全 文 ：牻牛儿苗 HPLC指纹图谱及模式识别研究*
尹海波，赵晓雨
(辽宁中医药大学药学院，大连 116600)
摘要 目的:研究牻牛儿苗药材的质量控制方法。方法:采用 HPLC法建立牻牛儿苗药材的 HPLC指纹图谱，收集不同产地的
23 批样品进行测定，并使用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行模式识别研究。结果:根据主成分分析和聚类分析结果，
筛选 14 批样品建立指纹图谱共有模式。结论:该方法可用于牻牛儿苗质量控制及综合评价。
关键词:牻牛儿苗;指纹图谱;没食子酸;原儿茶酸;柯里拉京;鞣花酸;主成分分析;聚类分析
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2012)04 － 0612 － 04
HPLC fingerprint analysis and pattern recognition
of Erodium stephanianum Willd． *
YIN Hai － bo，ZHAO Xiao － yu
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)
Abstract Objective:To establish a method for quality control of Erodium stephanianum Willd．Methods:An high
performance liquid chromatographic method was developed to establish fingerprint of Erodium stephanianum Willd．，
and 23 samples of wild and cultivated from various places had been analyzed． Cluster analysis and principal compo-
nent analysis(PCA)were applied to study HPLC fingerprint and chemical pattern recognition method． Results:14
samples were selected to establish the common pattern of the fingerprint on the basis of the result of cluster analysis
and PCA． Conclusion:The method provides an academic reference for the quality control of Erodium stephanianum
Willd． ．
Key words:Erodium stephanianum Willd．;fingerprint;gallic acid;protocatechuic acid;corilagin;ellagic acid;princi-
pal component analysis(PCA) ;cluster analysis
牻牛儿苗来源于牻牛儿苗科植物牻牛儿苗
(Erodium stephanianum Willd．)的干燥地上部分，习
称长嘴老鹳草［1］，为商品老鹳草的主要来源［2］。本
品味辛、苦、平，归肝、肾、脾经，具有祛风除湿、通经
活络、清热解毒、止痢之功效。牻牛儿苗具有抗
菌［3］、抗病毒［4］、抗氧化［5］、镇痛［6］、消炎［7］、保肝［8］
等广泛的药理作用，临床上可用于风湿痹痛、麻木拘
挛、筋骨伤痛、泄泻痢疾等多种疾病的治疗。牻牛儿
苗的有效成分为黄酮、鞣质、有机酸和挥发油类等成
分［4］。本实验通过 HPLC 法建立药材的指纹图谱，
运用主成分分析和聚类分析，对所得图谱进行分析
和筛选，选择可进入建立共有模式的样品，建立合理
的指纹图谱共有模式，为控制牻牛儿苗药材的质量
提供方法。
1 仪器与试药
Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent TC － C18
色谱柱，SPD －10A紫外检测器，四元低压梯度泵，柱
温箱，KQ3200超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公
司) ，CP225D电子天平(德国 Sartorius公司)。
对照品:没食子酸(中国食品药品检定研究院，
批号 110831 － 200302) ，原儿茶酸(中国药品生物检
定所，批号 110809 － 200604) ，柯里拉京(上海融禾，
批号 100526) ，鞣花酸(上海融禾，批号 091227) ;甲
醇和磷酸为色谱纯，水为重蒸水，其他均为分析纯。
所用牻牛儿苗药材收集于 2009 年 8 月 ～ 2010
年 8 月，见表 1，经辽宁中医药大学药用植物教研室
