全 文 ：果 树 学 报 2011，29（1）: 1~5
Journal of Fruit Science
单胚槾橘×多胚岩溪晚芦椪柑多胚种子的胚分离
培养及后代的叶形态和 SSR鉴定
彭祝春，龚桂芝，马喜军，洪棋斌 *
（中国农业科学院柑桔研究所·国家柑桔工程技术中心， 重庆 400712）
摘 要: 继首次报道单胚清见与多胚椪柑杂交产生高比例多胚种子后，在单胚槾橘（Citrus tardiferax Hort. ex Tan）与
多胚岩溪晚芦椪柑（Citrus reticulata Blanco）的杂交组合中，又发现高比例多胚种子，其比例一般为 30%左右。 为探明
多胚来源，对多胚进行了分胚组织培养，获得同一种子来源的多胚苗。选取多组多胚苗进行叶形态比较分析。结果表
明，同种子来源的多数多胚苗及亲本间叶形指数差异显著，但 5 胚苗中有 3 株跟母本相似，难以判断来源。 筛选来自
9 个柑橘不同连锁群上的特异 SSR 引物对多胚苗进行标记分析，结果显示，多胚苗在多个标记上与母本不同，不可能
为无性后代（珠心胚来源），均可能是有性苗；同组多胚苗之间既有部分在全部检查位点完全相同，表明其可能由同
一合子胚分裂而来，也有部分在多个检查位点明显不同，可能来源于多卵受精形成的不同合子胚。
关键词: 柑橘； 多胚； SSR； 胚培养
中图分类号：S666．2 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)01－0001－05
In vitro culture and identification of polyembryos from polyembryonic
seeds in Manju × Yanxiwanlu Ponkan by leaf morphology and SSR anal-
ysis
PENG Zhu-chun， GONG Gui-zhi， MA Xi-jun， HONG Qi-bin*
（Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Citrus Engineering Research Center， Chongqing 400712
China）
Abstract: Following the first report of high ratio polyembryonic seeds in monoembryonic Kiyomi ×
polyembryonic Ponkan， polyembryonic seeds were found in the cross monoembryonic Manju （Citrus
tardiferax Hort. ex Tan） × polyembryonic Yanxiwanlu Ponkan （C. reticulata Blanco） also. The ratio of
polyembryonic seeds was about 30% generally. To investigate the origin of polyembryos， the embryos from
polyembryonic seeds were cultured in vitro. Polyembryonic seedlings from one seed were selected and
analysed by leaf morphology and SSR markers. The result of leaf morphology analysis showed that most of
the polyembryonic seedlings were significantly different to both parents and indicated zygotic origins， but
three seedlings in the 5 seedlings group were similar to the seed parent and it is difficult to determine their
origins. Nine specific SSR markers from different citrus linkage groups were screened and used in SSR
analysis. Four or more markers were found to show different band patterns among all polyembronic
seedlings and seed parent. And it indicated that all seedlings were most likely to be sexual origins. Some of
the polyembronic seedlings from one seed were identical to all tested markers and others were different in
more than one marker. And this might indicate their different zygotic embryos origins， splitting of zygotic
embryos or fertilization of more than one egg.
