全 文 ：系生长的效果显著好于去离子水处理秸秆后接
种蚯蚓的处理 , 说明铁能够显著促进苹果根系
生长;去离子水处理秸秆后接种蚯蚓促进苹果
根系生长的效果显著好于没有接种蚯蚓的处
理 , 说明蚯蚓能够显著促进根系生长 。
参考文献
1　袁方曜 , 王　玢 , 牛振荣 .华北代表性农田的蚯蚓群落
与重金属污染指示研究 .环境科学研究 , 2004, 17 (6):
70-72
2　李典友 , 潘根兴 , 向昌国 .土壤中蚯蚓资源的开发应用
研究及展望.中国农学通报 , 2005, 21 (10): 340-347
3　薛进军 , 吴文良 , 辛德惠 , 等, 成龄苹果园树盘养蚯蚓
的综合效应研究.中国果树 , 1994 (1):20-21, 26
4　FernandezAA, MarcoSG, LucenaJJ.Evaluationofsyn-
theticiron(Ⅲ ) -chelates(EDDHA/Fe3+, EDDHMA/
Fe3+andthenovelEDDHSA/Fe3+)tocorectironchlorosis.
EuropeanJournalofAgronomy, 2005, 22 (2): 119-130
5　TagliaviniM, RombolaAD.Irondeficiencyandchlorosisin
orchardandvineyardecosystems.EuropeanJournalofAgrono-
my, 2001, 15 (2): 71-92
本文于 2008-08-27收到, 2008-09-27收到修改稿。
吕荣军电话:(0791) 3969537
南丰蜜橘及近缘品种的 ISSR标记
吕荣军 1 , 殷　珊1, 2 , 朱友林 1
(1南昌大学生命科学学院 , 南昌 330031)　 (2天津赛尔生物技术有限公司)
　　摘　要　利用 ISSR分子标记对 22份南丰蜜橘及其近缘品种的遗传多样性水平进行研究。从 31
个 ISSR引物中筛选出 13个引物 , 通过琼脂糖凝胶电泳共检测到 119条稳定的条带 , 片段大小介于
0.5 ～ 4 kb之间 , 条带数在 8 ～ 13之间;扩增片段中多态性位点 98个 , 平均多态性比率为 82.35%。
各品种间的 Nei s基因多样性指数 (H)和 Shannon信息多样性指数分别为 0.289 5和 0.433 3, 品种间
遗传相似指数 (GS)范围为 0.487 4 ～ 0.949 6。通过 UPGMA聚类分析 , 当遗传相似系数为 0.72时 ,
可以将 22份南丰蜜橘及近缘品种分成 3大类。
关键词　南丰蜜橘　遗传多样性　ISSR标记
　　南丰蜜橘又名金钱蜜橘 , 主产于江西省南
丰 、临川县和浙江省黄岩等地 , 原产江西省南
丰县 , 已有 1 300多年的栽培历史。果实色泽
金黄 、 皮薄多汁 、酸甜适口 、 少核化渣 、 清香
独特 , 有 “橘中之王 ” 的美称。南丰蜜橘种
质资源极其丰富 , 品种类型多样 , 但随着从原
产地———平原川地向红壤丘陵山区发展 , 生态
环境条件的改变 , 及其不同地域民间种质交流
活动 , 出现了种质混淆[ 1] 。目前人们对南丰
蜜橘种质资源的演化关系及品种间系统关系了
解不多 , 对原产地南丰蜜橘遗传多样性研究 ,
可为合理利用南丰蜜橘资源提供科学依据 。
ISSR(inter-simplesequencerepeats)是
Zietkiewicz等 1994年提出的一种建立在 PCR
反应基础之上的分子标记技术 [ 2] 。 ISSR标记
可以提供更多的关于基因组的信息 , 比 RAPD
技术更加稳定可靠 , 实验重复性较好 , 且为显
性标记[ 3] , 呈 Mendel式遗传 , 具有很好的稳
定性和多态性 [ 4] , 因而是非常理想的检测物
种内遗传变异的分子标记 。ISSR标记已经成
功用于物种遗传多样性分析 、绘制 DNA指纹
图谱 、品种鉴定等研究中 [ 5] , 多见于小麦[ 6] 、
水稻 [ 7]等大田作物和苹果 [ 8] 、 柑橘 [ 9]等果树
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　中国果树　China　Fruits　2009 (1)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 1月　
的研究 。本文用 ISSR分子标记对南丰蜜橘进
行种质遗传多样性研究 , 为其种质资源的保
存 、鉴定 、 评价和良种培育提供依据 。
1　材料和方法
1.1　试验材料
试验选取 22份有代表性的南丰蜜橘品系
及其近缘品种材料 , 均采集于江西省南丰县各
农家及柑桔研究所 (表 1)。
