全 文 ：2015年第 3期东南园艺
收稿日期：2014-12-11
作者简介：张宏梓（1970-），男，高级工程师，从事经济林、森林资源培育工作
芸香科 （ Rutaceae） 金柑属的金柑 （ For－
tunella crassifolia Swingle） 亦称金弹、宁波金柑、
美华金柑 （Meiwa Kumquat），原产于中国，已有
1600多年的栽培历史 [ 1-2 ]。F. crassifolia为 F. mar－
garita（金橘） 与 F. japonica（金柑） 的杂交种 [3]，
也是目前金柑属中鲜食及加工综合品质最佳的主要
栽培种 [3]，我国南方各省区广为栽植，其中江西遂
川、广西阳朔、福建尤溪、浙江北仑、湖南浏阳等
为主产区。
金柑优株初选采用的是传统育种手段，是利用
现有种类、品种群体的自然优良变异类型，通过选
择的手段从现有金柑群体中选取符合育种目标性状
的类型，通过比较、鉴定培育出新品种。该方法需
经过品种收集、筛选、试点栽培、综合评定等，投
入大、耗时长。RAPD标记技术作为现代分子生物
学研究的重要手段之一，具有样品用量少、检测效
率高、操作简便、灵敏度高、费用低等优点，在分
子生物学研究的各个领域已得到广泛应用。本研究
应用 RAPD技术对初选的金柑不同优良单株进行分
子标记，以期从分子水平上对金柑不同优良单株进
金柑不同优良单株的RAPD分析
张宏梓
（福建省尤溪县林业科技推广中心，福建 尤溪 365114）
摘 要：应用 RAPD技术对初选的金柑 24个不同优良单株进行 RAPD分析，揭示其亲缘关系和遗传多样性，以
期从分子水平上对金柑不同优良单株进行分类鉴定，并结合不同优良单株的特性，筛选高品质的品种，从而提高
育种效率、扩展育种目标。研究结果表明，少核与无核品种（10个单株） 均聚于 I类，早熟品种（4个单株） 除
样株 125外，均聚于 II类，滑皮品种（5个单株） 除样株 233外，同聚于 Ib 亚类，说明 RAPD标记与金柑果实核
的多寡、皮的糙滑等表型性状，以及早熟与否之间存在一定的相关性。但在筛选的 17个随机引物标记中，没有发
现与金柑果实表型性状以及早晚熟相关的特异位点。
关键词：金柑；育种；优良单株；RAPD
RAPD Analysis of Different Superior Lines of Kumquat
ZHANG Hong-zi
(Youxi Forestry Science and Technology Center, Fujian Province, Youxi 365114,Fujian China)
Abstract: In our paper genetic relationship and diversity of 24 superior lines of kumquat were revealed by RAPD analysis
in order to classify and identify them at molecular level and screen high quality varieties for high effciency breeding and
more breeding aims. The results showed that few seed and seedless varieties including ten lines were clustered into I
branch; early maturing vaireities (Four lines) were cluested into II branch except sample 125; varieties with smooth peel
(Five lines) were clustered into Ib sub-branch except sample 233. It showed that there were certain relations between
RAPD analysis and some phenotypic characters such as seed number, peel smoothness and early maturing. However, there
was no specific locus of screened 17 random primers related to phenotypic characters and early maturing of fruits.
