全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2014)04 － 1678 － 04
收稿日期:2014 － 01 － 12
基金项目:重庆市公益类科研院所基本科研业务费专项
(2012csts-jbky-00509);国家现代柑橘产业技术体系(CAＲS-27)
及国家科技支撑计划(2013BAD02B02)
作者简介:杨海健(1985 －)，男，河北，硕士，研究实习员，从事
柑橘遗传育种与种质创新研究，* 为通讯作者。
利用 SSＲ和 SＲAP标记分析香橙资源的遗传多样性
杨海健，周心智，谭 平* ，张云贵* ，弓亚林，杨世勇，钟昭林
(重庆市农业科学院果树研究所，重庆 401329)
摘 要:香橙是我国原产珍贵柑橘资源，具有很大的开发利用价值。为了进一步保护和利用该类资源，通过 2 种分子标记研究了 9
个香橙资源的多样性，并比较了这两种标记在分析植物多态性上的差异。结果显示:两标记均显示出 9 个香橙之间均存在不同程
度的差异，其中，3 号香橙和 8 号糖橙遗传距离最近，2 号香橙和 7 号软枝香橙距离最远。分析显示，SＲAP标记比 SSＲ 标记能够更
容易、更快捷的获得大量的多态性分子标记，而如果这两种标记相结合，将能获得更全面的扩增信息和更准确的聚类结果。
关键词:SSＲ;SＲAP;香橙;遗传多样性
中图分类号:S565． 1 文献标识码:A
Genetic Diversity Analysis of Junos by SＲAP and SSＲ Markers
YANG Hai-jian，ZHOU Xin-zhi，TAN Ping* ，ZHANG Yun-gui* ，GONG Ya-lin，YANG Shi-yong，ZHONG Zhao-lin
(Institute of Pomology，Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 401329，China)
Abstract:Citrus juno is a kind of precious resource which originates in China，and it is of great value in its application ． To further protect
and utilize this resource，we used two kinds of molecular markers to study the nine junos resource diversity，and compared the differences be-
tween the two markers on junos genetic diversity analysis． The results showed that the two markers were both showing varying degrees of
differences between the nine samples． Among them，the genetic distance between the 3rd and the 8th junos is the nearest，while that between
the 2nd and the 7th is the farthest． SＲAP is an easier and more efficient access to a large number of polymorphic markers than SSＲ． If these
two markers are combined，more comprehensive amplified information and more accurate cluster result would be obtained．
Key words:Citrus junos;Genetic diversity;SＲAP;SSＲ
重庆及其周边地区是我国香橙资源的分布区之
一，这些野生香橙资源由于未被及时开发而容易受
到人们忽视，进而遭到破坏。目前已有的研究显示，
香橙是我国原产并具有较大发展潜力的砧木资
源［1 ～ 3］。因此，加大对香橙资源的保护和开发力度，
有利于进一步研究它在柑橘砧木及未来其它未知方
面的应用。
分子标记具有不受环境条件约束、标记数量多、
遍及整个基因组和多态性高等许多优点，使得其在
遗传多样性研究中得到非常广泛的应用。SＲAP
(Sequence-related amplified polymorphism)和 SSＲ
(Simple sequence repeat)标记均具有多态性丰富、对
DNA含量要求低、操作简单、重复性好等优点，并且
已成熟的应用到包括柑橘在内的多种植物中［4 ～ 5］。
比较 SSＲ和 SＲAP两种标记在研究香橙资源的遗传
多样性、评价遗传差异等工作中的优劣，可为今后该
砧木的分子辅助育种工作提供参考。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
本实验材料为 9 个香橙资源，2013 年 5 月于重
庆农科院果树所资源圃(江津)采集。表 1 中带有
编号的资源均为未命名的野生资源。
1． 2 试验方法
采集 9 个香橙资源的叶片，冷藏并带回实验室
做清洗处理。采用 CTAB法小量提取样品的基因组
DNA并检测浓度和质量。分别利用 SＲAP 和 SSＲ
的引物对 DNA样本进行 PCＲ扩增、6 %聚丙烯酰胺
凝胶电泳技术进行扩增产物的分离。
8761
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2014 年 27 卷 4 期