—216— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(4)
* 辽宁省教育厅项目(2009A498)
第一作者 Tel:(0411)87586003;E － mai:yhb0528@ sina． com
DOI:10.16155/j.0254-1793.2012.04.015
尹海波副教授鉴定，凭证标本保存于本校药用植物 教研室。
表 1 牻牛儿苗样品来源信息
Tab 1 Origin sources of Erodium stephanianum Willd．
编号
(No．)
产地(origin)
生态环境
(ecological environment)
编号
(No．)
产地
(origin)
生态环境
(ecological environment)
S1 辽宁大连(Dalian，Liaoning) 路边草丛(roadside herbosa) S13 河北兴隆(Xinglong，Hebei) 山坡草丛(hillside erbosa)
S2 辽宁葫芦岛(Huludao，Liaoning) 路边草丛(roadside herbosa) S14 河北易县(Yixian，Hebei) 河塘路旁(roadside of pond)
S3 辽宁锦州(Jinzhou，Liaoning) 路边草丛(roadside herbosa) S15 河北沽源县(Guyuan，Hebei) 田埂路旁(roadside bund)
S4 辽宁熊岳(Xiongyue，Liaoning) 路边草丛(roadside herbosa) S16 内蒙古通辽(Tongliao，NeiMonggol) 山坡田埂(hillside bund)
S5 辽宁沈阳(Shenyang，Liaoning) 路边田埂(roadside bund) S17 天津蓟县(Jixian，Tianjin) 山坡田埂(hillside bund)
S6 吉林三家子(Sanjiazi，Jilin) 路边草丛(roadside herbosa) S18 陕西乾县(Qianxian，Shaanxi) 山坡田埂(hillside bund)
S7 吉林白城(Baicheng，Jilin) 路边草丛(roadside herbosa) S19 山东青岛(Qingdao，Shandong) 湖边路旁(roadside of lake)
S8 吉林边昭镇(Bianzhao，Jilin) 路边草丛(roadside herbosa) S20 山东潍坊(Weifang，Shandong) 路边草丛(roadside herbosa)
S9 黑龙江齐齐哈尔(Qiqihaer，
Heilongjiang)
路边草丛(roadside herbosa) S21 山东济南(Jinan，Shandong) 路边草丛(roadside herbosa)
S10 黑龙江杜尔伯特(Duerbote，
Heilongjiang)
路边草丛(roadside herbosa) S22 北京密云(Miyun，Beijing) 山坡林下(hillside undergrowth)
S11 黑龙江泰来镇(Tailai，Heilongjiang) 路边草丛(roadside herbosa) S23 北京延庆(Yanqing，Beijing) 路边草丛(roadside herbosa)
S12 河北易县狼牙山(Langya mountain
of Yixian，Hebei)
路边石缝(roadside swallet)
2 色谱条件
Agilent TC － C18色谱柱(250 mm × 4. 6 mm，
5μm) ;流动相 A为甲醇，B 为 0. 4%磷酸水溶液;梯
度洗脱(0 ～ 17 min，14%→19% A;17 ～ 28 min，19%
→32% A;28 ～ 60 min，32%→41% A;60 ～ 70 min，
41%→48% A) ;流速:0. 9 mL·min －1;检测波长:
259 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。
3 溶液的制备
3. 1 对照品溶液 分别精密称取对照品没食子酸、
原儿茶酸、柯里拉京适量，以甲醇定容至 25 mL 棕色
量瓶中，制成每 1 mL 分别含没食子酸 0. 1180 mg、原
儿茶酸 0. 1008 mg、柯里拉京 0. 7020 mg 的混合对照
品溶液，摇匀，即得。另取鞣花酸适量，置于 25 mL棕
色量瓶中，用二甲基亚砜定容至刻度，制成每 1 mL含
0. 3020 mg的单一对照品溶液，摇匀，即得。
3. 2 供试品溶液 精密称定准确过 40 目筛的牻牛
儿苗药材粉末 2 g，加石油醚脱脂 1 h，弃去石油醚，
残渣加 30 倍的 80%乙醇，回流提取 3 次，每次 1 h，
过滤，合并滤液，浓缩并用甲醇定容至 25 mL 量瓶