Key words: Kunquat;Breeding; Superior lines; RAPD
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行分类鉴定，揭示其亲缘关系和遗传多样性，并结
合不同优良单株的特性，筛选高品质的品种，从而
提高育种效率、扩展育种目标。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试金柑叶片分别采自尤溪县管前、八字桥等
村初选的 24株金柑优树，样本详情见表 1。
表 1 供试金柑样本
序号 样株号 特征 单果重（g） 可溶性固形物含量（%）
1 011 对照 16.5 15.2
2 012 对照 16.9 15.7
3 102 无核 21.5 18.0
4 120-1 对照 18.0 15.4
5 103 少核 22.6 18.7
6 104 少核 22.5 18.9
7 124 丰产 23.2 15.0
8 125 早熟 25.1 15.3
9 136 少核 16.4 13.6
10 207 少核、滑皮 24.4 19.2
11 208 少核、滑皮 22.4 18.9
12 209 少核、滑皮 21.1 19.8
13 209-1 少核、嫁接、滑皮 20.8 19.7
14 211 少核 13.4 21.1
15 211-1 少核、嫁接、高糖 13.5 21.0
16 212 对照 19.5 15.2
17 213 对照 19.9 14.8
18 232 大果 20.1 15.6
19 233 滑皮 19.8 17.8
20 234 早熟 18.7 14.5
21 235 早熟 18.5 14.8
22 236 早熟、实生 18.9 14.8
23 302 对照 16.2 15.4
24 031 对照、盆景 16.8 15.5
1.2 叶片处理及保存
将野外采集的新鲜金柑嫩叶分别用自来水、蒸
馏水冲洗干净，滤纸吸干水分，称取 0.2 g，剪碎，
置预先灭菌的研钵中，加少量石英砂及 1.0 ml DNA
提取缓冲液，迅速研磨成浆状，再加 1.0 ml DNA
提取缓冲液，混匀后，分装于 2 个 1.5 ml 的离心
管，置冰盒中，带回实验室用于 DNA提取。
1.3 DNA提取及质量检测
从插枝上剪取金柑嫩叶，分别用自来水、蒸馏
水冲洗干净，滤纸吸干水分；称取嫩叶 200 mg，
剪碎后放入预冷的研钵中，加少量石英砂及 1.5 ml
核分离液 II [50 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0，50
mmol·L-1 EDTA，15% 蔗糖 (w/v)，2% PVP (w/v)，
2 % β-巯基乙醇 (w/v)]，迅速研磨成浆状，移至
2.0 ml离心管中，4℃ 5 000 r·min-1离心 5 min，弃
上清，沉淀再加 l ml核分离液 I，混匀，4℃ 5 000
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2015年第 3期东南园艺
r·min-1离心 5 min，弃上清，收集沉淀。
沉淀加 1 ml 65℃预热的 3.0×CTAB裂解液[100
mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0，25 mmol·L-1 EDTA，
1.5 mol·L-1 NaCl 和 3.0% CTAB (w/v)]，混匀，置
65℃水浴裂解 60 min；取出，冷却至室温，加 1/10
体积的 7.5 mol·L-1 NH4Ac，颠倒混匀，冰浴30 min；
取出 10 000 r·min-1离心 10 min，取上清；用等体积
的 氯 仿/异 戊 醇 ( v:v =24:1) 抽 提 3 次 ，
10 000 r·min-1离心 10 min，取上清，加 2倍体积预
冷的无水乙醇，混匀，置-20℃冰箱 2 h；取出，用
灭菌牙签挑出 DNA，用 70% 乙醇洗涤 2次，无水
乙醇洗涤 1次，自然风干后，溶于 100 μl TE（10
mmol·L-1 Tris-HCl，1 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0）。
所提 DNA样品的纯度和含量用紫外吸收和凝
胶电泳检测 [5]。
1.4 RAPD引物筛选
随机从提取的 24个 DNA样本中抽取 2个作为
模板，以优化的 RAPD体系 [4] （总反应体积 20 μl，
含 Mg2+ 2.5 mmol·L-1、dNTP 0.25 mmol·L-1、引物
0.30 μmol·L-1、模板 DNA 1.0 ng·μl -1，以及 1U Taq
DNA 聚合酶） 及扩增程序 （ 94℃预变性 180 s；
94℃变性 45 s，37℃复性 60 s，72℃延伸 120 s，循
环 45 次；72℃延伸 600 s，4℃结束），用 120 个
10 bp的寡核苷酸引物进行 PCR扩增，从中筛选扩