Vol. 27 No. 4
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2014.04.074
表 1 9 份样品材料
Table 1 9 samples for experiment
编号
No．
名称
Name
学名
Genera species
编号
No．
名称
Name
学名
Genera species
1 香橙① Junos① Citrus junos Sieb． ex Tanaka 6 硬枝香橙 Hardwood Junos C． junos Sieb． ex Tanaka
2 香橙② Junos② C． junos Sieb． ex Tanaka 7 软枝香橙 Soft branch Junos C． junos Sieb． ex Tanaka
3 香橙③ Junos③ C． junos Sieb． ex Tanaka 8 永新香橙 Yongxin Junos C． junos Sieb． ex Tanaka
4 香橙④ Junos④ C． junos Sieb． ex Tanaka 9 糖橙 Tangcheng C． junos Sieb． ex Tanaka
5 香橙⑤ Junos⑤ C． junos Sieb． ex Tanaka
PCＲ扩增反应在 Applied Bio systems 梯度 PCＲ
仪上进行。两种标记的引物均来自已公开发表的文
献［6 ～ 9］，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合
成。PCＲ扩增体系分别参照李巧燕等［10］和刘勇［11］
的方法进行。采用北京六一电泳槽电泳，凝胶采用
银染和显色，获得清晰标记图谱。
根据差异条带的有无构建数据矩阵(其中因部
分条带模糊而影响判断分析的，处于同一位置的所
有其它条带均不计算在内)，利用 NTSYS-pc2． 1 软
件，按 UPGMA(unweighted pair group method using a-
rithmetic averages)方法聚类分析，构建亲缘关系树
图。
2 结果与分析
2． 1 引物的筛选
在分子标记前，为获得谱带清晰的引物，利用 2
个香橙资源对 50 对 SＲAP引物和 30 对 SSＲ引物进
行筛选。筛选出 29 对 SＲAP引物和 14 对 SSＲ引物
具有较清晰谱带。其中有明显差异条带的引物分别
为 28 对和 12 对(表 2，表 3)。
2． 2 扩增结果
2． 2． 1 SSＲ扩增结果 14 对表现较好的 SSＲ 引物
中，有 12 对引物具有差异条带，多态性引物占比为
85． 7 %。具有多态性的 12 对引物在 9 个香橙资源
中共扩增出 70 个位点，其中差异位点为 55 个，多态
性比率为 78． 6 %。每对引物可扩增出 2 ～ 13 个位
点，平均每对可产生 4． 6 个差异位点，引物多态性最
高为 100 %，最低为 50 %。引物 TAA15 扩增出的
表 2 SＲAP引物
Table 2 Primers for SＲAP analysis
引物名称 Primer name
me3f-em4r me3f-em5r me3f-em6r me3f-em7r me3f-Em7r me3f-Em9r me3-Em10
me4f-em4r me4f-em5r me4f-Em8r me5f-em6r me5f-em7r me5f-Em10r ME7F-em4r
ME7F-em5r ME7F-em6r ME7F-em7r ME7F-Em7r ME7F-Em10r ME8F-em3r ME8F-em5r
ME8F-em6r ME8F-Em9r ME8F-Em10r ME10F-em3r ME10F-em5r ME10F-em7r ME10F-Em7r
注:SＲAP引物序列可从相关文献中查找［6 ～ 8］。
Note:The primer sequences for SＲAP are available from the literature ［6 － 8］．
表 3 SSＲ引物
Table 3 Primers for SSＲ analysis
引物
Primer
序列(5-3)
Sequences
引物
Primer
序列(5-3)
Sequences
TAA1 5-GACAACATCAACAACAGCAAGAGC-35-AAGAAGAAGAGCCCCCATTAGC-3 CMS20
5-GGAGCATATAAGCATAAACACC-3
5-AGGAAAACGCATAAACCGTG-3
TAA15 5-GAAAGGGTTACTTGACCAGGC-35-CTTCCCAGCTGCACAAGC-3 CMS31
5-CGTGCAGAGAAACTCAGATCC-3
5-GCTGAAAAAGATTCATTTTGCC-3
TAA41 5-AGGTCTACATTGGCATTGTC-35-ACATGCAGTGCTATAATGAATG-3 CMS39
5-CTCAGCTCTCTGTCTCTCCTCC-3
5-CTGGAGCAGGGTGACCTATC-3
TAA45 5-GCACCTTTTATACCTGACTCGG-35-TTCAGCATTTGAGTTGGTTACG-3 CT21
5-CGAACTCATTAAAAGCCGAAAC-3
5-CAACAACCACCACTCTCACG-3
CMS8 5-CCAAACATCTGCGGATCC-35-AGAAGAACCCAGATTCCAAATG-3 TG16
5-TGTTGCGCAGTTATTCTCAAA-3
5-CCGACCACTTTTACCCACTG-3