Key words: Citrus； Polyembryony； SSR； Embryo culture
收稿日期： 2011－04－22 接受日期: 2011－09－20
基金项目： 重庆市自然科学基金（CSTC，2010BB1156；CSTC，2009BB1311）
作者简介： 彭祝春，男，助理研究员，主要从事柑橘遗传育种及分子生物学研究。 E-mail: pzch9335@sina.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 023-68349025，E-mail:qibinhong@163.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.01.009
果 树 学 报 29 卷
许多柑橘类型的种子都会出现多胚现象， 多胚
只是一个数量上的描述， 究其遗传来源则可划分为
有性胚和无性胚，有性胚由受精卵发育而来，无性胚
由珠心组织发育而来。 一般的柑橘多胚类型是有性
胚和无性胚兼而有之， 但有时由于无性胚与有性胚
的营养竞争，在数量、位置、发生时间的先后和遗传
活力等条件上占优，导致有性胚早夭，最后仅有无性
胚存在[1]。少数柑橘多胚类型也可能完全由有性胚发
育而来，通常由多卵受精发育而来，但也不排除同卵
裂生多胚的可能性[2]。 有性类型的多胚，其发生的比
例较低， 即多胚种子占全部种子的比例一般不超过
6%或 7%[3]，但也有例外，洪棋斌等[4]报道了单胚清见
与椪柑杂交产生约 30%高比例多胚有性种子的现
象。
柑橘杂交育种通常需要选择杂种后代进行培
育，但珠心胚与合子胚区分有时并不容易，早期主要
采用形态学、生理生化等方法进行鉴定，容易受到环
境等因素的影响，随着分子生物学的发展，研究者开
始用分子标记技术来鉴别有性多胚 [4-7]，若再结合形
态学的分析比较则能提供更直观、 准确的鉴定， 曹
立等 [8]为培育耐碱杂种砧木，采了用形态学与 SSR
标记相结合的方法， 鉴定出资阳香橙×枳的 F1群体
杂种真实性。
在对杂交种子常规调查分析中， 我们发现单胚
槾橘与多胚岩溪晚芦椪柑杂交组合出现了高比例的
多胚种子，为了弄清多胚的来源，对多胚种子进行了
分胚组织培养， 以获得尽量完整的同一种子来源的
多胚苗，再选择代表性的多胚苗进行叶形态观察，并
从已构建的柑橘连锁图谱不同连锁群上筛选特异
SSR的标记进行尽量全面而有代表性的分析， 以判
断多胚的来源。
1 材料和方法
1.1 材料
杂交亲本材料， 母本为槾橘 （Citrus tardiferax
Hort. ex Tan）， 单胚； 父本为岩溪晚芦椪柑（Citrus
reticulata Blanco），多胚，均来源于中国农业科学院
柑桔研究所国家柑橘种质资源圃。 用于胚培养的槾
橘×岩溪晚芦椪柑杂交组合于 2007年完成， 胚培养
苗同年秋季定植到田间。
1.2 方法
1.2.1 多胚苗的离体培养 将成熟的杂交果实采收
后用清水洗净晾干， 用 75%酒精消毒果实表皮，再
用手术刀片在超净工作台上切开果实， 取出种子后
放在消毒过的脱脂棉片上小心剥去种皮， 然后将完
整的多胚种子放在试管中的 MS 培养基上 28 ℃暗
培养 1 周，待种胚分离后在光照培养箱里，光照度
2 000 lx，光照 13 h·d-1继代培养 30～60 d，将长势较
弱的多胚苗进行试管微嫁接继代，参照彭爱红等[9]的
方法， 然后将嫁接后的多胚幼苗在光照培养箱里继
续培养，多胚幼苗长到 10 cm左右定植田间保存。
1.2.2 叶形分析 选取亲本及定植的多胚苗春梢上
中部叶片 20枚，观察叶片形状、翼叶等形态，测量叶
片长宽，计算叶形指数，并用 Microsoft Excel 软件进
行方差分析。
1.2.3 DNA 提取及 SSR 分析 参照龚桂芝等 [10]的
提取方法，用 CTAB 法提取试验材料 DNA，提取的
DNA 用消毒双蒸水溶解， 加 RNaseA 至终浓度 20
μg·L-1，37℃恒温水浴 24 h 除去 RNA， 琼脂糖凝胶
电泳检测 DNA 质量， 条带清晰明亮的再用 Bio-rad
核酸蛋白仪测定 DNA含量， 要求每个样品 DNA 含
量在 400 mg·L-1以上，A260/A280 在 1.8 左右，否则
重新提取。
SSR引物来源见文献[11]，由上海英骏生物工程
公司合成。 核基因组 SSR 扩增采用 20 μL 反应体
系，各组分终浓度为: 25～50 ng 总 DNA、1×buffer、1.5
mmol·L-1 MgCl2，0.2 mmol·L-1 dNTP，上游引物和下游
引物各 0.2 μmol·L-1，TaqDNA 聚合酶 1 U。 PCR 扩
增反应在 Biometra公司生产的 PCR仪上进行。采用
Touch-down PCR扩增程序进行扩增， 具体为: 94 ℃
预变性 4 min；94 ℃ 45 s，起始退火温度 60～56 ℃ 45
