全 文 ：华北农学报·2016，31(4):80 -87
收稿日期:2016 － 04 － 12
基金项目:四川省科技支撑计划项目(2011NZ0034);四川省科技厅基金项目(10ZC1454)
作者简介:曹淑燕(1991 －)，女，山东滨州人，在读硕士，主要从事果树栽培理论与技术研究。
通讯作者:汪志辉(1968 －)，男，四川眉山人，教授，博士，主要从事果树栽培理论与技术研究。
不同砧木对黄果柑果实有机酸含量和酸代谢相关酶
活性及基因表达的影响
曹淑燕1，荣 毅1，古咸杰1，李清南1，廖 玲1，叶 霜1，邱 霞1，汪志辉1，2
(1．四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130;2．四川农业大学 果蔬研究所，四川 成都 611130)
摘要:为了探究不同砧木对黄果柑果实有机酸含量、酸代谢相关酶活性及基因表达的影响，为黄果柑砧木的选择
提供理论依据。以枳壳、红橘、香橙为砧木，黄果柑实生苗为对照进行研究。黄果柑果实以积累柠檬酸为主，香橙砧
能够最有效地降低果实有机酸含量，成熟期比实生苗低 24． 35%;嫁接能够一定程度的降低 CS活性，而对 PEPC、MDH
活性的影响较小;花后 250 ～ 330 d，ACO和 NADP-IDH活性均表现出香橙砧 ＞枳壳砧 ＞红橘砧 ＞ CK 的趋势;除实生
苗外，黄果柑 NADP-IDH表达水平与总酸含量间呈显著性负相关，而 CS、MDH、ACO与总酸含量均未表现出显著相关
性。香橙是黄果柑理想的砧木品种，砧木间果实有机酸差异是 ACO 和 NADP-IDH 活性共同作用的结果，且 NADP-
IDH基因的表达可能是影响不同砧木黄果柑果实中有机酸含量的关键限制因子。
关键词:黄果柑;砧木;有机酸;酶活性;基因表达
中图分类号:S666． 9;Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2016)04 － 0080 － 08
doi:10． 7668 /hbnxb． 2016． 04． 014
Effects of Different Ｒootstocks on Huangguogan Fruit Organic Acid Content，
Acid Metabolism-related Enzyme Activity and Gene Expression
CAO Shuyan1，ＲONG Yi1，GU Xianjie1，LI Qingnan1，LIAO Ling1，
YE Shuang1，QIU Xia1，WANG Zhihui1，2
(1． College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China;2． Institute of
Pomology and Olericulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)
Abstract:In order to explore the effects of different rootstocks on fruit organic acid，acid metabolism-related
enzyme activities and the gene expression，to provide theoretical evidence for the selection of the rootstocks． In this
experiment with Poncirustrifoliate(L．)Ｒaf，Citrus reticulate Blanco，C． junos(sieb．)Tanaka for the rootstocks from
Huangguogan seeding as the control for study． Showed that:Huangguogan fruit had been accumulated mainly citric
acid，C． junos(sieb．)Tanaka could most effectively reduce the organic content of the fruit，mature period was
24． 35% lower than in the the seedling． Grafting can be reduced to some extent the activity of CS，but has little