CMS10 5-TATGGTGGCAGATTAACAGCC-35-TACTCCGGAGAAAGATTTGGG-3 AAT12
5-TTGCCAAGAGATTAAACGAACA-3
5-GACGAGAGGTCCAGAAATCG-3
97614 期 杨海健等:利用 SSＲ和 SＲAP标记分析香橙资源的遗传多样性
1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9
图 1 引物对 CMS31 获得的 SSＲ 标记图(1 － 9 为材料
编号，与表 1 对应)
Fig． 1 SSＲ fingerprints by CMS31 primer pair(1 － 9 were the sam-
ple numbers，correspond to table 1)
位点有 13 个之多，CMS10 最少，只有 2 个，显示了不
同引物之间的巨大差异。
2． 2． 2 SＲAP 扩增结果 29 对表现较好的 SＲAP
引物中，有 28 对引物具有较明显差异，多态性引物
占比为 96． 6 %。28 对引物组合在 9 个香橙材料中
共扩增出 1100 个位点，其中 244 个属差异位点，多
态性比率为 22． 2 %。每对引物可扩增出 24 ～ 71 个
清晰位点，平均值为 39． 3 个，获得差异位点在 1 ～
25 个之间，平均值为 8． 7 个。28 个 SＲAP 引物中，
差异位点获得最多的是引物 ME10F-Em7r，多态性
最高，为 65． 8 %。最少的是 ME7F-em6r，多态性最
低，只有 2． 6 %。引物之间同样存在较大差异。
2． 3 聚类分析
2． 3． 1 SSＲ聚类结果 利用 SSＲ 标记对 9 个香橙
资源进行聚类分析，获得遗传聚类图(图 3)。在相
似系数为 0． 813 时，可将香橙聚为 3 类，即永新香橙
和软枝香橙单独分为两类，其余 7 个香橙聚为一类。
结合生成的遗传相似度表，可知在这 9 个香橙中，平
均遗传相似系数为 0． 843，变幅为 0． 733 ～ 0． 966。
其中，3 号香橙和 8 号糖橙遗传距离最近(0． 966)，2
号香橙和 7 号软枝香橙距离最远(0． 733)。
2． 3． 2 SＲAP聚类结果 SＲAP聚类结果如图 4 所
1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9
图 2 引物ME10F-EM7r获得的 SＲAP标记图(1 ～ 9 为
材料编号，与表 1 对应)
Fig． 2 SＲAP fingerprints by ME10F-EM7r primer pair(1 － 9 were
the sample numbers，correspond to table 1)
示，当相似系数在 0． 859 时，可将 9 个香橙资源聚为
3 类，即永新香橙单独为一类，3 号香橙、糖橙和软枝
香橙为第二类，其余 5 个香橙为第 3 类。遗传相似
度表显示，3 号香橙和 8 号糖橙相似系数达 0． 974，
为遗传距离最近，而 2 号香橙和 7 号软枝香橙最远，
为 0． 817。在判断遗传距离最近和最远的香橙类型
上，SＲAP与 SSＲ获得了相同的结果。
3 结论与讨论
SＲAP和 SSＲ两种标记结果均显示出不同香橙
资源之间存在着不同程度的差异，说明资源圃中的
图 3 SSＲ标记树状图
Fig． 3 UPGMA dendrogram by SSＲ marker
0861 西 南 农 业 学 报 27 卷
图 4 SＲAP标记树状图
Fig． 4 UPGMA dendrogram by SＲAP marker
香橙资源存在多样性。9 个香橙资源的聚类分析显
示了这两种分子标记在分析水平上存在差异。在引
物筛选时，发现 SＲAP 多态性引物率较 SSＲ 大。两
种标记在引物的多态性比率和引物平均差异条带数
量上相差悬殊，前者，SSＲ 是 SＲAP 的 3 倍多，但从
后者看，SＲAP 又是 SSＲ 的将近 2 倍。这些表明
SＲAP引物在标记亲缘关系较近的植物时能大量扩
增出条带，其中无差异带和差异带的数量均大量超
过 SSＲ 引物。另外，两种标记的引物均显示出扩增
位点数量差异较大的特点。
两种标记在分析结果上存在相似之处，当把香
橙聚为 3 类时，两标记都将永新香橙单独归类，表明
永新香橙与其它香橙的关系较远。而在软枝香橙与
其它香橙的关系上，两标记稍有差异，但都显示出软
枝香橙与其它大部分香橙关系较远的特征。同时，
两标记生成的遗传相似度表显示，在两两香橙亲缘
关系最近和最远的划分上也得到了一致的结果，即
3 号香橙和 8 号糖橙遗传距离最近，2 号香橙和 7 号
软枝香橙最远。
本研究显示，在香橙遗传多样性分析中，利用
SＲAP标记比 SSＲ 标记能够更容易、更快捷的获得
大量的多态性标记条带。但 SＲAP 标记是对开放阅
读框(open reading frames，OＲFs)进行 PCＲ 扩增，对
基因相对较少的着丝粒附近和端粒的扩增会较
少［12］，单独利用 SＲAP标记进行扩增可能会造成部
分信息的缺失。SSＲ 标记在整个基因组中平均分
布，扩增范围可覆盖 SＲAP 缺失区域，因此，如果采
用这两种标记相结合的方式对样品材料进行扩增，
将使得聚类信息更全面，结果更准确。
香橙是我国原产柑橘野生资源，被认为是很有
发展潜力的柑橘砧木资源，而目前关于香橙的研究
并不深入，且随着人类的频繁活动，使得部分资源遭
到破坏。及时开发并保护香橙资源对未来柑橘砧木
育种和柑橘产业发展意义重大。
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( 责任编辑 姚永红)
18614 期 杨海健等:利用 SSＲ和 SＲAP标记分析香橙资源的遗传多样性