全 文 ：果 树 学 报 2006,23(3):335～338
JournalofFruitScience
金柑属及其近缘属植物亲缘关系的SSR分析
张连峰,何 建,冯 焱,刘 利,郭启高,梁国鲁 *
(西南大学园艺园林学院,重庆 400716)
摘 要:用SSR标记分析了金柑属(Fortunela)及柑橘属(Citrus)植物的亲缘关系。选取的22对柑橘属SSR引物中,
有14对能在所有材料中扩增出带纹,表明柑橘属SSR引物在金柑属植物上具有一定的通用性。在18个材料中扩增
得到275个位点,平均每对引物扩增出19.7个位点 。用 NTSYS-PC软件进行分析,结果表明,金柑属植物与宽皮柑
橘的亲缘关系很近;SSR聚类结果支持长寿金柑种的地位;支持宁波金弹、融安金弹、蓝山金柑均为金弹的栽培种
的结论。为金柑属种质的保存、育种和分类提供了分子水平上的依据。
关键词:金柑属;SSR;亲缘关系
中图分类号:S666.1 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2006)03-335-04
PhylogeneticrelationshipsamongFortunelaanditsrelativesasrevealed
bySSRmarkers
ZHANGLian-feng,HEJian,FENGYan,LIULi,GUOQi-gao,LIANGGuo-lu*
(ColegeofHorticulture,SouthwestUniversity,Chongqing400716China)
Abstract:Phylogeneticrelationshipsamong18accessionsbelongingtoFortunelaandCitruswereinvestigatedbyusingSSR
markers.14SSRprimerswereselectedfrom22CitrusSSRmarkers.Theseprimersgenerated275polymorphicalelesin18
accessions,withanaverageof19.7alelesperprimer.ClusteranalysisviaNTSYS-PCsoftwareshowedthatCitruswasclose
toFortunela.TheresultofSSRanalysissupportedthatthespeciesstatusofChangshoukumquat;theNingbokumquat,
Rong’ankumquatandLanshankumquatarethesamespeciesofFortunela;someoftheCitrusSSRmarkerscanbeusedin
Fortunela.Theresultcanbeusedforpreservation,breedingandclassificationinFortunela.
KeyWords:Fortunela;SSR;Phylogeneticrelationship
金柑为芸香科 (Rutacease)柑橘亚科(Auran-
tioideae)柑橘族(Citreae)柑橘亚族(Citrinae)真正柑
橘类植物[1]。为我国特有水果和优良的园林树种[2]。
由于金柑属植物与近缘属植物种属间易杂交且杂种
可孕,导致类型繁多,形态复杂[3]。不同的分类者采
用的分类标准不同,导致有关该属的分类,特别是种
的划分,一直存在较大分歧[4]。
国内外学者在金柑属植物的杂交育种、同工酶
分析和孢粉学等方面做了大量的工作[5-6],也取得了
较大成绩,但对金柑属植物在分子水平的分类研究
还未见报道。SSR(simplesequencerepeats)也称微卫
星 DNA(microsatelite),是一种以少数几个核苷酸
为重复单位组成的串联重复DNA序列。这些序列广
泛存在于真核细胞的基因组中,不同物种间微卫星
基序重复次数的不同而形成了多态性。SSR具有多
态性高、共显性、简便性、结果稳定可靠及在染色体
上的广泛、均匀分布等特点,能够准确高效的鉴别出
大量的等位基因,已广泛应用于生物遗传多样性研
究、亲缘关系分析、品种鉴定、指纹图谱构建、主要性
状基因的定位及系谱分析和分子标记辅助选择育种
等多个方面[7-8]。本研究应用SSR标记对金柑属及其
近缘的部分柑橘属植物进行了分析,旨在探讨我国
金柑属各个种、品种以及相关种属之间的亲缘关系,
为我国金柑属种质的保存以及杂交育种和分类提供
相应的基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料取自中国农业科学院柑橘研究所国家