effect on the activity of PEPC and MDH． 250 － 330 days after flowering，the ACO and NADP-IDH activity exhibited
a trend of C． junos(sieb．)Tanaka ＞ Poncirustrifoliate(L．)Ｒaf ＞ Citrus reticulate Blanco ＞ CK． In addition to see-
ding，Huangguogan fruit between the level of expression of NADP-IDH and total acid content was significantly nega-
tively correlated，there was no significant correlation between CS，MDH，ACO and total acid content． The C． junos
(sieb．)Tanaka is ideal rootstock varieties of Huangguogan，Organic acid content of different rootstocks fruit is the
result of combined action of the ACO and NADP-IDH activity，and NADP-IDH gene expression may be the mainly
limiting factor of Huangguogan fruit organic acid with different rootstocks．
Key words:Huangguogan;Ｒootstock;Organic acid;Enzyme activity;Gene expression
4 期 曹淑燕等:不同砧木对黄果柑果实有机酸含量和酸代谢相关酶活性及基因表达的影响 81
黄果柑(Citrus cultivar cv． Huangguogan)为芸香
科(Ｒutacese)柑橘亚科(Subfamily aurantioideae)植
物，是我国具有自主产权的优良杂交柑橘［1］。其果
实翌年 3 － 5 月成熟，具有极晚熟、无核、优质、丰产
等优良经济性状［2］。良好的砧穗组合有 2 种。近
年来，石棉县引进香橙作为新的黄果柑砧木，但 3 种
砧木对黄果柑果实品质的影响尚不明确。
柑橘果实中所含的糖分、有机酸含量及其比值
是决定柑橘果实风味的重要指标［3 － 4］，决定了柑橘
的营养和商业价值［5］。多数柑橘品种在成熟期糖
酸比较低，严重影响了柑橘产业的发展［6］。相对来
说，果实内糖含量的变化幅度较小，而有机酸的变化
幅度较大。因此，对决定糖酸比大小而言，有机酸的
影响更为重要［7］。柠檬酸合成酶(CS)、磷酸烯醇式
丙酮酸羧化酶(PEPC)、顺-乌头酸酶(ACO)、异柠檬
酸脱氢酶(IDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)［8］等作为
有机酸代谢的关键酶，通过三羧酸循环途径参与果
实有机酸的代谢。砧木对柑橘的生长量［9］、果实品
质［10 － 11］、抗逆性［12 － 13］等具有很大的影响作用。至
今，对于柑橘果实有机酸代谢的研究主要集中在成
熟过程中柠檬酸的代谢机理［14］、品种间的代谢差
异［15］和胁迫处理等对代谢酶活性及基因表达的影
响［16］上，有关砧木影响酸代谢的研究较少。通过
2012 － 2014 年的观察记录发现，不同砧木黄果柑的
可滴定酸含量差异显著，但是上述 3 种砧木对黄果
柑有机酸含量、相关酶活性及基因表达方面的研究
尚未见报道。
本试验研究了不同砧木对黄果柑有机酸含量、
酸代谢相关酶活性及基因表达的影响，从而了解其
影响机理，最终为筛选出黄果柑的优良砧木，实现黄
果柑产业的提质增效提供理论基础。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 试验地条件 试验地位于四川省石棉县黄
果柑栽培标准示范园，年均气温 17 ℃，年均积温
5 468 ℃，年均无霜期 326 d，年日照数 1 242． 9 h，年
均降雨量 778． 3 mm，属中亚热带干热河谷气候类
