全 文 ：浙 江 农 林 大 学 学 报， 2014， 31（6）： 823 - 830
Journal of Zhejiang A＆ F University
doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2014.06.001
‘无籽’ 瓯柑 CsLTP和 CsLOX基因的克隆与表达分析
张 敏1， 刘志辉1， 宋雪恩2， 朱咪咪1， 党婉誉1， 颜福花3， 张 迟 1，4
（1. 浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地， 浙江 临安 311300； 2. 浙江省平湖市乍浦
镇农技水利服务中心， 浙江 平湖 314200； 3. 浙江省丽水市林业科学研究院， 浙江 丽水 323000； 4. 浙
江农林大学 浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室， 浙江 临安 311300）
摘要： 采用同源序列法， 结合 cDNA 末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends， RACE）技术， 克隆获得 ‘无
籽’ 瓯柑 Citrus suavissima ‘Seedless’ 脂转移酶基因 CsLTP 和脂氧合酶基因 CsLOX 的全长 cDNA 序列； CsLTP cD-
NA全长 667 bp， 1个开放阅读框， 编码 215个氨基酸， 与脐橙 C. sinensis， 粗柠檬 C. jambhiri 的脂转移蛋白的相似
性分别为 95%和 60%； CsLOX cDNA 全长 2 915 bp， 1 个开放阅读框， 编码 895 个氨基酸， 与粗柠檬、 美洲黑杨
Populus deltoids 的相似性分别为 99%和 51%。 荧光定量聚合酶链式反应（PCR）表明： CsLTP 和 CsLOX 的表达量均在
‘无籽’ 瓯柑花粉粒形成期开始显著下降， 并显著低于普通瓯柑 Citrus suavissima。 ‘无籽’ 瓯柑花粉发育过程中油
脂的转运及氧化的异常， 可能成为 ‘无籽’ 瓯柑花粉败育的原因之一。 图 6参 33
关键词： 园艺学； ‘无籽’ 瓯柑； 花粉败育； CsLTP； CsLOX； 荧光定量 PCR
中图分类号： S603 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2014）06-0823-08
Cloning and expression analysis of CsLTP and CsLOX in
seedless Ougan （Citrus suavissima ‘Seedless’）
ZHANG Min1, LIU Zhihui1, SONG Xueen2, ZHU Mimi1, DANG Wanyu1, YAN Fuhua3, ZHANG Chi1,4
（1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an
311300, Zhejiang, China; 2. Center of Agro-technical & Water Resources Service of Zhapu Town, Pinghu 314200,
Zhejiang, China; 3. Lishui Academy of Forestry, Lishui 323000, Zhejiang, China; 4. The Key Laboratory for Quality
Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang,
China）
Abstract: To gain new insight into the male sterile characters of seedless Ougan, homologous cloning was un-
dertaken for clones of full length cDNAs of CsLTP （lipid transfer protein） and CsLOX （lipoxygenase） genes of
seedless Ougan （Citrus suavissima ‘Seedless’）. Then, bioinformatic analyses were performed online to predict
the characteristics of encoded proteins. The expression model of CsLTP and CsLOX with pollen development
was analyzed through real time polymerase chain reaction （PCR）, and statistic analysis was performed by Dun-
can’s multiple comparison test. The cDNA of CsLTP was 667 bp in length encoding 215 amino acids, which
was similar to LTPs of Citrus sinensis （95%） and Citrus jambhiri （60%）. The cDNA of CsLOX was 2 915 bp
in length encoding 895 amino acids, which was similar to LOXs of C. jambhiri （99%） and Populus （51%）.
