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瓠瓜类型砧木遗传作图群体双亲多态性分析



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宋 慧,王毓洪,张香琴.瓠瓜类型砧木遗传作图群体双亲多态性分析[J].江苏农业科学,2016,44(11):48-50.
doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.11.014
瓠瓜类型砧木遗传作图群体双亲多态性分析
宋 慧,王毓洪,张香琴
(宁波市农业科学研究院蔬菜研究所/宁波市瓜菜育种重点实验室,浙江宁波315040)
  摘要:以耐湿涝瓠瓜类型砧木材料JZS与不耐湿涝材料 T2002为遗传作图双亲,利用随机扩增多态性 DNA(ran
domamplificationpolymorphicDNA,简称RAPD)法与瓠瓜及其他近源瓜类简单重复序列(simplesequencerepeat,简称
SSR)进行多态性分析。从供试1678个RAPD、SSR标记中共筛选到26个多态性引物,其中包括14个 RAPD、4个瓠
瓜SSR、2个甜瓜 SSR、5个黄瓜 SSR、1个南瓜 SSR,扩增出28个多态性位点。几种标记多态性检测效率不同,瓠瓜
SSR引物揭示,双亲多态性比例最高(0.47%),其次是 RAPD(0.38%),近源瓜类 SSR选择效率最低,仅有0.14% ~
015%。结果表明,尽管瓠瓜作图亲本表型差异大,但分子标记结果显示亲本遗传背景相近;甜瓜、黄瓜和南瓜与瓠瓜
亲缘关系远,具有种属特异性的SSR引物在瓠瓜亲本JZS、T2002多态性分析中通用性不高。为了提高分子标记多态
性分析效率,绘制高密度遗传图谱,下一步应尽快开展基于基因组测序技术检测单核苷酸多态性(singlenucleotide
polymorphism,简称SNP)位点的研究。
  关键词:瓠瓜;砧木;多态性分析;耐湿涝
  中图分类号:S184  文献标志码:A  文章编号:1002-1302(2016)11-0048-03
收稿日期:2015-10-16
基金项目:宁波市自然科学基金(编号:2014A610199);公益性行业
(农业)科研专项(编号:201403032)。
作者简介:宋 慧(1979—),女,甘肃兰州人,博士,副研究员,主要从
事蔬菜分子辅助育种与生物工程研究。Tel:(0574)87923251;
E-mail:975281674@qq.com。
  我国约有2/3的国土面积存在不同程度的湿涝胁迫,严
重影响黄瓜、西瓜和甜瓜等瓜类作物种植生产[1]。瓠瓜[Lag
enariasiceraria(Molina)Standl.]根部发达,用作瓜类嫁接砧
木,能够增强接穗耐逆性,提高产量[2]。耐湿涝瓠瓜砧木的
选育已成为瓠瓜育种的重要目标之一。
瓠瓜耐湿涝特性是由多基因控制的数量遗传性状[3]。
前期笔者通过集团混合分离分析法(bulkedsegregationanaly
sis,简称BSA),以不定根数作为鉴定指标,筛选到简单重复
序列(simplesequencerepeat,简称 SSR)引物 S87/88与瓠瓜
耐湿涝性状相关性为0.78,这与瓠瓜耐湿涝特性目的基因尚
存在较大遗传距离[4],影响分子辅助选择的正确性,亟须通
过遗传图谱构建和耐湿涝数量性状基因座(quantitativetrait
locus,简称QTL)定位等手段为瓠瓜耐湿涝分子育种提供紧
密连锁分子标记。
SSR引物具有种属特异性,瓠瓜基因组研究相对于黄瓜、
西瓜和甜瓜等瓜类作物相对薄弱,仅有浙江省农业科学院李
—84— 江苏农业科学 2016年第44卷第11期
网络出版时间:2016-12-12 14:36:04
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/32.1214.S.20161212.1436.017.html
国景研究员所在课题组的相关报道[5],瓠瓜 SSR开发数目有
限。为此,笔者所在课题组利用随机扩增多态性 DNA
(randomamplificationpolymorphicDNA,简称 RAPD)、瓠瓜
SSR及其他近源瓜类SSR,对瓠瓜类型砧木遗传作图双亲(耐
湿涝材料 JZS与不耐湿涝材料 T2002)进行多态性分子标记
分析,以期为瓠瓜遗传图谱构建和耐湿涝QTL定位研究奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
所用材料为瓠瓜类型砧木耐湿涝材料 JZS、不耐湿涝材
料T2002及其F1代。将种子播种于32孔穴盘中,按常规方
法进行田间管理。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取 材料播种后,待植株长至5~6张真叶
时,每份样品各取10张单株的混合叶片,每株采集1g嫩叶,
于-80℃保存。参照 CTAB法,提取新鲜叶片总基因