型，壤土。
1． 1． 2 试验材料 以枳壳［Poncirustrifoliate(L．)
Ｒaf］、红橘(Citrus reticulata Blanco)和香橙［C． junos
(sieb．)Tanaka］3 种砧木嫁接的黄果柑为试材，黄
果柑实生苗为对照。每种砧木选择树势、树载、管理
方式基本一致的 5 年生健壮黄果柑 3 株，进行果实
的采样与相关指标的测定。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 采样方法 2014 年 11 月 15 日(花后 210 d，
果实转色期)至 2015 年 3 月 15 日，每隔 20 d 左右，
在树冠的外围东、南、西、北 4 个方位，随机摘取生长
正常、大小均匀、无病虫害的黄果柑果实各 2 个，每
株树采 8 个，用液氮立即带回实验室，进行测定。
1． 2． 2 黄果柑果实有机酸含量的测定 参照郭
燕［17］和肖玉明［13］的方法进行果实有机酸的提取与
测定(高效液相色谱法)。
1． 2． 3 酸代谢相关酶活性的测定 参照 Hirai
等［18］的方法进行酶液的制备，并用 Srene 法测定酶
活性。
1． 2． 4 总 ＲNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
ＲNA提取与纯化方法参照刘庆［19］和 Zhang 等［20］的
方法略有改进。提取的黄果柑果实 ＲNA 用琼脂糖
凝胶电泳和紫外分光光度计分别进行质量检测和浓
度分析。用 DNase去除残留的 DNA杂质，然后严格
地按照 PrimeSciptTM ＲT reagent Kit (DＲＲ037A)反
转录试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司)说明
书进行反转录，合成后续试验所需的 cDNA。3 次生
物学重复。
1． 2． 5 实时荧光定量 PCＲ 分析 实时荧光定量
PCＲ引物设计:根据笔者克隆的黄果柑相关基因序
列片段(登录号:KU319552、KU319556、KU319555、
KU319553、KU319557、GQ389668． 1)，运用 Primer 5． 0
软件进行引物设计，并进行扩增筛选，结果见表 1。
表 1 黄果柑实时荧光定量 PCＲ引物序列
Tab． 1 Primer sequences for Ｒeal-time PCＲ of Huangguogan
基因
Gene
上游引物(5 － 3)
Forward primer
下游引物(5 － 3)
Ｒeverse primer
CS CCTGAGTGCCAGAAGTTGTT AGAAGTTCCCACCATAATCC
ACO GGCTTACTGCTTACTCAAC AACTTCCACTGCCATACTC
PEPC GGAATCGGATCAATGGTAAG TGGTGTAGCCAATCGTAAAT
NADP-IDH TTTTGCTGACGCTACCTTG GGCACTCCAGTACGGATGT
MDH CTCCAACCCAACCTCACAG GACCAAACCCAAACCAAAT
β-actin AGGCTCCACAAGCAAGTATTA CATCAAGGCAGGGTTCACATT
82 华 北 农 学 报 31 卷
基因的定量表达分析:以 β-actin 基因为内参基
因进行实时荧光定量 PCＲ分析，每个样品设 3 次生
物学重复。反应根据 SYBＲ  Ｒremix Ex TaqTM
(Perfect Ｒeal Time)荧光定量试剂盒(购自宝生物工
程大连有限公司)进行。反应体系:cDNA(1． 5 μg)
2 μL;2 × SYBＲ Green PCＲ Master Mix 12． 5 μL;正、
反向引物(10 μmol /L)各 1 μL;ddH2O 8． 5 μL，总体
系为 25 μL。反应程序:95 ℃，5 min;95 ℃，10 s;
58 ℃，15 s;72 ℃，20 s(第 2 至 4 步进行 40 个循
环)。溶解曲线在 PCＲ运行完毕后立即开始。
1． 2． 6 统计分析 试验数据用 Excel、SPSS 16． 0 软
件进行处理分析。
2 结果与分析
2． 1 砧木对黄果柑有机酸含量的影响
由图 1 看出:不同砧木黄果柑柠檬酸含量与总
酸含量变化趋势一致，呈先上升后下降的趋势，且柠
檬酸含量占总酸含量的 90． 45% ～ 96． 79%，说明黄