Compared to seedy Ougan, the mRNA transcripts of CsLTP and CsLOX in seedless Ougan decreased noticeably
（P＜0.05） after the pollen formation stage leading to aberrant lipid transportation and oxygenation in seedless
收稿日期： 2014-05-08； 修回日期： 2014-06-03
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（31000897）； 浙江省自然科学基金资助项目（Y3090494）； 浙江农林大
学科研发展基金资助项目（2007FR106）
作者简介： 张敏， 副教授， 博士， 从事经济林遗传育种研究。 E-mail: mzhang@zafu.edu.cn。 通信作者： 张迟，
博士， 从事园艺植物遗传育种与分子生物学研究。 E-mail: zhangchi1978@zafu.edu.cn
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Ougan. Thus, the turbulence of lipid metabolism was related to pollen abortion in seedless Ougan.［Ch, 6 fig. 33
ref.］
Key words: horticulture; seedless Ougan （Citrus suavissima ‘Seedless’ ）; pollen abortion; CsLTP; CsLOX;
real-time PCR
瓯柑 Citrus suavissima 是浙江南部地区的一个古老的地方栽培种， 具有祛热生津、 清凉解毒等特殊
的医药功效， 素有 “端午瓯柑似羚羊” 之说。 ‘无籽’ 瓯柑 Citrus suavissima ‘Seedless’ 是瓯柑的无
核突变体， 2004 年 2 月通过浙江省林木良种审定委员会的良种认定并命名 ［1］。 前期的研究 ［2－4］表明： 花
粉败育是 ‘无籽’ 瓯柑无核的原因之一。 植物雄性不育是指植物有性繁殖过程中不能产生正常的花药、
花粉或雄配子的遗传现象。 雄性不育可以分为细胞核雄性不育（NMS）及质核互作雄性不育（CMS）。 关于
植物 CMS 分子机制， 普遍认为与呼吸链和三磷酸腺苷（ATP）合成基因的嵌合基因以及核糖核酸（RNA）
的编辑等有关［5－7］。 胡志勇等［8］成功地从温州蜜柑 Citrus unshui克隆到了 3个线粒体基因 atp6， cob 和 cox
Ⅱ的片段， 它们分别编码 F1F0-ATP 合成酶的第 6 亚基、 细胞色素 b 的亚基和细胞色素 C 氧化酶复合体
的第 2 亚基， 并通过实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）技术证明了这 3 个基因在小孢子发育
后期一直到形成成熟的花粉粒的过程中线粒体基因的表达减弱， 即供给小孢子发育的能量可能在减少，
进而导致了花粉的败育， 由此推测温州蜜柑的雄性不育与呼吸作用及能量代谢的异常相关。 Qiu 等［9］在
对 ‘无籽’ 椪柑 Citrus reticulata ‘Seedless’ 差异表达基因的分析研究中， 筛选到一些参与雄配子体发育
的基因。 本课题组从 ‘无籽’ 瓯柑和普通瓯柑的数字基因表达谱（digital gene expression， DGE）中筛选出
2 个脂类代谢相关的基因片段 LTP（lipid transfer proteins）和 LOX（lipoxygenase）（另文发表）。 植物转脂蛋
白（lipid transfer proteins， LTPs）是一类广泛存在于高等植物中的碱性小分子量蛋白质， 生理功能包括参
与角质的形成、 脂代谢、 生物膜的形成、 体细胞发育、 花粉与雌蕊的相互作用等， 特别是在抗性信号转
导和植物防御功能中的作用， 成为近年来关注的焦点［10－11］。 脂氧合酶（LOX）是一类广泛存在于动植物中
的非血红素铁蛋白， 参与脂肪酸氧化途径中的 LOX 途径， 专一催化含有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不
饱和脂肪酸的加氧反应［12］。 为进一步明确 ‘无籽’ 瓯柑花粉败育与其脂质代谢的相关性， 本研究采用同
源序列法， 结合 cDNA 末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends， RACE）技术， 克隆获得 ‘无籽’
瓯柑脂转移酶基因（CsLTP）和脂氧合酶基因（CsLOX）的全长 cDNA 序列。 通过实时荧光定量 PCR（real-
time PCR）技术， 对 2 个目标基因 mRNA 表达量在花粉发育的不同时期进行实时定量分析， 期望能够进
