全 文 ：紫地榆两种不同溶剂萃取物对变异链球菌的体外实验
杨 淋， 蓝 海*
(大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000)
收稿日期:2014-10-11
基金项目:国家自然科学基金 (81260512);云南省大理学院应用开发研究基金 (Kyyy201102)
作者简介:杨 淋 (1991—) ，女，硕士。Tel:15125258945，E-mail:862376190@ qq． com
* 通信作者:蓝 海 (1964—) ，女，教授，硕士生导师，主要从事天然药物防龋研究。Tel:13769225179，E-mail: lanhai8696@
126． com
摘要:目的 研究紫地榆粗提物乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌生长、产酸及黏附的影响。方法 首先测定紫地
榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌最低抑菌浓度 (MIC) ，选择大于 MIC的浓度测定其对变异链球菌最低杀菌浓
度 (MBC)，再以低于 MIC 的 4 个浓度配制含药的 TPY液体培养基测定紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产
酸、黏附的影响。结果 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌的生长、产酸及黏附有一定的抑制作用。结论
上述结果提示，紫地榆有可能是一种潜在的天然防龋药物，值得进行更深入的研究。
关键词:紫地榆;萃取物;变异链球菌;最低抑菌浓度;最低杀菌浓度;产酸;黏附
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2015)08-1843-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 08. 048
龋病是人类继心血管疾病和癌症之后的第三种需要重
点防治的疾病，全球 60% ～ 90%的儿童和成人都因龋病而
困扰。2010 年，全球有超过 50 亿的人患过龋病［1］。目前，
我国的龋病发病率高达 70% ～80%，在婴幼儿中高达 90%
以上，龋病防治工作迫在眉睫。变异链球菌是口腔中的主
要常驻菌之一，是龋病的主要致病菌，已被公认为口腔的
主要致龋菌［2］。本研究探讨紫地榆乙酸乙酯部分和水部分
对变异链球菌生长、产酸及黏附的影响，为了解该药物在
龋病防治中的作用提供参考。
1 材料
紫地榆 (产地云南，大理大学生药教研室杨月娥高
级实验师鉴定为紫地榆)，变异链球菌 ATCC 25175 (广东
微生物菌种保藏中心)，胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母
提取物 (trypticase-phytone-yeast extract medium，TPY)固
体及液体培养基，0. 5、0. 1 mol /L 氢氧化钠，0. 5 mol /L
磷酸盐 (PBS)缓冲液，蔗糖，无水乙醇，葡萄糖，蒽
酮，石油醚，三氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇。以上试剂均
为分析纯。
2 方法
2. 1 紫地榆粗提物的制备 将原药材粉碎，用 95%乙醇
常温浸泡 24 h，把滤液旋转蒸发成浸膏后加适量蒸馏水溶
解，用石油醚，三氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水萃
取，所得的各部分冷冻干燥后得粉末备用。石油醚部分的
相对生药得率很小 (小于 0. 1%)，三氯甲烷部分、乙酸乙
酯部分、正丁醇部分和水部分的相对生药得率分别为
0. 192 7% ～ 0. 308 4%、8. 017 2% ～ 9. 456 9%、9. 048 1%
～11. 323 3%、2. 341 1% ～3. 198 3%。
2. 2 菌液制备 将复苏 48 h 后的变异链球菌，接种于
TPY液体培养基中，在 37 ℃、80% N2，20% CO2、厌氧
条件下培养 18 h。经生化鉴定及涂片检查为纯培养后，将
细菌在 TPY固体培养基上传代，用无菌棉签取 TPY固体培
养基上的二代菌落于无菌生理盐水内，将菌液调至相当于
0. 5 号麦氏标准比浊管的浓度，配成 630 nm 波长处菌液浓
