全 文 ：第 37 卷 福建热作科技 Vol.37 No.2
第 2 期 Fujian Science & Technology of Tropical Crops 2012
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台湾麻豆文旦 RAPD 反应条件的优化

蒲俊之，潘一山，朱 旸
（福建省漳州师范学院生物科学与技术系，漳州 363000）

摘要：在参考一般 RAPD 反应程序的基础上，经过反复试验，确定适合台湾麻豆文旦基因组 DNA 的 RAPD 扩
增程序为（总体积 10 ul）：模板 DNA5 ng，随机引物 33 ng，dNTP 1.5 ul，10×PCR buffer 1 ul，MgCl22.0 mmol/L，
Taq 酶 1U。95 ℃预热 2 min，94 ℃变性 30 s，38.7 ℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，30 个 cycle 后 72℃延伸 8 min。
关键词：麻豆文旦；RAPD；PCR 优化
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1006—2327—（2012）02—0001—03

麻豆文旦为台湾省台南县麻豆特产，台湾主栽柚类良种，现在广东、广西和福建有引种。麻豆文旦
树势较矮小，叶大而厚。果实呈梨形或广卵形，果面淡黄色，油胞大而微凸，果皮较薄，果实有的无核，
有的多核，无核者为优。果实可食率约 55%，果肉味浓，化渣，汁多、风味酸甜适中，一般无苦异味。
麻豆文旦花芽一般 8 月下旬开始进行生理分化，1 月中下旬至 2 月上旬抽出花枝，盛花期 3 月中旬末至
下旬，谢花 3 月下旬末至 4 月上旬初，谢花后 5－7d 花柱逐渐萎缩脱落，幼果迅速膨大。8 月上中旬是
汁胞迅速充实期，果实增重最为明显，8 月下旬至 9 月上旬成熟采收[1]。
RAPD（random amplified polymorphic DNA，RAPD，随机扩增多态性）它是以人工合成的随机寡聚
核苷序列为引物，以基因组总 DNA 为模板，利用 PCR 技术随机扩增得到一系列的多态性 DNA 片段。
该技术目前在作物抗病和抗虫分子标记的辅助育种、种质资源遗传多样性分析、动植物的种属鉴定等方
面应用广泛。
本试验以台湾麻豆文旦基因组 DNA 为模板，就 RAPD 反应体系中退火温度、模板 DNA 浓度、dNTP
的浓度、Mg2+浓度等因素进行优化，建立较为稳定的 RAPD-PCR 反应体系。
1 试验材料、药品、试剂与仪器
1.1 试验材料
台湾麻豆文旦叶片，采自漳州农科所。
1.2 试剂及药品
Taq DNA 聚合酶、dNTPs、10 × PCR Buffer、DNA Marker 购自大连 TaKaRa 公司，随机引物购自
上海生工生物工程技术有限公司，其它试剂均为国产分析纯试剂。
2 试验方法与步骤
2.1 提取基因组 DNA
使用改良 CTAB 法提取基因组 DNA：
将 0.2 g 的新鲜叶片液氮研磨，转入 1.5 ml 的离心管中，加入 2%CTAB 抽提液（65℃预热，2%β-
巯基乙醇）。混匀，65℃水浴 25 min，12000 rpm 离心 10 min，吸取上清并加入等体积的酚/氯仿/异戊醇
（25/24/1），混匀，12000 rpm 离心 5 min，取上清加入 1/10V 的 CTAB/Nacl 溶液和 700 ul 的氯仿，混匀，
12000 rmp 离心 5 min。取上层水相加入等体积 CTAB 沉淀液，上下颠倒 3～5 次。10000 rpm 离心 5 min，
沉淀用 200 ul 高盐 TE 重悬。加入等体积的异丙醇再次沉淀，沉淀用 80%的乙醇洗涤，离心，干燥，TE
重悬。-20℃冰箱保存或 4℃待用[2,3]。
资助项目：福建省科技厅重点项目（2011N0037）
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2.2 基因组DNA纯度及得率的检测
取6 ul的DNA样品稀释6倍，TE为空白对照，测定浓度以及在260 nm和280 nm下的吸光度，判断DNA
纯度。
2.3 RAPD-PCR 扩增体系的建立
2.3.1 标准反应体系
基准反应体系（总体积10 ul）：模板DNA 10 ng，随机引物40 ng，10× PCR buffer 1 ul，dNTP 1 ul
（0.25um），MgCl22.5 mmol/L，Taq酶1U。程序：95℃预热1 min，94℃变性45 s，40℃退火45 s，72℃延
伸45 s，30个cycle后72℃延伸10 min，4℃保存。
2.3.2 反应体系的优化
在基准反应体系的基础上进行五个因素的条件优化，每次改变一个扩增参数进行扩增：①退火温度：
PCR 仪设置温度范围为 36℃～42℃，共 8 个温度梯度（36.0℃、37.6℃、38.7℃、39.5℃、40.2℃、40.9℃、
41.7℃、42℃）。②随机引物用量：设置 5 个梯度（17 ng、24 ng、33 ng、41 ng、48 ng）；③模板浓度：