中，即得。
4 方法与结果
4. 1 精密度试验 取同一供试品溶液(S1) ，连续
进样 6 次，考察结果显示各共有色谱峰的相对保留
时间及相对峰面积基本没有明显变化，各色谱峰大
于或等于 5%的色谱峰相对保留时间 RSD(n = 6)均
小于 0. 23%，相对峰面积的 RSD(n = 6)均小于
2. 0%，符合指纹图谱的检测要求。
4. 2 重复性试验 精密称取同一批药材(S1)粉末
6 份，按照“3. 2”项下方法制备供试品溶液进行测
定，各主要色谱峰相对保留时间的 RSD(n = 6)均小
于 0. 52%，相对峰面积的 RSD(n = 6)均小于
2. 9%，重复性较好。
4. 3 稳定性试验 取同一供试品溶液(S1) ，室温
下放置，分别于 0，4，8，12，24 h 测定，各主要色谱峰
相对保留时间的 RSD(n = 5)小于 0. 37%，相对峰面
积的 RSD(n = 5)小于 3. 2%，供试品溶液在 24 h 内
稳定性良好。
4. 4 样品测定 实验测定不同产地牻牛儿苗样品，
详细比较各样品的液相色谱图，筛选出 18 个主要特
征峰，构成牻牛儿苗的指纹图谱;其中 2 号、3 号、6
号、15 号峰分别为没食子酸、原儿茶酸、柯里拉京、
鞣花酸。确定 15 号峰鞣花酸为牻牛儿苗主要指标
成分，将其作为内参比峰(代表性色谱图见图 1)。
各色谱峰对内参比峰的相对保留时间定性，计算各
色谱峰对于其内参比峰的相对峰面积。若某一指纹
图谱在某相对保留时间处无峰，相对峰面积为 0，仍
给相应的峰号，以保证各色谱指纹图谱都有相同的
色谱峰数。
4. 5 相似度评价 将 23 个牻牛儿苗样品指纹图谱
的 AIA 数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评
价系统研究版(2004A)》软件，对上述药材进行相
似度评价，以辽宁大连药材(S1)作为参照谱图，多
—316—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(4)
图 1 样品高效液相色谱图
Fig 1 HPLC chromatogram of sample
点校正生成对照图谱 R，计算各样品指纹图谱与生
成的对照图谱 R的相似度，相似度在 0. 904 ～ 0. 992
之间，大部分样品相似度较高，但仍不能直接建立牻
牛儿苗药材指纹图谱的共有模式。需对牻牛儿苗各
药材进行进一步的评价样品间差异，进行图谱模式
识别分类，以便建立更加真实可靠的牻牛儿苗药材
标准指纹图谱。
4. 6 主成分分析 各牻牛儿苗样品经过上述实验
方法获得各自的色谱数据，以相对保留时间定位，以
对应的峰面积的积分值作为数据源，形成 23 个样本
数据矩阵。对数据矩阵进行主成分分析(PCA)后，
分别以其第一、第二、第三主成分建立坐标系，进行
投影即可得到所有样本的 PCA 平面和 3D 投影图
(图 2、图 3)。牻牛儿苗数据 PCA结果的 3D投影分
析见图 2，可见 9 号、19 号、20 号、22 号、23 号样品
与其他样品差距较大，排除在建立共有模式的样品
之外。PCA的平面投影分析见图 3，进一步缩小选
择范围，可见 1 号、2 号、3 号、4 号、5 号、6 号、7 号、
10 号、11 号、12 号、13 号、14 号、16 号、17 号、18 号、
21 号样品距离更近一些，作为备选样品。
图 2 主成分分析 3D投影图
Fig 2 3D PCA figure of samples
4. 7 系统聚类分析 以相对保留时间定位，以对应
的峰面积的积分值作为数据源，对 23 个样品数据进
行系统聚类分析，采用组间距离法(between － groups
linkage)、欧氏距离的平方(squared euclidean dis-
tance)作为测量的距离变量，聚类树形图见图 4，结合
PCA分析结果，将距离较远的 6号、16号样品排除。
4. 8 牻牛儿苗药材标准指纹图谱的建立 经上述
图 3 主成分分析平面投影图
Fig 3 PCA figure of samples
图 4 牻牛儿苗样品聚类分析
Fig 4 Hierarchical Cluster analysis of Erodium stephanianum Willd． sam-
ples
分析，参考主成分分析和系统聚类分析结果，取其中
14批投影距离最近的牻牛儿苗药材建立药材的标准
指纹图谱，14批牻牛儿苗的编号为:S1、S2、S3、S4、S5、
S7、S10、S11、S12、S13、S14、S17、S18、S21。将上述 14
批样品 AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似
度评价系统研究版(2004A)》软件，对上述药材进行
相似度评价，设定 S1 为参照，多点校正、匹配见图 5，
生成对照指纹图谱建立共有模式见图 6，并进行相似