果柑果实以积累柠檬酸为主;3 种砧木与实生苗相
比，酸含量均有所下降，成熟期总酸含量分别降低
13． 17%，6． 93%和 24． 35%，说明香橙砧木能够最
有效地降低酸含量;CK、枳壳砧、红橘砧有机酸含量
在花后 230 d达到最高值，之后逐渐分解直到成熟，
香橙砧最高值出现在花后 250 d，说明香橙砧木能够
推迟黄果柑的成熟;苹果酸和奎宁酸含量很低，整体
呈现下降趋势，不同砧木之间无明显的规律性。
2． 2 砧木对黄果柑有机酸代谢相关酶活性的影响
2． 2． 1 砧木对黄果柑有机酸合成酶类活性的影响
由图 2 可知，不同砧木 CS 活性(以鲜质量计)在
花后 250 d达到峰值，之后缓慢下降，但仍维持在一
个较高的活性水平，说明黄果柑有机酸在花后 250 d
后的快速降解受 CS 活性下降的影响较小;除了花
后 270 d，CS活性均表现为 CK 最高，但是 3 种砧木
之间 CS活性在各个时期表现出不同的差异情况，
无明显规律，说明嫁接能够降低黄果柑 CS 活性，但
3 种砧木间有机酸含量的差异不是由 CS 活性的差
异造成;不同砧木 PEPC 活性(以鲜质量计)在花后
210 ～ 330 d均呈现快速下降的趋势，但各时期，处理
之间的 PEPC 活性差异情况无明显规律，说明黄果
柑成熟过程中 PEPC 酶活性的下降，导致果实有机
酸含量下降，但不同砧木之间有机酸含量的差异形
成与 PEPC 活性无关;MDH 活性在花后 250 d 达到
峰值，之后缓慢降低，花后 330 d 活性稍有提高，但
处理之间 MDH活性(以鲜质量计)在不同
图 1 不同砧木对黄果柑柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、总酸含量的影响
Fig． 1 Effects of different rootstocks on Huangguogan in citric acid，malic acid，quinic acid and total acid
4 期 曹淑燕等:不同砧木对黄果柑果实有机酸含量和酸代谢相关酶活性及基因表达的影响 83
同一时期进行 LSD检验，小写字母代表 0． 05 差异水平。图 3 ～ 5 同。
LSD test at the same time，small letters represent significant 0． 05 levels． The same as Fig． 3 － 5．
图 2 不同砧木对黄果柑柠檬酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶活性的影响
Fig． 2 Effect of different rootstocks on Huangguogan in the activity of CS，PEPC and MDH
图 3 不同砧木对黄果柑 ACO和 NADP-IDH活性的影响
Fig． 3 Effect of different rootstocks on Huangguogan in the activity of ACO，NADP-IDH
84 华 北 农 学 报 31 卷
时期差异情况无明显变化规律，说明 MDH 活性的
降低使得黄果柑有机酸含量降低，但不同砧木之间
有机酸含量的差异与 MDH活性关系不大。
2． 2． 2 砧木对黄果柑分解酶类活性的影响 由图
3 可以看出:不同砧木黄果柑 ACO 活性(以鲜质量
计)呈现先上升后稍微下降的趋势，相同时期，各处
理差异显著，且花后 250 ～ 330 d 均表现为香橙砧 ＞
枳壳砧 ＞红橘砧 ＞ CK，说明嫁接能够提高 ACO 活
性，从而降低有机酸含量，其中香橙砧木能够更好地
提高 ACO活性;NADP-IDH活性(以鲜质量计)随着
黄果柑果实的成熟，呈现上升的趋势，同一时期差异
显著，且花后 230 ～330 d均表现为香橙砧 ＞枳壳砧 ＞
红橘砧 ＞CK，说明嫁接同样能够提高 NADP-IDH 的
活性，且提高能力依次为香橙砧 ＞ 枳壳砧 ＞ 红橘
砧 ＞ CK。综合说明，不同砧木黄果柑果实有机酸含
量的差异，是 ACO 和 NADP-IDH 活性共同作用的
结果。
2． 3 砧木对黄果柑有机酸代谢相关酶基因表达的
影响
2． 3． 1 砧木对黄果柑有机酸合成酶类基因表达的
影响 由图 4 可知:不同砧木合成酶类基因表达的
变化趋势与酶活性的变化趋势一致，说明基因表达
