1P＜0．05;compared with
model control group，* 1P＜0．05，* 2P＜0．01
2．5 倒心盾翅藤不同极性部位对 HK-2细胞的保护作
·152·医药导报 2016年 3月第 35卷第 3期
用 见表 4。结果提示，与空白对照组比较，模型对照组
细胞活力明显下降;与模型对照组比较，95%醇提乙酸乙
酯部位 0．5 和 1 mg·mL－1、95%醇提正丁醇部位 0．5 和
1 mg·mL－1以及水提水部位 0．5和1 mg·mL－1组细胞活
力明显提高，差异有统计学意义，提示倒心盾翅藤乙酸乙
酯部位、正丁醇部位及水部位对草酸钠所致 HK-2细胞损
伤有明显保护作用。
表 4 倒心盾翅藤不同极性部位对草酸钠致 HK-2细胞损
伤的保护作用
Tab．4 Protective effect of different polar parts from As-
pidopterys obcordata on HK-2 cells injuried by sodium oxalate
组别 细胞活力 /%
空白对照组 100．00±0．00
DMSO对照组
0．5% 98．26±4．17* 3
模型对照组
3 mmol·L－1 63．73±4．30
95%醇提石油醚部位
1 mg·mL－1 64．39±3．98
0．5 mg·mL－1 60．87±5．98
0．25 mg·mL－1 67．15±4．65
0．125 mg·mL－1 63．15±3．45
95%醇提乙酸乙酯部位
1 mg·mL－1 91．58±4．62* 2
0．5 mg·mL－1 82．53±5．10* 2
0．25 mg·mL－1 72．83±4．98
0．125 mg·mL－1 62．85±4．91
95%醇提正丁醇部位
1 mg·mL－1 87．22±6．02* 2
0．5 mg·mL－1 77．24±5．90* 2
0．25 mg·mL－1 61．38±4．25
0．125 mg·mL－1 62．71±5．28
95%醇提水部位
1 mg·mL－1 61．82±5．30
0．5 mg·mL－1 65．64±4．65
组别 细胞活力 /%
0．25 mg·mL－1 59．19±4．62
0．125 mg·mL－1 60．95±6．32
50%醇提乙酸乙酯部位
1 mg·mL－1 66．96±5．11
0．5 mg·mL－1 57．56±5．14
0．25 mg·mL－1 73．23±3．26
0．125 mg·mL－1 59．65±4．26
50%醇提正丁醇部位
1 mg·mL－1 58．30±5．42
0．5 mg·mL－1 61．84±3．69
0．25 mg·mL－1 62．36±4．57
0．125 mg·mL－1 59．94±6．12
50%醇提水部位
1 mg·mL－1 52．53±4．15
0．5 mg·mL－1 59．26±4．78
0．25 mg·mL－1 69．54±7．15
0．125 mg·mL－1 60．02±4．28
水提水部位
1 mg·mL－1 81．36±6．20* 2
0．5 mg·mL－1 95．46±4．95* 3
0．25 mg·mL－1 75．28±5．20
0．125 mg·mL－1 69．30±6．92
与空白对照组比较，* 1P＜0．05;与模型对照组比较，* 2P＜
0．05，* 3P＜0．01
Compared with blank control group，* 1P＜0．05;compared with
model control group，* 2P＜0．05，* 3P＜0．01
3 讨论
国内外研究发现，肾小管上皮细胞的损伤与肾结
石形成关系密切，肾小管上皮细胞受损后一系列生理
病理改变在肾结石形成中起重要的作用［6］。损伤的
细胞不但成为初始成核的有效位点，而且增强了膜与
微晶的粘附，加速肾结石形成;细胞损伤后产生的碎片
还可为草酸钙结晶的异质成核提供条件［7］。研究发
现［8-10］，高浓度草酸盐可导致肾小管上皮细胞产生一
系列改变，如自由基产生增加，抗氧化作用降低，继而
导致肾小管上皮细胞损伤和死亡，这些改变又可促进
结晶粘附和滞留。笔者在本研究中通过草酸钠致 HK-
2细胞损伤的体外模型，研究倒心盾翅藤不同提取物
对 HK-2细胞损伤保护作用，结果证实，倒心盾翅藤水
提液和醇提液对草酸钠导致的 HK-2细胞损伤均有明
显保护作用;其中乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部
位作用尤为显著，说明这些部位可能是其体外抗结石
活性的有效部位。
本研究利用体外细胞模型证实了倒心盾翅藤对肾
小管上皮细胞损伤的保护作用，并初步确定了其体外
抗结石的可能活性部位，为其进一步深入研究奠定了
基础。在下一步研究中，将对倒心盾翅藤治疗肾结石
的可能活性部位进一步分离纯化，进行深入研究。
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