度光密度值 (optical density，OD 值)约为 0. 1 的菌悬液，
备用。
2. 3 MIC 及 MBC 的测定 将紫地榆乙酸乙酯部分和水部
分分别按 2 倍稀释法溶于含 1%葡萄糖的 TPY 液体培养基
中，使其终质量浓度分别为 72. 00、36. 00、18. 00、9. 00、
4. 500、2. 250、1. 125、0. 563 0 mg /mL。将菌悬液与含药
液的培养基按 1 ∶ 1 (V /V)比例，加入 96 孔板后置 37 ℃，
80% N2，20% CO2 厌氧条件下培养 48 h，以肉眼观察无细
菌生长的最低药物质量浓度为其 MIC值。选择大于 MIC浓
度的各孔，分别取 20 μL涂布于 TPY 固体培养基上，相同
条件下培养 48 h，观察菌落数少于 5 ～ 6 个的最低浓度为最
低杀菌浓度 (MBC)［3］，实验重复 3 次。
2. 4 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产酸作用
的影响 根据紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对上述变异链
球菌的 MIC测定结果，选取 MIC值以下 4 个浓度梯度配制
成含 1%葡萄糖的 TPY液体培养基，调定初始 pH为 7. 4 并
按菌液与 TPY 液体培养基比例为 1 ∶ 10 (V /V)比例接种此
菌，置 37 ℃，80% N2，20% CO2 下厌氧培养 48 h。用 O-
ＲION 710A型 pH计测定培养物上清液的 pH 值计算 pH 的
变化值△pH (初始 pH －终末 pH)。以不含药物的培养基
中细菌的产酸量作为阴性对照，以含 0. 05%洗必泰的培养
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基中细菌的产酸量作为阳性对照，实验共分 6 组，即 4 个
不同浓度的实验组、1 个阳性对照组、1 个阴性对照组，每
组设 3 个平行管，实验重复 3 次。
2. 5 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌黏附作用
的影响 采用 2 倍稀释法将含 5%蔗糖和含紫地榆乙酸乙
酯部分、水部分的 TPY液体培养基配成 MIC以下 4 个浓度
梯度的实验组，另设 1 个不含药液的阴性对照组，一个含
0. 05%洗必泰的阳性对照，每组 3 个平行管。将菌悬液与
药液按体积比 1 ∶ 10 接种，各试管混匀，置管与地平面呈
30°，置 37 ℃，80% N2，20% CO2 下厌氧培养 48 h。将试
管中液体轻轻移去，将黏附到试管壁的细菌用磷酸盐缓冲
液洗脱，每次 3 mL，共计 3 次，然后 3 000 r /min 离心 20
min，收集细菌置于 2 mL 蒸馏水中混匀。各试管均吸取
200 μL于 96 孔板，用酶标仪测定 630 nm 波长处 OD 值，
重复测 3 次，结果取平均值，并计算黏附抑制率。
黏附抑制率 = (阴性对照组 OD630nm －实验组 OD630nm) /阴
性对照组 OD630nm × 100%
2. 6 统计学分析 采用 SPSS 17. 0 统计软件，数据变量资
料用 (x ± s)表示，检验水准 α = 0. 05，各组总体均数之
间比较采用单因素方差分析 (ANOV，Analysis of vari-
ance);两两比较用 Dunnett T3 检验。
3 结果
3. 1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌生长的影
响 紫地榆乙酸乙酯部分对变异链球菌的 MIC和MBC分别
为 4. 500 mg /mL，72. 00 mg /mL。
紫地榆水部分对变异链球菌的 MIC 和 MBC 分别为
18. 00 mg /mL，288. 0 mg /mL。
3. 2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产酸作用
的影响 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变形链球菌产酸
作用的影响见表 1 和图 1。
随着紫地榆乙酸乙酯部分质量浓度的升高，△pH值越
来越小。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不