组DNA。
1.2.2 分子标记分析 甜瓜SSR引物序列由美国威斯康星
大学园艺系翁益群教授提供,瓠瓜 SSR引物序列由浙江省农
业科学院蔬菜研究所李国景研究员提供。RAPD、SSR的混样
体系为 20μL,包括 3.24μLdNTP(1.25mmol/L)、1.5μL
10×bufer、2.43μLMgCl2(25mmol/L)、1.35μL引物
(5mmol/L)、5μLDNA(10ng/μL)、0.05μLTaqDNA聚合
酶(1U)。RAPD、SSR的PCR产物分别用2%琼脂糖凝胶和
高分辨率MS-6琼脂糖凝胶(TaKaRa,上海)水平电泳检测。
1.3 数据记录与连锁分析
根据相同迁移率位置表现出的差异带型,确定在双亲中
显示差异的分子标记,用于多态性分析。
2 结果与分析
2.1 RAPD引物在双亲中的扩增和多态性筛选
600对 RAPD引物分别在双亲 JZS、T2002中扩增出 4
188、4197个条带,平均每个引物产生6.99个条带(表 1)。
筛选到 14个 RAPD引物(分别编号为 P21、P38、P77、P79、
P80、P86、P184、P214、P237、P284、P289、P366、P421、P589),共
扩增出16个多态性位点(图1)。RAPD引物揭示双亲的多
态性比例为0.38%。
表1 RAPD和SSR在双亲中的多态性
标记类型 引物总数
引物在亲本的扩增位点数(个)
JZS T2002
双亲平均扩增
位点数(个)
单个引物扩
增位点数(个)
差异引
物数
多态性位点数
(个)
多态性比例
(%)
RAPD 600个 4188 4197 4192.5 6.99 14个 16个 0.38
瓠瓜SSR 100对 852 854 853.0 8.53 4对 4对 0.47
甜瓜SSR 251对 1469 1470 1469.5 5.85 2对 2对 0.14
黄瓜SSR 595对 3407 3403 3405.0 5.72 5对 5对 0.15
南瓜SSR 132对 707 705 706.0 5.35 1对 1对 0.14
合计 1678个(对) 10623 10629 10626.0 26个(对) 28个(对)
  注:多态性比例=标记多态性位点数/双亲平均扩增位点数×100%。
2.2 瓠瓜SSR在双亲中的扩增和多态性筛选
100对瓠瓜 SSR引物分别在双亲 JZS、T2002中扩增出
852、854个条带,平均每个引物产生8.53个条带(表1)。筛
选到4对引物(分别为 S35/36、S45/46、S49/50、S87/88),共
扩增出4个多态性位点(图2)。瓠瓜 SSR引物扩增结果显
示,亲本材料的多态性比例为0.47%,高于 RAPD揭示的多
态性比例(0.38%)。
2.3 甜瓜SSR、黄瓜 SSR和南瓜 SSR在双亲中的扩增和多
态性筛选
分别使用251对甜瓜SSR、595对黄瓜SSR和132对南瓜
SSR对双亲JZS、T2002进行扩增,结果筛选到2对甜瓜 SSR
(T35/36、T193/194)、5对黄瓜 SSR(H37/38、H41/42、H49/
50、H61/62、H241/242)和 1对南瓜 SSR(N15/16)(图 3),3
种SSR引物揭示双亲多态性比例分别为 014%、0.15%、
014%,低于RAPD引物(0.38%)、瓠瓜 SSR(0.47%)揭示
的多态性比例。
—94—江苏农业科学 2016年第44卷第11期
3 讨论
作物耐湿涝特性是较为复杂的数量性状,国内外有关耐
湿涝的研究多集中在小麦[6]、大麦[7]、玉米[8]等大田经济作
物,葫芦科作物中除了模式作物黄瓜有少量报道[9]以外,鲜
有报道提及其他瓜类作物的耐湿涝研究。瓠瓜根系发达,耐
湿涝特性突出,是瓜类作物耐湿涝性状改良的重要基因库。
尽管众多葫芦科作物很早就被用来开展利用分子遗传图谱定
位重要农艺性状的研究[10-11],但是针对瓠瓜耐湿涝特性QTL
定位的研究未见开展,从而制约了进一步利用分子手段改良
瓜类作物耐湿涝特性的研究进程。
瓠瓜表型变异大,但从分子标记研究结果来看,瓠瓜遗传
背景狭窄。在本研究中,几种标记多态性检测效率不同,瓠瓜
SSR、RAPD揭示耐湿涝亲本JZS和不耐湿涝亲本T2002的多
态性比例分别只有0.47%、0.38%,而选用的近源瓜类 SSR
选择效率更低,多态性比例仅为0.14% ~0.15%,一方面表
明作图亲本JZS和T2002亲缘关系近,另一方面表明甜瓜、黄
瓜、南瓜与瓠瓜亲缘关系远,基于种属特异性的 SSR引物在
JZS、T2002多态性分析中通用性不高。
Neuhausen认为,葫芦科作物的基因组变化主要源于点
突变[12],因此RAPD、SSR这类基于扩增片段多态性的分子标
记能够检测的多态性较低,有必要进一步开展基于测序技术
检测单核苷酸多态性位点(SNP)的多态性研究,提高分子标
记分辨率,为绘制高密度遗传图谱奠定良好基础。
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