增条带清晰、重复性好、多态性高的引物，用于全
部样本的扩增。
1.5 金柑不同优良单株的 RAPD扩增
以金柑 24个不同优良单株的 DNA为模板，用
随机引物进行 PCR扩增，扩增产物经电泳、染色，
观察拍照，并存盘待分析。
1.6 数据处理
根据电泳结果，记录清晰可重复的 DNA电泳
条带，对同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带
记为一个位点，扩增有带记为 1，扩增无带记为 0。
将采集的数据输入 Excel 2 000，建立表征数据矩
阵，用于进一步分析。
以任一位点若有 1个或 1个以上个体不同于其
它个体即为 1个多态位点的原则，计算多态位点比
率 （ percentage of polymorphic loci，PPL）。应用
STATISTICA/Win v6.0软件计算金柑 24个不同优良
单株间的 Euclidean distances（欧氏距离），并进
行 UPGMA聚类分析。
2 结果与分析
2.1 RAPD引物筛选结果
120 个随机引物经筛选得到 17 个条带清晰，
重复性好的随机引物（表 2），用于金柑 24 个不
同优良单株的 RAPD扩增。
表 2 引物序列及其扩增条带数
引物
序列
（5→3） 扩增条带总数 多态条带数 引物
序列
（5→3） 扩增条带总数 多态条带数
S21 CAGGCCCTTC 10 6 S1403 TGGCGCACAC 8 4
S48 GTGTGCCCCA 9 3 S1404 GGCACGCGTT 8 4
S105 AGTCGTCCCC 9 3 S1407 GTAAACCGCC 8 1
S112 ACGCGCATGT 6 1 S1412 CCGTGACCGA 13 11
S147 AGATGCAGCC 7 1 S1414 AAGTGCGACC 10 1
S151 GAGTCTCAGG 5 2 S1416 CCCGGATGGT 5 2
S363 CCAGCTTAGG 16 11 S1418 CTGGCGTGTC 12 3
S367 AGCGAGCAAG 9 4 S1432 GGCGAGTGTG 8 4
S1214 CTCACAGCAC 9 2 合计 152 63
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图 3 引物 S1418对 24个金柑样本 RAPD扩增的带谱
M：100 bp ladder DNA；CK：空白对照；1～24：分别为 1～24号金柑样本
2.2 金柑不同优良单株的 RAPD扩增结果
经统计，筛选的 17个随机引物对金柑 24个不
同优良单株进行 RAPD扩增，共检测到 152个位点
（其中 63个为多态位点），不同引物检测到的位点
数介于 5～16，平均每个引物检测到的位点数为
8.94 个 （表 2）。图 1、2 和 3 分别为引物 S147、
S1414和 S1418对金柑 24个不同优良单株 DNA的
RAPD扩增带谱。
经计算，金柑 24个不同优良单株的 RAPD多
态位点比率为 41.45%，表明金柑不同单株的遗传
多态性较高。
图 1 引物 S147对 24个金柑样本 RAPD扩增的带谱
M：100 bp ladder DNA；CK：空白对照；1~24：分别为 1~24号金柑样本
图 2 引物 S1414对 24个金柑样本 RAPD扩增的带谱
M：100 bp ladder DNA；CK：空白对照；1~24：分别为 1~24号金柑样本
2.3 UPGMA聚类结果
应用 STATISTICA/Win v6.0软件计算的金柑 24
个不同优良单株间的欧氏距离值为 2.6～23.4，其中
样本 234（No.20） 与样本 235（No.21） 的距离
值最小（2.6），样本 011与样本 031的距离值最
大（23.4），表明金柑 24个不同优良单株间的遗
传分化较大。
图 4为基于 RAPD标记的金柑 24个不同优良
单株的 UPGMA 树系图。由图知，在欧氏距离约
9.0处，金柑 24个不同优良单株可聚为 2类：I类
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由 15个样本（No.1～No.15） 组成，此类包含所有
的少核及无核金柑 10 个单株 （ 102、103、104、
136、207、208、209、209-1、211和 211-1）；II
类由 9个样本（No.16～No.24） 组成，早熟金柑单
株 234（No.20）、235（No.21） 和 236（No.22）
归在此类。I类在欧氏距离约 6.0处，又可分为 Ia和
Ib 2个亚类：Ia亚类由 3个对照单株（No.1、No.2、
No.4），1 个无核单株 （No.3），3 个少核单株
（No.5、No.6、 No.9） 及 1个丰产单株（No.7） 和
1个早熟单株（No.8） 组成；Ib亚类的 6个单株
均为少核单株（No.10～No.15），且其中 4个单株