全相等 (F = 3290. 116，P ＜ 0. 01)，经 Dunnett T3 检验各实
验组的△pH值与阴性对照组和阳性对照组相比，均具有统
计学差异 (P ＜ 0. 05) ;4 个实验组间，任意两组间均具有
统计学差异 (P ＜ 0. 05)。
随紫地榆水部分质量浓度的增加，△pH值的变化不明
显。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不全相
等 (F = 3501. 803，P ＜ 0. 01)，经 Dunnett T3 检验，各实验
的△pH值与阴性对照组和阳性对照组相比，均具有统计学
差异 (P ＜ 0. 05);4 个实验组间，任意两组间均不具有统
计学差异 (P≥0. 05)。
表 1 不同浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产酸作用的影响 (x ± s，n =9)
乙酸乙酯部分 水部分
质量浓度 /(mg·mL －1) △pH值 质量浓度 /(mg·mL －1) △pH值
2. 250 0. 866 4 ± 0. 028 8a，b，c 9. 00 0. 640 6 ± 0. 036 9a，b
1. 125 0. 971 7 ± 0. 032 9a，b，c 4. 500 0. 6403 ± 0. 049 1a，b
0. 563 0 2. 635 8 ± 0. 280 7a，b，c 2. 250 0. 666 4 ± 0. 057 6a，b
0. 281 0 3. 263 6 ± 0. 175 6a，b，c 1. 125 0. 681 4 ± 0. 073 1a，b
阴性对照组 3. 549 4 ± 0. 045 2 阴性对照组 2. 629 7 ± 0. 147 8
阳性对照组 0. 745 1 ± 0. 075 2 阳性对照组 0. 731 7 ± 0. 081 6
注:与阴性照组比较，a P ＜ 0. 05;与阳性照组比较，b P ＜ 0. 05;任意两实验组比较，c P ＜ 0. 05
图 1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物
对变异链球菌产酸的影响
3. 3 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌黏附作用
的影响 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变形链球菌黏附
的影响见图 2 和表 2。
随着紫地榆乙酸乙酯部分质量浓度的升高，黏附抑制
率也随之增高。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体
均数不全相等 (F = 342. 213，P ＜ 0. 01)，经 Dunnett T3 检
验，各浓度组 OD 值与阴性对照组和阳性对照组相比，均
具有统计学差异 (P ＜ 0. 05);4 个实验组间，除 0. 563 0
mg /mL与 0. 281 0 mg /mL比较不具有统计学差异外，其他
任意两组比较均具有统计学差异 (P ＜ 0. 05)。
随着紫地榆水部分质量浓度的升高，黏附抑制率也随
之增高。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不
全相等 (F = 754. 271，P ＜ 0. 01)，经 Dunnett T3 检验，各
浓度组 OD值与阴性对照组和阳性对照组相比，均具有统
计学差异 (P ＜ 0. 05)。4 个实验组间，除 9. 00 mg /mL 与
4. 500 mg /mL比较不具有统计学差异，其他任意两组比较
均具有统计学差异 (P ＜ 0. 05)。
图 2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物
对变异链球菌黏附的影响
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表 2 不同质量浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌黏附作用的影响 (x ± s，n =9)
乙酸乙酯部分 水部分
质量浓度 /(mg·mL －1) OD值 黏附抑制率 /% 质量浓度 /(mg·mL －1) OD值 黏附抑制率 /%
2. 250 0. 195 7 ± 0. 060 9a，b，c 64. 98 9. 00 0. 277 4 ± 0. 022 8a，b 62. 23