s，72 ℃ 45 s，每循环降 0.5 ℃，10 个循环；94 ℃ 45 s，
56～52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，24 个循环 ；72 ℃延伸 5
min；4℃保存。退火温度根据相关引物的 Tm值进行
调整。 扩增产物用 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检
测。
2 结果与分析
2.1 杂交种子的胚性调查
经连续 3 a（2006—2008 年）的调查分析，槾橘×
岩溪晚芦椪柑产生的杂交种子中， 单胚种子与多胚
种子的比例为 3∶1 左右，此结果与洪棋斌等 [4]（即以
多胚椪柑为父本单胚清见为母本杂交的种子产生高
比率的多胚，为 28.4%~44.2%）的结果类似。
2.2 多胚苗的胚分离培养
多胚苗的胚分离培养最简单的做法是沙培，当
多胚各胚的大小差异不大时，可以获得多胚苗，若多
胚各胚的大小差异较大， 小胚自身营养积累少或发
2
1 期
表 1 亲本及 5 胚苗叶形指数比较
Table 1 Analysis of phylliform index of parents
and 5 seedlings
表 2 用于鉴定的 9 个引物序列
Table 2 9 markers used for distinguishing the Citrus seedlings
彭祝春等: 单胚槾橘×多胚岩溪晚芦椪柑多胚种子的胚分离培养及后代的叶形态和 SSR 鉴定
育不充分，在分离培养初期长势较弱，抵抗力差，或
胚根黏在一起，不易成苗，较难完整分离获得同一种
子来源的多胚苗。 本试验中多胚种子的多胚大小一
般差异甚大，部分小胚仅有针头大小。作者进行了沙
培和组织培养结合锦橙实生试管苗为砧木进行微嫁
接繁殖的对比， 结果表明试管微嫁接繁殖分离成功
比率得以明显提高。沙培仅获得少数 2胚苗，而组培
方式除获得多个 2 胚苗外，还获得 3 组 3 胚苗，1 组
4胚苗，1组 5胚苗。 到现在为止，田间定植后，完整
存活了多个 2胚苗，2组 3胚苗，1组 5胚苗，但 4 胚
苗仅存活 2苗。
2.3 多胚苗的叶形指数差异比较
从叶形指数上看父母本（表 1、图版Ⅰ-A~B）间
差异显著， 在同一种子来源的多胚苗中， 仅 5 胚苗
（表 1、图版Ⅰ-1~5）中第 1、2、5 号株系与母本间差
异不显著，其余均与母本差异显著。 5胚苗中，第 1、
2、5 号株系与第 3、4 号株系差异显著， 但它们之间
无显著差异，第 3、4号株系与父本间差异不显著。 2
个 3胚苗（表 1-6~8、9~11）中， 6~8 号株系中 6、7 号
无显著差异， 但与 8号株系差异显著， 9~11号株系
差异显著。 3 个 2 胚苗（表 1-12~13、14~15、16~17）
间差异显著。
从上述叶形指数分析结果看， 除第 1、2、5 号株
系与母本无明显差异外，其余均可与母本明显区分，
可能为有性合子苗。
2.4 同种子来源的多胚苗 SSR标记检测分析
2.4.1 引物筛选 根据本课题组已构建发表的柑橘
遗传连锁图谱 [11]，以每个连锁群上定位的 SSR 标记
进行亲本及多胚苗样本筛选检测， 分别筛选出 1 对
特异 SSR 引物，每对引物在亲本及多胚苗间都能扩
增出清晰的条带， 筛选获得的 9个特异引物序列见
表 2。
2.4.2 亲本及多胚苗 SSR 标记检测分析结果 用
品名
Variety
叶形指数
Phylliform index
岩溪晚芦 Citrus reticulata Blanco
槾桔 Citrus tardiferax Hort. ex Tan
1 号株系 No. 1
2 号株系 No. 2
3 号株系 No. 3
4 号株系 No. 4
5 号株系 No. 5
6 号株系 No. 6
7 号株系 No. 7
8 号株系 No. 8
9 号株系 No. 9
10 号株系 No. 10
11 号株系 No.11
12 号株系 No. 12
13 号株系 No. 13
14 号株系 No. 14
15 号株系 No. 15
16 号株系 No. 16
17 号株系 No. 17
2.16±0.18 j
3.37±0.22 a
3.34±0.26 a
3.36±0.25 a
2.19±0.23 j
2.15±0.14 j
3.34±0.25 a
2.80±0.26 b
2.77±0.28 b
2.35±0.30 h
2.68±0.36 d
2.58±0.29 e
2.74±0.26 c
2.36±0.33 h
2.49±0.23 f
2.26±0.28 i
2.42±0.21 g
2.64±0.29 d
2.59±0.34 e
注: 同一列内相同字母表示 P≤0.05 差异不显著。
Note: Same letter in a column means no significant difference at 0.05.