兼备滑皮性质（No.10～No.13）。同样在欧氏距离
约 6.0处，II类亦可划分为 2个亚类 IIa和 IIb：IIa
亚类包含 2个对照单株（No.16、No.17），1个大
果单株（No.18），和 1个滑皮单株（No.19）；IIb
亚类除 2个对照单株外（No.23、No.24），余下的
全为早熟单株（No.20～No.22）。
图 4 基于 RAPD标记的金柑 24个不同优良单株的 UPGMA树系图
3 小结与讨论
3.1 育种效率高
金柑传统的育种手段和方法包括选择育种、杂
交育种、诱变育种和多倍体育种等 [3]。近年来，体
细胞杂交育种技术在金柑育种中的应用也有报道
[5]。以分子标记为手段的辅助育种技术，不受环境
因素的影响，且可对育种杂交后代进行早期选择与
预测，从而提高选择效率，加快育种进程；与传统
方法相比，显示出明显的优越性。将 RAPD技术用
于金柑优株标记，可以从分子水平上揭示金柑不同
优良单株的亲缘关系和遗传多样性，并进行分类鉴
定；若与优良单株的特性相关联，可以筛选出高品
质的品种，从而提高育种效率。
3.2 单株间的遗传多态性与遗传分化
本研究筛选的 17个随机引物对金柑 24个不同
单株的 RAPD标记结果说明，金柑单株间存在较高
的遗传多态性 （ PPL 为 41.45%） 和遗传分化
（欧氏距离值为 2.6～23.4），这为金柑优株的选育
奠定了基础。
3.3 RAPD标记与金柑果实表型性状及早熟的相关性
基于 RAPD 标记的金柑 24 个不同单株的
UPGMA聚类结果表明，少核与无核品种（10个单
株） 均聚于 I类，早熟品种（4个单株） 除样本
125（No.8） 外，均聚于 II 类，滑皮品种 （5 个
单株） 除样本 233（No.19） 外，同聚于 Ib 亚类；
表明 RAPD标记与金柑果实表型性状（核的多寡、
皮的糙滑） 以及是否早熟之间存在一定的相关性。
但在筛选的 17个随机引物标记中，没有发现与金
柑果实表型性状以及早晚熟相关的特异位点，这可
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能与筛选的引物数量及引物序列有关。
致谢：福建师范大学生命科学院的黄儒珠教
授、黄丽峰和福建省尤溪县林业科技推广中心吴擢
溪教授级高工等同志参与本项目，谨此致谢。
参考文献：
[1] 黄成就编著. 中国植物志：第 43卷第 2分册[M]. 北京：科
学出版社，1997：169-174.
[2] 徐建国，林大盛. 宁波金柑东渡日本史考[J]. 中国农史，
1999，18(1)：97-101.
[3] 黄桂香，何静编著. 金柑优质高效栽培[M]. 北京：金盾出版
社，2006：7-11.
[4] 张宏梓，黄儒珠，吴擢溪,等. 金弹总 DNA提取及 RAPD体
系优化[J].亚热带植物科学，2009,38（1）:7-11.
[5] 史永忠，邓秀新，伊华林. 伏令夏橙与宁波金柑属间体细胞
杂种变异研究[J]. 植物学报，1998，40(11)：1060-1066.
（责任编辑：林燕金）
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香瓜着色不良及甜度不佳的原因
塑料大棚栽植的香瓜，即将大量上市。每个购
买者都希望买到色泽好、又甜又脆的香瓜，尤其是
种植香瓜的农民，更希望自己种植的香瓜得到购买
者的喜欢，卖个好价钱。目前市场上销售的香瓜确
实有的色泽和甜度都较差，在销售价格上要比优质
香瓜少卖 20―50％。究竟是什么原因造成香瓜色泽
差又不甜呢？其主要原因有以下几点：
1、品种选择不当。香瓜的甜度与种性有关，
在种植香瓜时一定要选择优质品种。
2、整枝过重，壮龄叶比重太小，果实成熟至
糖分积累期养分供应不足，植株早衰，叶片老化，
减弱或失去制造养分的能力，果实表皮细脆为了维
持自身发育代替叶片制造养分，到成熟时果皮。表
面叶绿素的合成量大于分解量，使果皮细胞中含
有，大量的叶绿素，不能转黄，因此色泽不佳，甜
度也差。
3、全株保留的叶片数太少，果实基本裸露在
外，果面大部分接受直射光照射，易引起果实温度
升高，抑制黄色的类胡萝卜素合成。直射光有利于
绿色的叶绿素合成。散射光有利于黄色的类胡萝卜
素合成，背阴果因接受散射光较多，首先表现类胡
萝卜素的黄色，所以，被叶片遮盖的果实着色好。
4、水肥施用不当。在香瓜座果后期，即上市
前 10天，不特别干旱，不要浇水，浇水会使香瓜
的甜度明显降低。香瓜在生长期间要特别注意增施
钾肥，钾肥有明显的改善香瓜品质的作用。要控制
氮肥，氮肥施用过量不但会使香瓜甜度降低，还会
使亚硝酸盐积累过多，对人体有危害。对香瓜的施
肥应掌握控氮、施磷、增钾的原则，做到氮、磷、
钾配合施用。为了使香瓜甜度增加，在收获前 10
天可叶面喷施磷酸二氢钾或保丰灵等增甜剂，也可
喷施 10％浓度的白糖。
（来源：中国水果蔬菜网）
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