1.2　基因组 DNA提取及引物筛选
采用改良 CTAB法 [ 10]提取材料叶片基因
组 DNA。试验所用 ISSR引物均由上海生物工
程技术服务有限公司合成 , 引物序列参照加拿
大哥伦比亚大学 (UBC)公布的第 9套 ISSR
表 1　供试的南丰蜜橘及其近缘品种名称及其来源
序号 品种 (系) 来源地 序号 品种 (系) 来源地
1 杨小 -261＊ 南丰县柑桔研究所 12 早熟 2＊ 南丰县农家
2 杨小 -262＊ 南丰县柑桔研究所 13 早熟 4＊ 南丰县农家
3 杨小 -263＊ 南丰县柑桔研究所 14 火桔 1 南丰县农家
4 小叶红 1 南丰县农家 15 火桔种子苗 南丰县农家
5 小叶红 2 南丰县农家 16 2002年参评＊＊ 南丰县农家
6 大叶红 南丰县农家 17 普通＊＊ 南丰县柑桔研究所
7 2001年参评＊＊ 南丰县农家 18 混合果型＊＊ 南丰县农家
8 红广 1 南丰县农家 19 蜜广 1 南丰县农家
9 红广 2 南丰县农家 20 本地早 南丰县柑桔研究所
10 小叶广 南丰县农家 21 小果 1＊ 南丰县农家
11 早熟 1＊ 南丰县农家 22 椪柑 南丰县柑桔研究所
　　注:＊南丰蜜橘;＊＊名称可能不准确。
引物序列 (htp://www.michaelsmith.ubc.ca/
service/NAPS/Primer-Sets/Primers.pdf)。从
31个引物中筛选出 13个扩增条带清晰 、 多态
性明显 、反应稳定的引物应用于 22份 DNA样
品的扩增 (表 2)。
1.3　ISSR-PCR反应
ISSR扩增反应条件经过比较和优化确定
为 20μL的 ISSR反应体系:20 ～ 50 ng模板
DNA, 0.25 mmol/L dNTP, 2.0 mmol/L
MgCl2 , 2μL10×Bufer, 1.5 UTaqDNA聚合
酶 (TaKaRa), 0.3μmol/L的随机引物 , 用超
纯水补足;PCR扩增程序:94 ℃ 预变性 4
分 , 之后进行 35个循环:94 ℃变性 30秒 ,
55 ℃复性 45秒 , 72℃延伸 2分钟 , 循环结束
后 72 ℃延伸 7分钟 。反应在 PTC-225型
PCR仪上进行 , 扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶
中电泳 , 以 500 bpDNALadder(北京天根生
化产品)为标准分子量对照 , EB染色 , BIO
表 2　南丰蜜橘 ISSR引物序列及其扩增条带统计结果
引物名称 引物序列 扩增总条带数(条)多态性条带数(条) 多态百分比 (%)
AW71102 (AG) 8YT 8 7 87.5
AW71087 HBH(AG) 7 9 8 88.9
AW71088 HVH(CA) 7T 13 12 92.3
AW71091 BDB(TCC)5 8 6 75.0
AW71093 DBDA(CA)7 10 7 70.0
AW71105 (CA)8YT 8 7 87.5
AW71108 (AC)8YG 9 6 66.7
AW71113 (GTT)5 10 9 90.0
AW71114 BDB(ACA)5 10 8 80.0
AW71097 (CA)8RG 9 7 77.8
AW71099 (GA)8YT 8 7 87.5
AW71096 (TCC)5RY 9 7 77.8
AW71092 HVH(TCC)5 8 7 87.5
合计 119 98
平均 9.1 7.5 82.35
　　R=AorT;Y=GorC;B=non-A;D=non-C;H=non-G;V=non-T。
-RAD凝胶成像系统保存图像。
1.4　数据统计分析
分别以 1和 0记录相同迁移位点电泳谱带
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的有无 , 将原始数据输入计算机获得矩阵 。采
用 POPGENE1.32软件对各遗传多样性参数进
行评估 , 并用 NTSYS-PC2.10中的 SAHN程
序和 UPGMA(UnweightedPairGroupMethod
ArithmeticAverages)方法进行聚类分析 。
2　结果与分析
2.1　南丰蜜橘 ISSR扩增结果分析
从 13个引物共扩增出 119条带 ,片段大小
在 0.5 ～ 4kb,其中多态性条带 98条 ,多态性比
率(PPB)为 82.35%,平均每个引物扩增 9条 ,
最多能得到 13条清晰带(AW71088)。平均每
个引物扩增出 7.5个多态性带 (表 2,图 1)。
Nei s基因多样性指数(H)的平均数为 0.289 5,
Shannon信息多样性指数为 0.433 3。