一步解析 ‘无籽’ 瓯柑花粉败育的分子基础， 为揭示 ‘无籽’ 瓯柑无核机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料采自浙江省丽水市林业科学研究院百果园内的普通瓯柑和 ‘无籽’ 瓯柑。
1.2 ‘无籽’ 瓯柑 CsLTP和 CsLOX全长 cDNA的克隆
取‘无籽’瓯柑的花蕾， 采用 Trizol Kits（Invitrogen）进行总 RNA 抽提。 经 DNaseⅠ（1×16.67 nkat·L－1）
（Promega）处理纯化后， 按照 SMARTTM cDNA Library Construction Kit（TaKaRa）操作， 分别反转录获得 3′-
RACE 和 5′-RACE 的模板 cDNA。 根据数字基因表达谱（DGE）测序分析的 BLASTn 结果， 用 Primer Pre-
mier 5.0软件分别在 2个基因内部设计基因特异引物（GSP）， 并使用 3′-RACE 或 5′-RACE 的模板进行 3′
-RACE和 5′-RACE。 PCR扩增产物经分离、 回收后， 连接 pMD18-T测序载体， 转化大肠埃希菌 Escherishia
coli TG1， 调取阳性克隆， 由上海生工测序。
1.3 生物信息学分析
利用 DNAMAN 软件进行序列分析， 预测目标 cDNA 编码的蛋白质， 将氨基酸序列提交到美国国家
生物技术信息中心（NCBI）进行 BLAST 比对， 并用 DNAMAN 和 ORF Finder 进行 ORF 分析序列的开放
阅读框和保守域， 用 ClustalX 和 MEGA4［13］软件对蛋白序列进行多重比对和系统进化分析。 利用在线工
具分析氨基酸序列的二级结构， 物理性质及功能域， 并对亚细胞定位进行预测。
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1.4 实时荧光定量 PCR分析
2013 年 4 月 9 日瓯柑花蕾可见时开始采集样品， 采样 1 次·d－1， 根据花蕾大小差异将 ‘无籽’ 瓯柑
和普通瓯柑各分为 5个时期：Ⅰ（花粉母细胞形成期）、 Ⅱ（四分体时期）、 Ⅲ（花粉粒形成期）、 Ⅳ（花粉粒
成熟期）和Ⅴ（花朵开放期）等 5个时期的花蕾。 其中， ‘无籽’ 瓯柑（N）： NⅠ， NⅡ， NⅢ， NⅣ， NⅤ；
普通瓯柑（Y）： YⅠ， YⅡ， YⅢ， YⅣ， YⅤ。 液氮冷冻， 于－80 ℃保存备用。
分别提取 ‘无籽’ 瓯柑和普通瓯柑各自不同时期花蕾的总 RNA， 采用 PrimerScriptTM RT regent kit
with gDNA Eraser（Perfect Real Time， TaKaRa）试剂盒反转录成 cDNA， 采用 CFX96 Real-Time System 实
时荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad）， 反应程序为 95 ℃， 30 s； 95 ℃， 5 s； 57 ℃， 30 s， 39 个循环； 65~95
℃， 隔 5 s 上升 0.5 ℃做融解曲线。 重复 3 次·样品－1， 取平均值。 实时定量 PCR 引物分别为： CsLTP_F
（ 3′ -CACCATGCATCGGTTTCTT-5′ ）和 CsLTP_ R （3′ -AGTTTGGCGGTCAGGTGT-5′ ）； CsLOX_ F （3′ -CT-
GAAATTCGAACTGTGGGA -5′）和 CsLOX_R（3′-CAATGTTGCATCTTGCAGTG-5′）。
2 结果
2.1 ‘无籽’ 瓯柑 CsLTP和 CsLOX基因全长 cDNA的克隆及序列分析
利用 LTP+98（3′-ATGTGGGCAGGTGAGTGGCT-5′）和 LTP-118（3′- GAGCCACTCACCTGCCCACAT-5′）
作为特异引物， 3′-RACE 和 5′-RACE 完成后， PCR 扩增产物在质量浓度为 1%的琼脂糖胶上电泳检测，
结果 3′-RACE产物约为 500 bp（图 1a）， 5′-RACE 产物约为 150 bp （图 1b）； 测序结果表明： 它们分别为
527 bp 和 154 bp。 根据重叠序列将 3′-RACE 和 5′-RACE 的结果拼接， 经测序， CsLTP cDNA 全长 667
bp， 包含 1 个开放阅读框）， 编码 215 个氨基酸， 分子量为 1.26 kD， 等电点（pI）为 9.42， 带负电荷的氨
基酸残基总数（Asp+Glu）为 3， 总的正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数为 12， 推测基因所编码的蛋白位置
在细胞外。 BLASTn 结果显示： 与脐橙 Citrus sinensis（AF369931）和粗柠檬 C. jambhiri（AB437259）的脂
转移蛋白 LTP 相似性分别为 95%和 60%， 序列提交GenBank， 登录号为KF772872， 命名为 CsLTP。