引物编号
Code
标记位置
Markers in linkage group
引物序列 Primer sequences
正向 Forward primer 反向 Reverse primer
P1 （F97）
P2 （F16）
P3 （F23）
P4（CBMM10E2）
P5 （F50）
P6（CBDM14E2）
P7（F18）
P8（CBDM13E2）
P9（CMS4）
第 1 连锁群 LG1
第 2 连锁群 LG2
第 3 连锁群 LG3
第 4 连锁群 LG4
第 5 连锁群 LG5
第 6 连锁群 LG6
第 7 连锁群 LG7
第 8 连锁群 LG8
第 9 连锁群 LG9
cttcttcttctcctgctcctcctc
gtcttcaccctctccatcttcatc
ttttaggaaatttcaatcacccga
tatgcgtgcatgtttgta
aggacgatttcaggttcagacttg
ttgatgaggcaatttcag
gtcttcaacgaagttgcaggct
ttaataattccacccact
cctcaaaccttcttccaatcc
agtgagaagccaaaaacaccaaac
gggactatggcaacaataactcca
tcattgtcatcaccatcaccatc
ctcattatctgcgagacc
gagcaaaaatcgaagagatcaagc
acaggagaagccattaga
tactatttcgagagagcagcagca
aactacaaagcaacacct
ctgtaaagtacatgcatgttgg
特异的 SSR 引物分析亲本和多胚苗，在 9 个标记上
亲本（图版Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ-A，B）间带型均有差异，多胚苗
带型多样，既有与父母本类似的，也有重组类型的，
多胚苗之间既有完全一致的， 也有在多个标记上表
现明显差异的。 对同一种子来源的 1组 5 胚苗 （表
3、图版Ⅱ、Ⅲ-1~5）、2 组 3 胚苗（表 3、图版Ⅳ-6~8、
9~11）和 3 组 2 胚苗（表 3、图版Ⅳ-12~13、14~15、
16~17）在 9 个标记上的带型做了统计（表 3），限于
篇幅的原因本文只提供了亲本和 5胚苗在全部 9 个
标记以及 3 胚苗和 2 胚苗在 P2、P3 和 P6 3 个有明
显差异的标记的电泳图片。
5 胚苗中，在 9 个标记上 3、4 号株系带型相同，
但跟母本和 1、2、5 号株系有明显差异；1、2 号和 5
号的带型相同，但在 4 个标记（P1、P3、P6 和 P8）上
与母本带型不一样。在 2组 3胚苗中，6~8号 3胚苗
组的 6 和 7 号株系在全部 9 个标记上带型相同，在
3
果 树 学 报 29 卷
表 3 9 个 SSR 引物在亲本和同种子多胚苗后代中扩增结果
Table 3 SSR patterns of the parents and polyembryonic seedlings originated from one seed
6 个标记上带型与 8 号相同但与母本不同， 在其余
标记（P2、P3和 P6）上与 8 号和母本均不相同； 9~11
号株系 3胚苗组的 10和 11号株系带型在全部 9 个
标记上带型相同，在 2 个标记（P3 和 P6）上与 9 号
株系带型不相同， 整组 3 胚苗在 4 个标记（P1、P3、
P6 和 P8）上与母本带型不同。 在同一种子来源的 3
个 2 胚苗中，12~13 号株系在 4 个标记上有明显差
异（P1、P2、P3 和 P6），在其余 5 个标记上带型相同
（其中 P4、P8、P9与母本不同）；14~15 号株系在 3 个
标记 P2、P3、P4 带型有明显差异， 这些差异带中 14
号株系带型在 P2、P4 标记上与母本带型相同，其他
均与母本有明显差异， 在其余 6个标记上带型相同
（其中 P1、P6、P7、P8 与母本不同）；16~17 号株系在
2 个标记 P4、P5 带型有明显差异，这些差异带中 17
号株系带型与母本相同，16 号株系与父本相同，在
其余 7 个标记上带型相同 （其中 P1 株系、P3、P6、
引物
Primer
父本
Male
母本
Female
5 胚
Five embryos
3 胚
Three embryos
3 胚
Three embryos
2 胚
Two embryos
2 胚
Two embryos
2 胚
Two embryos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
S
B
S
B
B
S
B
S
B
S
B
S
B
B
S
B
S
B
S*
A
S*
A
A
A
A
S*
A
S*
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A
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A
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S
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S
A
S
A
A
S
A
S
A
S
B
S*
A
A
A
A
S
A
S
B
S
B
B
A
B
S
B
S
B
S**
B
B
S
B
S
B
S
B
S**
B
B
S
B
S
B
S*
A
S***
A
B
S
B
S
A
S
B
S
A
B
A
B
S
A
S
B
S***
B
B
S
A
A
B
S
A
S
A
B
S
A
A
B
S
B
S**
A
A
S
A
S
B
S
B
S**
B
B
S
A
S
B
注: A. 父本带型； B. 母本带型；S* ，S** ，S*** 和 S. 其他带型。
Note: A. Male band pattern； B. Female band pattern； S* ，S** ，S***and S. New band pattern.