量的多少直接决定相应酶的活性强度。实生苗
(CK)的 CS 基因表达量总体上高于其他砧木嫁接
苗，说明嫁接能够在一定程度上抑制 CS 基因的表
达;除个别时期，各个处理间 PEPC 和 MDH 相对表
达量都无显著的差异，说明砧木基本不影响黄果柑
果实 PEPC、MDH的基因表达。
将实生苗(CK)花后 210 d的数据作为 1 个表达水平计算各酶表达相对丰度。图 5 同。
Take the seedings data of 210 days after flowering as an expression level to calculate the relative intensity of each enzyme． The same as Fig. 5．
图 4 不同砧木对柠檬酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶基因表达的影响
Fig． 4 Effect of different rootstocks on Huangguogan in the gene expression of CS，PEPC，MDH
2． 3． 2 不同砧木对黄果柑有机酸分解酶类基因表
达的影响 由图 5 可以看出，在黄果柑成熟过程中，
有机酸分解酶类基因的表达量，总体呈上升的趋势，
说明在黄果柑成熟期有机酸的降解，取决于成熟期
4 期 曹淑燕等:不同砧木对黄果柑果实有机酸含量和酸代谢相关酶活性及基因表达的影响 85
高的分解酶类基因的表达。枳壳砧果实的 ACO 表
达峰值出现在花后 230 d，CK 和红橘砧的表达峰值
出现在花后 250 d，而香橙砧却在花后 270 d，说明
ACO基因的启动枳壳砧 ＞ CK 和红橘砧 ＞香橙砧，
在一定程度上，枳壳砧木提早了黄果柑有机酸的分
解，香橙砧木延迟了有机酸的分解;除了花后 210 d，
砧木间 NADP-IDH的表达量差异显著，且香橙砧 ＞
枳壳砧 ＞红橘砧 ＞ CK，说明嫁接能够改变黄果柑果
实 NADP-IDH的表达，导致果实相应酶活性发生变
化，最终导致有机酸含量出现差异。
图 5 不同砧木对顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢基因表达的影响
Fig． 5 Effect of different rootstocks on Huangguogan in the gene expression of ACO，NADP-IDH
2． 3． 3 不同砧木黄果柑有机酸代谢相关酶基因表
达与总酸含量相关性分析 将各处理有机酸代谢相
关基因表达水平与总酸含量进行相关性分析，结果
发现枳壳砧的果实中 PEPC表达水平与总酸含量间
呈显著性正相关，但在其他处理中相关性不显著;各
处理的 NADP-IDH表达水平与总酸含量间呈显著性
负相关，且枳壳砧呈极显著负相关，而 CS、MDH、
ACO与总酸含量均未表现出显著相关性。上述结
果说明 NADP-IDH基因的表达是影响不同砧木黄果
柑果实中有机酸含量的关键限制因子(表 2)。
表 2 不同砧木黄果柑有机酸代谢相关酶基因表达与总酸含量的相关系数
Tab． 2 Correlation coefficient between total acid content and related metabolism genes
expression of Huangguogan of different rootstocks
处理
Treatment
柠檬酸合成酶
基因-总酸
CS-TA
磷酸烯醇式丙酮
酸羧化酶基因-总酸
PEPC-TA
苹果酸脱氢酶
基因-总酸
MDH-TA
顺乌头酸酶
基因-总酸
ACO-TA
异柠檬酸脱
氢酶基因-总酸
NADP-IDH-TA
CK 0． 294 0． 468 0． 434 0． 688 － 0． 742
枳壳 Ponirus trifoliate(L．)Ｒaf － 0． 037 0． 862* 0． 055 0． 186 － 0． 965＊＊
红橘 Citrus reticulate Blano 0． 304 0． 605 0． 324 0． 057 － 0． 809*
香橙 C． junos(sieb．)Tanaka 0． 438 0． 672 0． 480 － 0． 301 － 0． 830*
注:* 和＊＊分别表示在 P ＜ 0． 05 和 P ＜ 0． 01 水平下显著相关。