利用 LOX-GSP3（3′ -ATAGCAACCAATCGGCAACTCAGCGTG-5′）和 LOX-GSP5 （3′ -GCTTGTCGAGCCAAAC
CATTGA-5′）为特异引物， 3′-RACE 和 5′-RACE 完成后， PCR 扩增产物在质量浓度为 1%的琼脂糖胶上
电泳检测。 结果显示： 3′-RACE 产物约为 1 000 bp（图 2a）， 5′-RACE 产物约为 2 000 bp（图 2b）。 测序
结果表明： 它们分别为 1 115 bp 和 1 901 bp。 根据重叠序列将 3′-RACE 和 5′-RACE 的结果拼接， 经测
序， CsLOX cDNA全长 2 915 bp， 包含 1 个开放阅读框， 编码 895 个氨基酸（图 3b）， 分子量为 10.176 6
kD， 等电点（pI）为 6.09， 带负电荷的氨基酸残基总数（Asp+Glu）为 120个， 总的正电荷氨基酸残基（Arg+
Lys）总数为 108 个， 推测该基因所编码的蛋白位置在细胞核内 （76.0%）， 线粒体基质（50.2%）， 过
氧化物酶体（35.8%）， 线粒体内膜上（22.2%）。 BLASTn 结果显示： 与粗柠檬（AB039745）， 美洲黑杨
Populus deltoids（DQ131179）的脂氧合酶相似性分别为 99%和 51% ， 序列提交GenBank， 登录号为
图 1 CsLTP 3′-RACE 和 5′-RACE
Figure 1 CsLTP 3′-RACE and 5′-RACE
图 2 CsLOX 3′-RACE和 5′-RACE
Figure 2 CsLOX 3′-RACE and 5′-RACE
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图 3 ‘无籽’ 瓯柑 CsLTP和 CsLOX的核酸序列及推导的氨基酸序列
Figure 3 Nucleotide and deduced amino acids sequence of seedless Ougan gene CsLTP and CsLOX
。子
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KF772871， 命名为 CsLOX。
2.2 CsLTP， CsLOX基因的推导氨基酸序列分析
根据 NCBI CDS（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析氨基酸序列 ， CsLTP 包含
nsLTP1 保守功能域， 属于非特异性脂转运蛋白 1 型（nsLTP1）亚科， 属于 AAI_LTSS 超基因家族（图 4a），
即 α-淀粉酶抑制子（AAI）-脂转移（LT）-种子储藏（SS）蛋白家族。 CsLOX 包含植物脂氧合酶相关蛋白结构
域， 属于 PLAT超基因家族（图 4b）， 即多囊蛋白 1-脂氧合酶-α-毒素蛋白家族。
图 4 CsLTP和 CsLOX氨基酸序列保守功能域分析
Figure 4 Conserved domain analysis of CsLTP and CsLOX amino acid sequences
a: CsLTP； b: CsLOX。
查询序列
查询序列
利用在线分析软件 http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl， 选择 Hphob./Kyte& Doolittle 模式 ， 对
‘无籽’ 瓯柑 CsLTP 和 CsLOX 基因的蛋白疏水性进行分析预测。 CsLTP 基因蛋白的疏水指数为－2.00~
2.82， 约在第 18~21位出现较强的疏水性， 在第 74~75位出现较强的亲水性； CsLOX 基因蛋白的疏水指
数从－2.57到 2.46， 约在第 150， 743， 817位出现较强的疏水性， 在第225， 250， 300， 398， 638， 726，
778位出现较强亲水性。
利用在线同源建模分析软件 http://swissmodel.expasy.org/对蛋白质三级结构预测， 得到了 CsLTP 和
CsLOX的三级结构［14-16］。 CsLTP蛋白经过几次折叠后主要以 α短螺旋为主； CsLOX蛋白主要以 α螺旋为
主， 包括长螺旋和短螺旋， 并伴有一些 β折叠， 其间由一些转角等相互连接。
2.3 ‘无籽’ 瓯柑 CsLTP和 CsLOX的系统进化树分析
利用 BLASTP 对 CsLTP 和 CsLOX 预测蛋白的氨基酸序列进行同源性检索， 并比对同源性较高的物
种氨基酸序列进行系统进化树分析（图 5）。 结果表明： CsLTP 与龙眼 Dimocarpus longan 的亲缘关系较近
（图 5a）； 而 CsLOX与蓖麻 Ricinus communis 的亲缘关系较近（图 5b）。
2.4 CsLTP和 CsLOX的荧光定量表达
根据花粉的发育过程， 分别采集Ⅰ（花粉母细胞形成期）， Ⅱ（四分体时期）， Ⅲ（花粉粒形成期）， Ⅳ