柑橘种质资源圃,包括10个金柑属材料及8个柑橘
属材料(表1)。
由于不同种或者近缘种可以共享某些 SSR引
收稿日期:2005-09-09 接受日期:2006-02-27
基金项目:重庆市自然科学基金资助项目(编号:8573)。
作者简介:张连峰,男,在读硕士研究生。Tel:023-68250383,E-mail:zhanglf625@yahoo.com.cn
?通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:023-68251955,E-mail:lianggl@swau.cq.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2006.03.005
果 树 学 报 23卷
编号
Code
名称Name 编号
Code
名称Name
Commonname Swingle’sorTanaka’ssystem Commonname Swingle’sorTanaka’ssystem
1
2
3
4
5
6
7
8
9
温州罗浮
蓝山金柑
宁波金弹
宁波罗浮
融安金弹
宁波罗纹
温州金弹
长寿金柑
浏阳金柑
F.margaritaSwingle
F.crassifoliaSwingle
F.crassifoliaSwingle
F.margaritaSwingle
F.crassifoliaSwingle
F.japonicaSwingle
F.crassifoliaSwingle
F.obovataTanaka
F.crassifoliaSwingle
10
11
12
13
14
15
16
17
18
金豆
立花橘
印度酸橘
道县野橘
合江佛手
莽山野橘
马蜂柑
南川佛手
岭南沙田柚
F.hindsiSwingle
C.tachibana(Mak.)Tanaka
C.indicaTanaka
C.reticulataBlanco
C.medicaL.
C.reticulataBlanco
C.hystrixDC
C.medicaL.
C.grandis(L.)Osbeck.
表1 试验材料
Table1PlantmaterialsusedforSSRanalysis
物[9-10],因此,根据前人的研究基础,从公开发表的柑
橘属SSR引物序列中选择了22对引物[11],从中选出
了条带清晰,多态性好,适合本材料的 SSR引物 14
对。
图1 引物CAG01的SSR扩增结果
M为pBR322DNA/MspⅠMarkers,1～18为不同材料的编号,详见表1。
Fig.1TheSSRamplifiedprofileusingtheprimerCAG01
MispBR322DNA/MspⅠMarkers,1～18isthenumberofmaterials,seethetable1.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617 18
1.2 方法
1.2.1 总 DNA的提取 取刚展叶还未完全转绿的
幼嫩叶片,冰盒封存,带回实验室洗净后-20℃保存。
参考熊光明[12]的方法提取总DNA,并略有改进。0.8%
琼脂糖凝胶电泳,并与已知浓度的 λDNAMarker进
行对比检测纯度及完整性,调整浓度至10mg/L。
1.2.2 SSR及其产物的检测 PCR反应所用试剂均
为上海生工生物工程公司产品,所用引物及序列见
表2。采用20μL反应体系,各组分终浓度分别为:
1×bufer,2.5mmol/LMgCl2,2.5mmol/LdNTPs,上游
引物和下游引物各 0.2μmol/L,TaqDNA聚合酶
1.5U,模板 10ng,补充 ddH2O至 20μL。扩增反应
在 EppendorfMastercyclergradientPCR仪上进行。
PCR扩增程序为:94℃3min;94℃1min,53℃1min,
72℃1min,35个循环,72℃10min。结束后取 5μL
扩增产物在 9%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,电
压为320V,缓冲液为1×TBE。电泳至二甲苯青距电
泳槽下缘2/5,电泳完毕,银染,照相。
1.2.3 数据处理 对扩增图谱进行数据统计,强反
应带记“1”,弱反应带重复出现记“1”,弱反应带出现
但不重复记“0”,无带记“0”,获得矩阵,将矩阵用
NTSYS-PC软件进行数据分析,相似性系数采用
Dice系数,选用UPGMA法进行聚类分析。
2结果与分析
2.1 SSR扩增结果
利用筛选出的14对引物进行扩增,均产生出稳