M:markerTIANGEN500bpDNALadder1-22 (相对应品种见表 1)为各个材料模板 DNA扩增结果
图 1　引物 AW71092的扩增结果
2.2　南丰蜜橘的聚类分析
对所获得的 ISSR数据矩阵运用 NTSYS-
PC2.10中的 SAHN程序和 UPGMA方法进行
聚类 (图 2), 当遗传相似系数为 0.72时 , 可
以将 22份南丰蜜橘及近缘品种分成 3大类:
其中第 1类包括杨小 -261、 杨小 -262、 杨小
-263、 小叶红 1、 红广 2、小叶广 、 红广 1、
小叶红 2、 早熟 1等 10个品种;第 2类包括早
熟 2、早熟 4、 火桔 1、 火桔种子苗 、 蜜广 1、
本地早 、小果 1等 10个品种;而第 3类只有
大叶红和椪柑 2个品种 , 这 2个品种与其他品
种遗传相似系数在 0.49 ～ 0.73, 大多集中在
0.55附近 , 说明这 2个品种与其他品种的亲
缘关系相对较远 。
3　讨　论
(1)ISSR条带的多态性检出问题。本试
验运用 1.5%的琼脂糖 , 85V电泳约 2小时
(5V/cm), 可能存在着部分 ISSR多态性条带
并没有完全区分开来。电泳时 , 基因组不同位
置的扩增产物共同移动的可能性是有的 , 那样
不同分子量的扩增产物可能在电泳时没有分开
而形成一条带 。另外 , 电泳的时间不够 , 也可
能导致部分较大片段没有能很好的分开 , 这些
在 marker上可以得到较为直观的反映 。通常
情况下 , PAGE电泳的分辨率较高 , 容易分辨
较小的片段。但本文的扩增片段相对来说比较
大 , 为此我们采用了琼脂糖电泳及 EB染色。
同样也检测到了较高的多态性 (82.35%)。
(2)南丰蜜橘种质资源的遗传多样性。
从聚类分析图中可以看出:同属于南丰蜜橘的
品系间的遗传相似系数很高 , 例如:杨小 26
系列的杨小 -261、 杨小 -262、 杨小 -263,
还有火桔 1、火桔种子苗等 。不属于南丰蜜橘
的椪柑等 , 他们和南丰蜜橘明显不能聚到一类
中 , 存在着较大的差异 。这点从他们之间果实
性状的差异较大可以得到证明。根据形态学特
征 , 南丰蜜橘可以分为大果系 、 小果系 、桂花
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图 2　基于 ISSR分析的 22份南丰蜜橘及近缘种 UPGMA聚类图
蒂系 、 杨小 -26系及早熟系 。从分子标记明
显可以看出 , 杨小 -26系列相对比较集中 ,
而早熟系列则存在一定程度的分散。刘勇
等 [ 11]对江西柑橘地方品种资源及野生近缘种
进行了 SSR标记 , 其中包括部分南丰蜜橘品
系 , 有杨小 -26、 普通 、早熟 、 蜜广 、 大果 、
红广 、 短枝型南丰蜜橘 , 结果显示 , 在遗传相
似系数约为 0.7的时候它们基本上都能聚到一
起 。这在一定的程度上也支持了本文的观点。
(3)南丰蜜橘遗传多样性的 ISSR分析的
可靠性 。ISSR分子标记具有很好的稳定性和
多态性 , 同时克服了 RFLP技术的局限性和
RAPD的假阳性 , 在发现基因多态性方面非常
的有效 , 因而是非常理想的分子标记 。本研究
表明 , ISSR可以较好地确定南丰蜜橘种质资
源的遗传多样性和亲缘关系 , 能够提供基因组
DNA丰富的信息 , 为资源的保存 、 测定 、 评
价和良种培育提供依据 , 为新品种选育和育种
提供分子水平上的信息 。因此 ISSR是南丰蜜
橘种质资源研究中揭示遗传基础差异性和亲缘
关系的快速 、 可靠 、有效的技术 。
参考文献
1　郑　敏 , 罗玉萍 , 李思光 , 等.南丰蜜橘基因组 DNA
RAPD-PCR最佳体系的建立 .生物技术 , 2001 (2): 8
-10
2　ZietkiewiczE, RafalskiA, LabudaD, etal.Genomefinger-
printingbysimplesequencerepeat(SSR) -anchoredpoly-
merasechainreactionamplification.Genomics, 1994, 20
(2):176-183
3　TsumuraY, OhbaK, StraussSH, etal.Diversityandinherit-
anceofinter-simplesequencerepeatpolymorphismsingou-
glasfir(Pseudotsugamenziesi)andsugi(Cryptomeriaja-
ponica).TheorApplGenet, 1996, 92 (1):40-45