（花粉粒成熟期）， Ⅴ（花朵开放期）等 5 个时期的花蕾， 通过荧光定量 PCR 技术分别检测 ‘无籽’ 瓯柑
和普通瓯柑各自花粉发育的 5个时期中 CsLTP和 CsLOX的表达水平， 以 CsLTP 和 CsLOX 的实时表达量
与各自在普通瓯柑的第Ⅰ时期的表达量的比值计算， 以 ACTIN（GU911361）为内参。 以 SPSS 14.0.软件进
行 0.05 和 0.01 水平的统计分析。 结果显示： CsLTP（图 6a）和 CsLOX（图 6b）在 ‘无籽’ 瓯柑和普通瓯柑
中均有表达， 其中 CsLTP 的表达趋势在 2 个品种中相似， 即花粉母细胞形成期表达量最高， 而后随发
育时期的进行显著下降， 但 ‘无籽’ 瓯柑中 CsLTP 表达量的下降比普通瓯柑延后 1 个时期， 并且从Ⅲ
时期开始， ‘无籽’ 瓯柑中 CsLTP 的表达量显著低于普通瓯柑； CsLOX 在 ‘无籽’ 瓯柑中的表达趋势
与普通瓯柑相反， 即表达量从Ⅱ时期（四分体时期）开始显著下降， Ⅲ时期（花粉粒形成期）达到最低值，
并极显著低于普通瓯柑， 其余 4个时期均显著高于普通瓯柑（特别是花粉母细胞形成期）。
3 讨论
脂类物质对于动植物细胞结构和功能调节具有非常重要作用［17］。 本研究结合 ‘无籽’ 瓯柑与普通瓯
柑的差异表达基因筛选， 克隆了与脂类代谢相关的脂转移酶基因 CsLTP 和脂氧合酶基因 CsLOX。 甜橙
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Citrus sinensis 基因组测序 ［18］已经完成 ， 对现有数据库 （http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php）进行
Blastn检索， 发现 CsLTP在甜橙的 6号染色体可能存在同源序列， CsLOX 则在 3， 7， 9 号染色体可能存
在拷贝。 研究发现： 植物转脂蛋白（LTP）与动物非特异性脂转移蛋白（nonspecific lipid-transfer protein，
nsLTP）非常相似， 能与磷脂和脂肪酸结合， 进行膜间的脂类转运［19］。 LTP在植物的生长发育以及抗逆等生
命活动中具有广泛的生物学功能， 近年来 LTP在生殖发育中的重要作用也开始引起人们的广泛关注［20－21］，
特别是在小孢子的各发育时期中油脂等营养物质的传递与积累， 以及花粉壁等结构物质的形成等方面发
挥着重要的作用［22－28］。 本研究中， CsLTP 从花粉粒形成期开始表达量显著下降， 降低了生殖细胞对周围
营养物质的吸收效率， 无法为小孢子发育提供营养， 因而花粉粒不能正常发育。
图 5 ‘无籽’ 瓯柑 CsLTP和 CsLOX氨基酸序列的进化树
Figure 5 Phylogenetic analysis of CsLTP and CsLOX amino acid
籽
蓬
籽
。
图 6 ‘无籽’ 瓯柑花粉不同发育时期的 CsLTP和 CsLOX的相对表达量分析
Figure 6 Expression alteration of CsLTP and CsLOX during the flower bud development
籽 。
Citrus suavissima
；
a
脂氧合酶是动植物体内不饱和脂肪酸代谢的关键酶 ［29－30］之一， 参与茉莉酸（JA）的生物合成， 影响雄
828
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蕊花丝的伸长、 花药开裂以及花粉生活力， 甚至是雄蕊的形态发育［31］。 LOX 在小麦 Triticum aestivum 光
敏雄性不育系 BS366 中的表达较低 ［32］， 引起花药开裂异常。 何永明等［33］发现水稻 Oryza sativa OsLOX-
RCI1 的表达水平在颖花开放时明显上调， 开放后又下降。 本研究中， CsLOX 的表达在 ‘无籽’ 瓯柑花
粉粒形成期急剧下降， 则可能引起花粉粒成熟进程异常， 进而导致花粉粒不能正常的发育。
前期研究［3］表明： ‘无籽’ 瓯柑的花药自然散粉率极低， 在花粉粒成熟期， ‘无籽’ 瓯柑花粉粒内
大多中空， 其绒毡层附近有大量脂类物质残存。 本试验中， ‘无籽’ 瓯柑 CsLTP 和 CsLOX 的表达水平
都在花粉粒形成期开始锐减， 绒毡层细胞内的营养物质无法被花粉粒充分利用， 严重影响了花粉粒的成
熟进程， 最终导致花粉败育。
4 结论
从 ‘无籽’ 瓯柑中克隆到的脂转移酶基因 CsLTP 和脂氧合酶基因 CsLOX 序列分析表明： 它们具有
植物转脂蛋白（LTPs）和脂氧合酶（LOXs）的特征结构域。 两者在花粉发育不同时期转录本的丰度变化表
明： ‘无籽’ 瓯柑花粉粒发育初期脂类物质转运效率的下降， 以及花粉粒成熟进程的中止， 可能成为绒
毡层脂类营养物质滞留， 花粉发育关键时期营养不良， 并最终成为 ‘无籽’ 瓯柑花粉败育的原因之一。
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