定的扩增带,大小为100～1400bp(图1)。14对引物
共扩增出275个位点,平均每对引物的扩增带纹数
为19.7条,多态性位点 240个,多态率为 89.1%,其
中金柑属内多态率为 62.2%。从以上数据中可知,
SSR的多态性条带检出率较高。14对引物产生的稳
定多态性产物(表2)。
2.2 供试材料间亲缘关系的聚类分析
336
3期
表2 PCR引物序列及扩增结果统计
Table2PCRPrimersandthestatisticofSSRamplificationresult
引物
Primer
上游序列
F-Primer
下游序列
R-Primer
扩增条带数
Totalbands
多态性条带数
Polymorphicbands
多态位点百分率
Rateofpolymorphicloci(%)
CAC33
CT02
GT03
CT19
CTT01
CAG01
CAGG9
TAA27
TAA15
TAA41
CAC23
CAC15
CAC39
TAA33
Total
GGTGATGCTGCTACTGATGC
ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG
GCCTTCTTGATTTACCGGAC
CGCCAAGCTTACCACTCACTAC
TCAGACATTGAGTTGCTCG
AACACTCGCACCAAATCCTC
AATGCTGAAGATAATCCGCG
GGATGAAAAATGCTCAAAATG
GAAAGGGTTACTTGACCAGGC
AGGTCTACATTGGCATTGTC
ATCACAATTACTAGCAGCGCC
TAAATCTCCACTCTGCAAAAGC
AGAAGCCATCTCTTCTGCTGC
GGTACTGATAGTACTGCGGCG
CAATTGTGAATTTGTGATTCCG
TGACTGTTGGATTTGGGATG
TGCTCCGAACTTCATCATTG
GCCACGATTTGTAGGGGATAG
TAACCACTTAGGCTTCGGCA
TAAATGGCAACCCCAGCTTTG
TGCCTTGCTCTCCACTCC
TAGTACCCACAGGGAAGAGAGC
CTTCCCAGCTGCACAAGC
ACATGCAGTGCTATAATGAATG
TTGCCATTGTAGCATGTTGG
GATAGGAAGCGTCGTAGACCC
AATTCAGTCCCATTCCATTCC
GCTAATCGCTACGTCTTCGC
21(21)
48(44)
23(14)
19(17)
18(16)
19(12)
13(10)
15(9)
23(20)
19(13)
11(11)
17(16)
12(10)
18(18)
275(231)
19(13)
45(32)
23(12)
18(13)
12(10)
19(11)
11(7)
11(4)
22(14)
18(12)
10(9)
12(8)
11(9)
11(11)
242(165)
90.5(61.9)
95.8(72.7)
100.0(85.7)
90.5(76.5)
66.7(67.5)
100.0(91.7)
84.6(70.0)
73.3(44.4)
95.7(70.0)
90.5(92.3)
90.9(81.8)
70.6(50.0)
91.7(90.0)
61.1(61.1)
95.3(71.4)
注:括号里的数字是不包括柑橘属材料的统计结果。
Note:ThestatisticnumberinthebracketdoesntincludingCitrus.
图2 根据SSR结果计算的不同材料间亲缘关系聚类图
Fig.2GeneticrelationshipofdiferentmaterialsgeneratedfromSSRdata
利用以 275条 SSR带纹所得的遗传相似性矩
阵,经过聚类分析构建供试材料的亲缘树状图(图
2)。本研究显示金柑属不同材料的相似性系数 为
0.682～0.922,而与近缘柑橘属的相似性系数也在
0.661以上,显示了柑橘属与金柑属的亲缘关系很
近。
温州罗浮F.margaritaSwingle
蓝山金柑F.crassifoliaSwingle
宁波金弹F.crassifoliaSwingle
融安金弹F.crassifoliaSwingle
温州金弹F.crassifoliaSwingle
浏阳金柑F.crassifoliaSwingle
宁波罗纹F.japonicaSwingle
宁波罗浮F.margaritaSwingle
金豆F.hindsiSwingle
长寿金柑F.obovataTanaka
合江佛手C.medicaL.
南川佛手C.medicaL.