度评价见表 2。相似度计算结果表明，14 批样品与对
照图谱比较，相似度均在 0. 978 以上。可为牻牛儿苗
药材的品质评价提供科学依据。
5 讨论
5. 1 流动相的选定 经比较，甲醇(A)和 0. 4%磷
酸水溶液(B)组成的流动相进行梯度洗脱的分离效
果较好，能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最
多。试验后发现，当 A相在 48%以后继续提高梯度
至 100%时，无其他物质色谱峰的出现，因而得到的
最合适梯度下全部物质在 70 min 内洗脱完毕，共检
测得到 18 个色谱峰，其中对没食子酸(7. 9 min )、
原儿茶酸(12. 8 min)、柯里拉京(29. 8 min)、鞣花酸
(55. 5 min)进行了峰的指认。
5. 2 检测波长的选择 本实验对不同的检测波长
进行考察，结果表明在 259 nm 下各峰分离良好，特
征峰明显且峰形较好，色谱图所包含的信息量最大，
基线较平稳，因此选定 259 nm 为指纹图谱的测定波
长。
—416— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(4)
图 5 14 批样品 HPLC指纹图谱
Fig 5 HPLC fingerprint for 14 batches of samples
图 6 牻牛儿苗对照指纹图谱
Fig 6 Reference fingerprint of Erodium stephanianum Willd．
表 2 14 批样品相似度评价结果
Tab 2 Similarities for 14 batches of samples
样品
(samples)
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14
对照图谱
(contrasting
illustration)
S1 1. 000 0. 993 0. 971 0. 966 0. 990 0. 961 0. 958 0. 949 0. 957 0. 977 0. 966 0. 957 0. 986 0. 961 0. 987
S2 0. 993 1. 000 0. 971 0. 969 0. 990 0. 964 0. 960 0. 950 0. 956 0. 977 0. 971 0. 953 0. 990 0. 963 0. 988
S3 0. 971 0. 971 1. 000 0. 967 0. 979 0. 975 0. 977 0. 972 0. 982 0. 981 0. 963 0. 981 0. 973 0. 986 0. 990
S4 0. 966 0. 969 0. 967 1. 000 0. 973 0. 959 0. 960 0. 953 0. 958 0. 964 0. 950 0. 952 0. 965 0. 964 0. 978
S5 0. 990 0. 990 0. 979 0. 973 1. 000 0. 970 0. 966 0. 957 0. 966 0. 980 0. 967 0. 960 0. 989 0. 969 0. 991
S7 0. 961 0. 964 0. 975 0. 959 0. 970 1. 000 0. 983 0. 979 0. 988 0. 977 0. 952 0. 983 0. 966 0. 989 0. 986
S10 0. 958 0. 960 0. 977 0. 960 0. 966 0. 983 1. 000 0. 995 0. 984 0. 987 0. 955 0. 986 0. 962 0. 989 0. 985
S11 0. 949 0. 950 0. 972 0. 953 0. 957 0. 979 0. 995 1. 000 0. 978 0. 983 0. 946 0. 985 0. 949 0. 984 0. 978
S12 0. 957 0. 956 0. 982 0. 958 0. 966 0. 988 0. 984 0. 978 1. 000 0. 978 0. 956 0. 989 0. 957 0. 992 0. 986
S13 0. 977 0. 977 0. 981 0. 964 0. 980 0. 977 0. 987 0. 983 0. 978 1. 000 0. 969 0. 984 0. 976 0. 983 0. 992
S14 0. 966 0. 971 0. 963 0. 950 0. 967 0. 952 0. 955 0. 946 0. 956 0. 969 1. 000 0. 952 0. 972 0. 965 0. 979
S17 0. 957 0. 953 0. 981 0. 952 0. 960 0. 983 0. 986 0. 985 0. 989 0. 984 0. 952 1. 000 0. 953 0. 991 0. 984