1. 125 0. 246 3 ± 0. 039 6a，b，c 55. 93 4. 500 0. 293 3 ± 0. 033 8a，b 59. 95
0. 563 0 0. 286 3 ± 0. 044 0a，b 48. 96 2. 250 0. 354 1 ± 0. 068 6a，b，c 51. 60
0. 2810 0. 317 4 ± 0. 034 9a，b 43. 20 1. 125 0. 491 5 ± 0. 056 4a，b，c 33. 09
阴性对照组 0. 558 8 ± 0. 060 0 － 阴性对照组 0. 736 9 ± 0. 048 3 －
阳性对照组 0. 043 4 ± 0. 004 5 92. 23 阳性对照组 0. 043 4 ± 0. 004 5 92. 23
注:与阴性照组比较，aP ＜ 0. 05;与阳性照组比较，b P ＜ 0. 05;任意两实验组比较，c P ＜ 0. 05
4 讨论
紫地榆是栊牛儿苗科老鹳草属植物 Geranium trictipes
Ｒ． Kunth的根，民间称隔山消。具有显著的消炎、止血、
止痢功能，用于肠炎，痢疾，消化不良，慢性胃炎，月经
不调，鼻衄;外用治跌打损伤［4-6］。张娴文［7］、洪小凤［8］
等通过紫地榆的体外抗菌实验证实紫地榆提取物具有良好
的体外抗菌作用，其主要的化学成分有［9-10］:没食子酸、
鞣花酸、原儿茶酸、五倍子酸甲酯、(+)-儿茶素、3，4 -
二羟基苯甲酸等。
变异链球菌的致龋毒力因子主要是对牙面的产酸、黏
附、生成水不溶性胞外多糖。在成熟菌斑深层的缺氧环境
中变异链球菌主要通过糖酵解途径分解糖而代谢产酸，从
而使局部 pH 下降，造成牙体硬组织酸蚀脱矿、有机物分
解，进而导致龋病的形成和发展［11］。本实验测定紫地榆乙
酸乙酯部分与变异链球菌共同培养 48 h后的 pH变化发现，
0. 563 0 ～ 2. 250 mg /mL 不同质量浓度的紫地榆乙酸乙酯部
分和 1. 125 ～ 9. 00 mg /mL不同质量浓度的紫地榆水部分对
变异链球菌培养上清液的 pH 下降均具有明显影响 (P ＜
0. 05)，提示紫地榆乙酸乙酯部分和水部分能抑制变异链球
菌的产酸。
变异链球菌在牙面上黏附和定植是龋病发生的始动因
子。实验结果显示，0. 563 0 ～ 2. 250 mg /mL 不同质量浓度
的紫地榆乙酸乙酯部分和 1. 125 ～ 9. 00 mg /mL 不同质量浓
度的紫地榆水部分均能明显抑制变异链球菌的黏附能力
(P ＜ 0. 05);且其抑制作用随着紫地榆乙酸乙酯部分质量
浓度和紫地榆水部分质量浓度的增加而明显增强，提示紫
地榆乙酸乙酯部分和水部分能有效抑制变异链球菌的黏附
能力。本实验所示的变异链球菌的产酸量和黏附率均是用
OD值约为 1 的同一菌悬液实验的结果。变异链球菌的产酸
量和黏附率与紫地榆萃取物抑制或杀伤变异链球菌的菌量
呈负相关，即药物质量浓度越高，抑制或杀伤变异链球菌
的菌量越多，故其产酸量和黏附率越低。
醋酸洗必泰又称醋酸氯己定 (chlorhexidine acetate，
CA)是阳离子表面活性剂，对细菌有良好的亲和力，能结
合到细菌的细胞膜表面，改变膜的渗透性，造成细胞内物
质流出、细胞浆沉淀和凝集，从而杀灭细胞。刘建宁等［12］
研究证实，洗必泰漱口液可以有效地控制菌斑，减轻牙龈
炎的程度。本实验结果显示，紫地榆水部分抑制变异链球
菌产酸的能力比 0. 05%的洗必泰强，且具有显著性差异
(P ＜ 0. 05);紫地榆乙酸乙酯部分抑制变异链球菌产酸的
能力比 0. 05%的洗必泰弱，且显著性差异较明显 (P ＜
0. 05) ;紫地榆乙酸乙酯部分和水部分抑制变异链球菌黏附
的能力均比 0. 05%的洗必泰弱，可能因为 0. 05%的洗必泰
抗菌作用强，在短时间内细菌被杀死。天然植物的抑菌作
用可能不及化学试剂洗必泰，但长期使用洗必泰会有牙齿
变色、味觉障碍等副作用，因此本研究为寻找副作用较轻
的天然防龋药物打下基础。
综上所述，紫地榆乙酸乙酯部分和水部分可抑制变异
链球菌的产酸、黏附的作用，具有抗菌斑、预防龋病的潜
力。本研究为紫地榆乙酸乙酯部分在口腔防龋方面的应用
做出初步探索，而其药物有效成分、防龋具体机制的研究
还有待于进一步深入。
致谢:大理大学病原微生物学综合实验室提供支持!
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