立花橘C.tachibanaTanaka
印度酸橘C.indica(Mak.)Tanaka
道县野橘C.reticulataBlanco
莽山野橘C.reticulataBlanco
马蜂柑C.hystrixDC
岭南沙田柚C.grandis(L.)Osbeck.
0.920.860.790.730.66
10份金柑属材料在相似性系数为 0.69处聚在
一起,与柑橘属区分开来。金柑属内,在相似性系数
为 0.82处又可以划分为 6类。Ⅰ:长寿金柑;Ⅱ:金
豆;Ⅲ:温州罗浮;Ⅳ:宁波罗浮;Ⅴ:宁波罗纹;Ⅵ:蓝
山金柑,宁波金弹,融安金弹,温州金弹,浏阳金柑。
Swingle认为宁波金弹与长寿金柑都是杂种,不能作
种看待,而相反,田中则给予种名。本研究得出的树
状图表明长寿金柑与其他金柑属材料亲缘关系较
远,而与柑橘属较近,支持长寿金柑种的地位,这也
支持它是金柑属与宽皮柑橘类杂种的说法[1,13]。蓝山
金柑、宁波金弹、融安金弹、温州金弹、浏阳金柑在相
似性系数为0.85处聚在一起,证明了它们是同一个
张连峰等:金柑属及其近缘属植物亲缘关系的SSR分析 337
种的不同栽培种的观点[1]。
在柑橘属中,聚类情况较为复杂,各材料间亲缘
关系较远,充分反映了柑橘属植物遗传背景复杂的
特点。但也可以大致分为3大类,即Ⅰ:合江佛手,南
川佛手(枸橼类);Ⅱ:岭南沙田柚(柚类);Ⅲ:马蜂柑,
莽山野橘,道县野橘,印度酸橘,立花橘(宽皮柑橘
类)。这与Scora等人把柑橘属划分为枸橼、柚与宽
皮柑橘3个基本种相一致。
3 讨 论
本研究建立了一个成熟的金柑属种质的 SSR
标记分析系统,并用SSR标记技术分析了中国农业
科学院柑橘研究所种质资源圃全部 10份金柑属种
质及8份柑橘属种质。
金柑属内,蓝山金柑与宁波金弹相似性系数高
达0.922,显示出了它们之间具有极高的亲缘关系,
初步推测它们可能是同种异名或者是发生了点突
变,具体原因,有待于更深入的研究。宁波罗纹与宁
波罗浮的相似性系数比宁波罗浮与温州罗浮的相似
性系数要高,初步推测因为它们来自同一个地方,而
且杂交可育,导致了遗传物质的交流,而传统分类学
主要是依据形态学为标准进行的划分,形态上的表
现只是部分遗传物质的表达,从而造成分子标记技
术分类和传统分类存在分歧。具体原因,还有待于结
合其他的研究方法进行深入的研究。这也为如何结
合利用传统的分类方法提供了一个新的思路。
柑橘属内,枸橼类的南川佛手和合江佛手明显
和其它材料区分开来,显示出较远的亲缘关系。马蜂
柑虽然归类于宽皮柑橘类,但是和本类其它材料的
相似性系数很低。熊光明等[12]研究指出马蜂柑的起
源与大翼橙和枳属有关,传统的分类学也证明,马蜂
柑是宽皮柑橘类中一个比较原始的种。总之,本试验
结果显示,所取的柑橘属内各个材料之间,亲缘关系
都相差较远,显示了柑橘属植物遗传背景复杂的特
点。
鉴于柑橘属植物种类繁多,而本试验所选取的
柑橘属材料样本比较少,其各物种之间的亲缘关系
及遗传起源还需要进一步研究。
4 结 论
本研究所有材料的传统研究结果与 SSR数据
分析结果存在较高的相关性,指出宁波罗纹与宁波
罗浮之间的亲缘关系非常近,支持传统分类学对金
柑属种质6个类群的划分,支持长寿金柑为金柑与
宽皮柑橘的杂交种的结论;证明可用部分柑橘属
SSR引物进行金柑属种质资源分析。
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果 树 学 报 23卷338