P7、P8与母本不同）。
由上述结果可见， 多胚苗在多个标记上与母本
不同，不可能为无性后代（珠心胚来源），均可能是有
性苗； 同组多胚苗之间既有部分在多检查位点完全
相同，表明其可能由同一合子胚分裂而来，也有部分
在多检查位点明显不同， 可能来源于多卵受精形成
的不同合子胚。
3 讨 论
柑橘的多胚来源复杂，主要来源于珠心胚，也可
能是多卵受精或裂生多胚[12]。 对珠心胚与合子胚的
遗传鉴定，已有众多的研究报道，既有简单的形态鉴
定，形态鉴定与同工酶鉴定结合 [13]，也有 RAPD 与
EST-SSR鉴定[7，14]，但对多卵受精或裂生多胚的现象
报道不多，而相关鉴定研究则更少报道。在以清见为
母本开展杂交育种中，洪棋斌等[4]发现单胚的清见在
一般杂交组合中仅产生单胚种子或很低比例的多胚
种子， 但在特定组合中稳定地出现高度多胚种子的
现象。 为了探明多胚种子的来源，以清见×新 3号椪
柑的多胚种子进行了分胚培养， 获得了多个双胚苗
并进行 RAPD分析， 发现多数双胚苗具有父本的特
征带或具有与母本明显不同的带型， 并且这些双胚
苗之间还存在差异谱带， 推测可能为多卵受精发育
而来。但由于用沙培方法培养多胚种子时，许多小胚
没能培养成苗， 而且多个胚的胚根有可能融合到一
个根系上，不易分开，获得的多胚苗多数是双胚苗，
没能尽量全面的获得多胚后代， 而且所采用的分子
标记为 RAPD，其本身为显性标记，稳定性和重复性
不及 SSR 等新型标记，影响了对有性多胚来源的更
准确推断。
在以单胚槾橘为母本开展的杂交育种中， 本研
究小组发现了与清见杂交类似的现象， 但所获得的
多胚种子是否有相似来源，多胚产生的机理如何，尚
需要进一步探讨。因此对单胚槾橘×多胚岩溪晚芦椪
柑杂交组合中的多胚种子进行了分胚组织培养，再
结合试管微嫁接的方法， 使得多胚种子的每一个胚
都尽可能成苗， 尽量全面的获得了同一种子来源的
多胚后代， 同时采用柑橘连锁图谱不同连锁群上特
异的 SSR 标记，从多个不同代表性位点进行遗传分
析，理论上可更为准确全面地反应试材的遗传特点。
柑橘的珠心胚是由珠心组织发育形成， 其遗传
组成理论均应该与母本完全一致， 因而只要发现后
代与母本有明显遗传差异，均可否定为珠心来源，但
判断有性多胚的来源则相对困难， 尤其是对有性胚
裂殖的判断，即使枚举再多的相似性，也难以否定它
们之间是否还存在不同。 本研究通过 9个 SSR标记
对 1 组 5 胚苗、2 组 3 胚苗和 3 组 2 胚苗的分析，首
先肯定了所有研究的多胚均可能为有性胚， 其次通
4
1 期 彭祝春等: 单胚槾橘×多胚岩溪晚芦椪柑多胚种子的胚分离培养及后代的叶形态和 SSR 鉴定
过各组多胚苗内部的比较， 发现多胚苗之间既有一
致性， 在所有检测标记上完全一致， 也有明显的不
同， 表明多卵受精和有性胚的裂殖可能同时对柑橘
有性多胚的产生有作用。
4 结 论
本研究报道了一个新发现的单胚母本杂交产生
高比例多胚种子的杂交组合， 采用组培结合试管微
嫁接方法培养多胚种子的胚， 尽量全面的获得同一
种子来源的多胚后代， 以柑橘 9个不同连锁群特异
的 SSR 标记对多胚来源进行鉴定，鉴定表明多胚均
可能为有性胚， 初步明确多卵受精和有性胚的裂殖
可能同时对柑橘有性多胚的产生有影响。 （本文图
版见插 2）
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