Note:* and ＊＊ indicate significant difference at P ＜ 0． 05 and P ＜ 0． 01，respectively．
3 讨论
Yamaki［21］试验发现绝大多数柑橘品种以积累
柠檬酸为主，极少数以积累苹果酸为主。本研究发
现，黄果柑整个果实成熟期，柠檬酸含量占总酸含量
的 90%以上，说明黄果柑果实以积累柠檬酸为主。
在柑橘花后 6 － 12 个月为成熟过程，常常伴随着明
显的有机酸的降低［22 － 23］。本试验中，黄果柑果实有
机酸含量在花后 230 或 250 d 开始逐渐降低，说明
黄果柑果实有机酸的降解主要在果实成熟后期。成
86 华 北 农 学 报 31 卷
熟期黄果柑果实的总酸含量 CK ＞红橘砧 ＞枳壳砧 ＞
香橙砧，说明对黄果柑进行嫁接能够有效地降低果
实有机酸含量，且香橙砧最好。
CS是一个变构酶，存在于果实细胞线粒体中，
能催化草酰乙酸(OAA)与乙酰辅酶 A(Ac-CoA)结
合生成柠檬酸;PEPC 能催化丙酮酸与 CO2 形成
OAA，可供进一步合成柠檬酸;MDH 能可逆催化苹
果酸的分解与合成，对苹果酸的积累和柠檬酸的代
谢具有重要作用。文涛等［24］研究发现 CS活性与罗
伯逊脐橙有机酸含量极显著正相关。本研究中，黄
果柑果实 CS活性在花后 250 d之后，虽然有一定程
度的降低，但是仍保持在一个较高的活性水平，而有
机酸含量呈明显的下降趋势，可能是黄果柑有机酸
含量的降低不取决于 CS活性的降低，与 CS 活性关
系不大，这与罗安才等［25］的试验结果一致。本试验
中，不同砧木的 PEPC 活性随着黄果柑果实的成熟
而不断降低，与龚荣高等［26］的研究一致，说明 PEPC
在黄果柑果实有机酸合成过程中起关键作用，其活
性的降低能够抑制果实有机酸的合成。不同砧木间
的 CS、PEPC、MDH 活性在各时期的差异性情况不
同，说明其活性不是导致不同砧木间有机酸含量差
异的主要因素。
顺乌头酸酶(ACO)是一个变构酶，催化柠檬酸
向乌头酸的反应;异柠檬酸脱氢酶(IDH)与有机酸
的合成、积累相关，果实中普遍存在 NAD 依赖型和
NADP依赖型 2 种型式的 IDH，线粒体中的 NAD-
IDH催化异柠檬酸的形成，细胞质中的 NADP-IDH
参与了柠檬酸的分解［27］。本试验中，黄果柑果实成
熟后期，ACO活性缓慢下降，说明其活性与后期黄
果柑果实有机酸快速下降关系不大，与 Hirai 等［18］
在温州蜜柑上的研究结果一致。随着果实成熟，
NADP-IDH的活性不断提高，与果实有机酸积累呈
负相关，这与陈明［8］的结果一致。成熟后期，不同
砧木间 ACO和 NADP-IDH活性差异显著，且表现为
香橙砧 ＞枳壳砧 ＞红橘砧 ＞ CK，说明嫁接能够提高
黄果柑果实 ACO和 NADP-IDH活性，从而促进有机
酸的分解，ACO和 NADP-IDH 活性共同作用是导致
砧木间有机酸含量出现差异的重要因素。
有机酸合成、代谢及分配受到许多因素控制，其
中包括代谢酶相关基因的时空和组织特异性表达调
控［28］。因此，明确不同砧木对有机酸代谢相关基因
表达的影响在黄果柑砧木的选择中就显得十分必
要。本研究发现，除花后 270 d 外，CS 活性均表现
为 CK最高，说明嫁接能够抑制 CS 基因的表达，这
可能是砧木影响黄果柑 CS 表达的细胞微环境的结
果。除个别时期各个处理间 PEPC 和 MDH 相对表
达量均无显著差异，说明砧木基本不影响黄果柑果
实 PEPC的基因表达，可能由黄果柑自身特性所决
定，有待于进一步研究。枳壳砧果实的 ACO表达峰
值出现在花后 230 d，CK 和红橘砧的表达峰值出现
在花后 250 d，而香橙却在花后 270 d，说明，在一定
程度上，枳壳砧木提早了黄果柑有机酸的分解，香橙
砧木延迟了有机酸的分解。除了花后 210 d，砧木间
NADP-IDH的表达量差异显著，且香橙砧 ＞ 枳壳
砧 ＞红橘砧 ＞ CK，说明砧穗互作能够改变黄果柑果
实 NADP-IDH的表达。相关性分析结果表明:不同
砧木的黄果柑 NADP-IDH表达水平与总酸含量间呈
显著性负相关，而 CS、MDH、ACO与总酸含量均未表
现出显著相关性。综上表明，NADP-IDH 基因的表
达可能是影响不同砧木黄果柑果实中有机酸含量的
关键限制因子，这与王西成等［29］在葡萄上的研究结
果相同。
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