S18 0. 986 0. 99 0. 973 0. 965 0. 989 0. 966 0. 962 0. 949 0. 957 0. 976 0. 972 0. 953 1. 000 0. 967 0. 988
S21 0. 961 0. 963 0. 986 0. 964 0. 969 0. 989 0. 989 0. 984 0. 992 0. 983 0. 965 0. 991 0. 967 1. 000 0. 990
对照图谱 0. 987 0. 988 0. 990 0. 978 0. 991 0. 986 0. 985 0. 978 0. 986 0. 992 0. 979 0. 984 0. 988 0. 990 1. 000
(contrasting Illustration)
5. 3 主成分分析和聚类分析 应用了 PCA 投影法
和系统聚类分析法 2 种化学计量学方法对牻牛儿苗
药材色谱积分数据进行了模式识别的初探。根据
PCA的 3D和平面投影图，先对样品进行筛选;再结
合聚类分析结果，验证了 PCA 的筛选样品，再排除
个别样品，最终确定了入选的样品目录。结合 2 种
统计方法，牻牛儿苗色谱数据的 PCA 投影没有十分
明显的区分，各样品分布均匀，不能明确地分类，说
明牻牛儿苗之间既存在明显的差异又存在一定程度
的相关性。系统聚类分析法更能体现出分类样本间
内在的相互联系，较 PCA投影法更为细致。
参考文献
1 ChP(中国药典). 2005． Vol Ⅰ(一部) :263
2 CHEN Yu － wu(陈玉武) ，LI Ke － ming(李克明) ，LI Yao － lan(李
药兰) ，et al． Studies on chemical constituents of Erodium stephania-
num Willd．(牻牛儿苗化学成分研究)． Chin Tradit Herb Drugs(中
草药) ，2007，38(8) :1148
3 WEI Qun － de(魏群德)． Observation of curative effect of Geranium
wilfordii Maxim． mixtures on acute pharyngitis(老鹳草合剂治疗急
性咽炎的疗效观察)． Chin J Integr Tradit Chin Vest Med (中国中
西医结合杂志) ，1998，18(2) :12
4 LUO Yong － jiang(罗永江) ，HU Zhen － ying(胡振英) ，CHENG Fu
－ sheng(程富胜) ，et al． Research survey of pharmacological action
on Geranium wilfordii Maxim．(老鹳草的药理作用研究概况)． Chi-
na Anim Health(中国动物保健) ，2003，9:24
5 DU Xiao － ming(杜晓鸣) ，GUO Yong － si(郭永泗)． Geraniin and
its antioxidation(老鹳草素及抗氧化作用)． World Notes Plant Med
(国外医药·植物药分册) ，1990，5(2) :57
6 Term of Pharmacological Study on Chronic Bronchitis from Xian Med-
ical University(西安医学院慢性气管炎药理研究组)． Pharmaco-
logical study on Erodium stephanianum(绵绵牛的药理研究)．
Shaanxi Med J(陕西新医药) ，1978，6:42
7 FENG Ping － an(冯平安) ，JIA De － yun(贾德云) ，LIU Chao(刘
超) ，et al． Study on anti － inflammatory effect of Geranium wilfordii
Maxim(老鹳草抗炎作用的研究)． Clin J Anhui Tradit Chin Med
(安徽中医临床杂志) ，2003，15(6) :511
8 LIU Dai － lin(刘岱琳) ，HU Ying － qing(胡迎庆)． Experimental re-
search on crude extract of Geranium wilfordii Maxim． in suppressing
generation of nitric oxide in rat macrophages (老鹤草粗提取物抑制
大鼠巨噬细胞中一氧化氨发生的实验研究)． Med J Chin PAPF
(武警医学) ，2003，14(11) :18
(本文于 2011 年 4 月 13 日收到)
—516—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(4)