设置 5 个梯度（5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng）；④dNTP 浓度：设置 7 个梯度（0.25 ul、0.5 ul、0.75
ul、0.9 ul、1.0 ul、1.25 ul、1.5 ul）；⑤Mg2+浓度：设置 5 个梯度（1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、
2.5 mmol/L、3.0 mmol/L）。
扩增产物在 1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，EB 染色，观察并拍照记录。
3 实验结果与分析
3 .1 基因组DNA纯度及得率
紫外分光光度计所测得三个基因组 DNA 样品的 A260/A280比
值在 1.7～1.9 之间，纯度符合要求（表 1）。
3 .2 反应体系的优化
在 PCR 反应中，影响扩增特异性的重要因素之一是退火温
度。在一定温度范围内，随着退火温度的升高，扩增的特异性越强，但扩增效率较低；温度降低则引物
与模板非特异性配对机会增大。退火温度优化的结果显示在 38.7℃的扩增效果最为理想（图 1）。
从图 2 可以看出，在基准反应体系的基础上，其他条件不变，引物用量为 33 ng 时，扩增的条带数
较多，并且条带较为清晰，故选择最适引物用量为 33 ng。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5
图 1 不同退火温度对反应的影响 图 2 不同引物浓度对反应的影响
模板 DNA 浓度过低，则扩增效率降低，模板浓度过高也会使得扩增产物减少且不稳定。由图 3 看
出，其他反应条件不变，模板 DNA 用量为 5 ng 时，扩增条带清晰清晰明亮，效果最好。
dNTP 浓度过低，反应速度降低，获得产物量减少；浓度过高则容易与 Mg2+结合致使酶活性降低，
表 1 基因组 DNA 纯度及得率
样品编号 得率(ug/g·FW) A260/A280
1
2
3
149
142
127
1.816
1.729
1.921
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抑制主要条带的扩增。从图 4 的结果可以确定，其他反应条件不变，dNTP 用量 1.5 ul 为最佳。
M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5
图 3 不同浓度模板 DNA 对反应的影响 图 4 不同 dNTP 用量对反应的影响 图 5 Mg2+浓度对反应的影响
从图5看出，当Mg2+浓度为1 mmol/L时条带少，当Mg2+浓度为2 mmol/L时条带明显增多而且明亮清
晰。随着Mg2+浓度的进一步增加，条带逐渐变暗。高浓度的Mg2+会增加错配率，因此2.0 mmol/L是最佳
的Mg2+浓度。
由此确定，最佳反应体系及反应条件为（总体积10 ul）：模板DNA 5 ng，随机引物33 ng，dNTP 1.5 ul，
10×PCR buffer 1 ul，MgCl22.0 mmol/L，Taq酶1U。95℃预热2 min，94℃变性30 s，38.7℃退火45 s，72℃
延伸45 s，30个cycle后72℃延伸8 min。在最佳反应条件下用不同引物对基因组DNA进行扩增，获得了清
晰而明亮的条带（图6）。
4 讨论
建立在 PCR 技术基础上的 RAPD
技术同 RELP、DNA 指纹图谱法等其
他 DNA 多态性技术相比，具有检测效
率高、样品用量少、信息量大、灵敏
度高等特点和优势 [4]，因此，利用
RAPD 分子标记系统对柚类，特别是
对良种柚类进行种质资源的鉴定和育
种亲本的筛选，具有重要的实践指导
意义[5]。
任何分子标记技术的前提是获得
高质量的基因组 DNA 模板，模板的完整性和纯度直接关系到能不能获得高质量的、重复性好的图谱。
其次是适宜的反应条件的建立，为了得到清晰的多态性 DNA 条带，本试验中选择了退火温度、模板浓
度、引物浓度、dNTP、Mg2+浓度五个条件，设置不同的梯度来对 PCR 反应进行优化，以此建立了一个
最优的 PCR 反应体系，为以后的 RAPD 分析奠定了基础。

参考文献
[1]潘一山,董金龙.台湾麻豆文旦生长发育生理及主要栽培技术[J].台湾农业探索,2002,4(4):38-40
[2]黄文霞,何觉民,朱宏波.一种适于PCR扩增的蓖麻基因组DNA提取方法[J].农业生物技术科学,2007,11(23):61-63
[3]张国梅,徐腾,王晖.RAPD法鉴别几种益母草属生药[J],中药材,2009,6(6):885-887
[4]赵晓瑜,李继刚主编.实用分子生物学技术[M].北京:化学工业出版社,2006.105-106
[5]罗开梅,伍成厚,邹金美,等.柚类种质资源的分子标记研究进展[J],漳州师范学院学报(自然科学版),2005,50(4):78-80
图 6 最佳反应条件下不同引物对基因组 DNA 的扩增结果
注：1：S147 2：S465 3：S475 4：S1417 5：S1420 6：S1434 7：S1725
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