4　FangDQ, RooseML.Identificationofcloselyrelatedcitrus
cultivarswithinter-simplesequencerepeatmarkers.Theor
ApplGenet, 1997, 95 (3): 408-410
5　王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应
18
　中国果树　China　Fruits　2009 (1)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 1月　
用.遗传 , 2002, 24 (5):613-616
6　王心宇 , 陈佩度 , 开增军 , 等.ISSR标记在小麦指纹图
谱分析中的应用研究初探.农业生物技术学报 , 2001, 9
(3): 261-263
7　何予卿 , 张　宇 , 朱英国 , 等.利用 ISSR分子标记研究
栽培稻和野生稻亲缘关系.农业生物技术学报 , 2001, 9
(2): 123-127
8　宣继萍 , 章　镇.适合苹果的 ISSR反应体系的建立.植
物生理学通讯, 2001, 38 (6):549-550
9　FangDQ, KruegerRR, RooseML, etal.Phylogeneticre-
lationshipsamongselectedcitrusgermplasm accessionsre-
vealedbyinter-simplesequencerepeat(ISSR)markers.J
AmSoc.HortSci, 1998, 123 (4):612-617
10　MurrayMG, ThompsonWF.RapidisolationofHighmolec-
ularweightplantDNA.NucleicAcidsRes, 1980(8):4321
-4325
11　刘　勇 , 吴　波 , 刘德春 , 等.江西柑橘地方品种资源
及野生近缘种 SSR分子标记 .江西农业大学学报,
2005, 27 (4): 486-490
本文于 2008-08-28收到。
＊江苏省高技术项目 (BG2007310)、 江苏省科技基础设
施建 设 计划 (BM2008008)、 南 京 市 国际 合 作 项目
(200701116)。
赵密珍电话:(025) 84390219
4个草莓品种低温短日照促成栽培试验＊
赵密珍 , 王壮伟 , 钱亚明 , 袁　骥 , 吴伟民
(江苏省农业科学院园艺研究所 , 南京 210014)
　　摘　要　我们于 2006年研究了雪蜜 、 丰香 、 佐贺清香 、 红颊低温短日照处理苗生物学特性。结
果表明 , 低温短日照处理苗株高 、 叶长 、 叶柄长等营养生长受到一定的抑制;现蕾期 、 开花期及果实
成熟期提前;株产和果个大小与对照差异很小 , 果实风味品质与对照几乎相同。
关键词　草莓　品种　低温短日照　促成栽培　物候期　果实品质
　　草莓促成栽培是近年来发展起来的新型栽
培技术 , 在我国南北各地发展都十分迅速 。促
成栽培草莓成熟上市早 、 采收期长 、 经济效益
高 。草莓促成栽培在应用花芽分化早的品种的
基础上 , 一般采取遮荫 、 断根 、高山假植 、营
养钵育苗及人为的低温短日照处理等提早花芽
分化的育苗技术 , 国内外学者对这些促进花芽
分化育苗技术进行了试验 [ 1 -5] , 并取得了实践
效果 , 低温短日照促进草莓花芽分花也有研究
报道[ 6-8] , 在日本已应用于生产。我们在国内
外学者研究的基础上 , 以营养钵育苗为基础 ,
探讨了低温短日照育苗对草莓促成栽培品种生
育的影响。
1　材料与方法
1.1　材料
试验在位于南京的江苏省农业科学院园艺
研究所草莓园中进行。供试草莓品种为雪蜜 、
丰香 、佐贺清香 、 红颊 4个适宜促成栽培品
种。
1.2　方法
2006年 7月 6日将供试品种雪蜜 、 丰香 、
佐贺清香具 4 ～ 5枚展开叶的露地匍匐茎新苗
移植于直径 10 cm的营养钵中 , 营养钵装有草
炭土 、菜园土 、 蛭石 , 按 7∶2∶1制成的混合
土。草莓苗木移植到营养钵后按常规管理 , 短
日照低温处理 , 8月 18日将营养钵草莓苗从
17:00到次日 9:00置于 14 ℃的冷藏箱 , 在
9:00至 17:00搬至室外 , 进行短日照处理 ,
日照时间为 8小时 , 昼温为自然温度 , 共处理
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　中国果树　China　Fruits　2009 (1)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 1月