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HPLC法同时测定紫地榆 3 种提取物中 4 种成分
谢 苗， 杨 淋， 杨晓珍， 周 平， 蓝 海*
(大理大学，云南 大理 671000)
收稿日期:2015-10-28
基金项目:国家自然科学基金 (81260512);云南省大理学院应用开发研究基金 (Kyyy201102)
作者简介:谢 苗 (1989—)，女，硕士生，从事天然药物防龋研究。Tel:18313001720，E-mail:704160547@ qq． com
* 通信作者:蓝 海，女，教授，硕士生导师，从事天然药物防龋研究。Tel:13769225179，E-mail:lanhai8696@ 126． com
摘要:目的 建立 HPLC法同时测定紫地榆 Geranium strictipes Ｒ． Kunth乙酸乙酯、正丁醇和水提取物中没食子酸、没
食子酸甲酯、儿茶素和鞣花酸的含有量。方法 提取物分析采用 Thermo Syncronis AQ C18色谱柱 (250 mm × 4. 6 mm，
5 μm);流动相乙腈 (A)-0. 5%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脱;体积流量 1. 0 mL /min;柱温 25 ℃;检测波长 214 nm
(没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素)、254 nm (鞣花酸)。结果 没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素和鞣花酸在
0. 106 ～ 2. 64 μg (r = 0. 999 8)、0. 106 ～ 1. 59 μg (r = 0. 999 7)、0. 024 ～ 0. 288 μg (r = 0. 999 6)、0. 252 ～ 6. 30 μg (r =
0. 999 9)范围内线性关系良好。没食子酸、鞣花酸含有量分别在水、乙酸乙酯提取物中最高，而正丁醇及水提取物
中均未检测到没食子酸甲酯和儿茶素。结论 该方法简单、准确、重复性好，可用于紫地榆的质量控制。
关键词:紫地榆;提取物;没食子酸;没食子酸甲酯;儿茶素;鞣花酸;HPLC
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2016)05-1066-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 05. 021
Simultaneous determination of four constituents in three extracts of Geranium
strictipes by HPLC
XIE Miao， YANG Lin， YANG Xiao-zhen， ZHOU Ping， LAN Hai*
(Dali University，Dali 671000，China)
ABSTＲACT:AIM To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the contents of gallic
acid，methyl gallate，catechin and ellagic acid in ethyl acetate，n-butanol and water extracts of Geranium strictipes
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Chinese Traditional Patent Medicine
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Vol． 38 No． 5
Ｒ． Kunth． METHODS The analyses of extracts were performed on a Thermo Syncronis AQ C18 column (250
mm ×4. 6 mm，5 μm)，mobile phase was acetonitrile (A)-0. 5% phosphoric acid solution (B)with gradient e-
lution，flow rate was 1. 0 mL /min，column temperature was maintained at 25 ℃，and detection wavelengths were
set at 214 nm for gallic acid，methyl gallate and catechin，and 254 nm for ellagic acid． ＲESULTS Gallic acid，
methyl gallate，catechin and ellagic acid showed good linear relationships within the ranges of 0. 106 － 2. 64 μg
(r = 0. 999 8) ，0. 106 － 1. 59 μg (r = 0. 999 7) ，0. 024 － 0. 288 μg (r = 0. 999 6)and 0. 252 － 6. 30 μg (r =
0. 999 9)． The contents of gallic acid and ellagic acid were the highest in water and ethyl acetate extracts，respec-
tively． Methyl gallate and catechin were not detected in n-butanol and water extracts． CONCLUSION This
method is simple and accurate with good reproducibility，which can be used for the quality control of G． strictipes．
KEY WOＲDS:Geranium strictipes Ｒ． Kunth;extracts;gallic acid;methyl gallate;catechin;ellagic acid;HPLC
紫地榆 Geranium strictipes Ｒ． Kunth是牻牛儿苗
科老鹳草属植物，为中国特有植物，主要生长于云
南、四川等地，是白族常用的民族药，根部是其主
要药用部位。其具有清热利湿，活血止血功效，可
用于治疗肠炎、痢疾、消化不良、慢性胃炎等疾
病。现有文献报道，紫地榆具有抑菌防龋［1］功效
和抗艾滋病病毒活性［2］。本课题组前期分别研究
了乙酸乙酯、正丁醇和水提取物的抑菌活性［3］以
及抵抗龋病的作用，但目前其成分含有量测定的报
道比较少见［4］，本实验对这 3 种提取物［5］中没食
子酸、没食子酸甲酯、儿茶素和鞣花酸的含有量进
行测定，旨在为紫地榆萃取物抗菌活性的研究和进
一步开发利用提供实验和理论依据。
1 材料与方法
1. 1 仪器与试药
1. 1. 1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪;
SB2200 超声波清洗器 (宁波新芝生物科技股份有
限公司);AE240 电子天平 (瑞士 Mettler-Toledo 公
司);KL-UP-UV-20 超纯水仪 (成都唐氏康宁科技
发展有限公司)。
1. 1. 2 药材和对照品 紫地榆购自大理市药材市
场，经大理学院生药学教研室杨月娥老师鉴定为紫
地榆 Geranium strictipes Ｒ． Kunth 的根。没食子酸
(批号 110831-201204)和儿茶素对照品 (批号
110877-201203)均购自中国食品药品检定研究院;
鞣花酸对照品 (批号 MUST-12110903)购自成都
曼思特生物科技有限公司;没食子酸甲酯对照品
(批号 MKBS9783V)购自美国 Sigma-Aldrich公司。
1. 1. 3 试剂 甲醇和乙腈为色谱纯;磷酸为分析
纯;水为超纯水。
1. 2 色谱条件 Thermo Syncronis AQ C18色谱柱
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm);流动相为乙腈 (A)-
0. 5%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脱 (0 ～ 10 min，
5%→12% A;10 ～ 25 min，12% A;25 ～ 50 min，
12% → 18%A;50 ～ 60 min，18% → 20%A);体
积流量 1. 0 mL /min;柱温 25 ℃;检测波长 214 nm
(没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素)、254 nm
(鞣花酸)［6-7］;进样量为 10 μL。
1. 3 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、没
食子酸甲酯、儿茶素和鞣花酸对照品 21. 1、10. 6、
3. 2、4. 0 mg，置于 2 mL量瓶中，甲醇 (鞣花酸用
水)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得相应的贮备
液。精密吸取贮备液适量，置于 2 mL 量瓶中，流
动相定容，摇匀，制成分别含 4 种成分 105. 5、
106、16、200 μg /mL的混合对照品溶液。
1. 4 供试品溶液的制备 精密称取紫地榆乙酸乙
酯、正丁醇和水提取物浸膏 0. 06、0. 01、0. 01 g，
置于 2 mL量瓶中，精密加入 60%甲醇至刻度，密
塞，称重，超声处理 10 min，冷却，60%甲醇补足
减失的重量，0. 22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2 结果和方法学考察
2. 1 系统适用性试验 在 “1. 2”项色谱条件下
依次进样供试品及对照品溶液，发现色谱图中没食
子酸、没食子酸甲酯、儿茶素和鞣花酸与其他组分
均达到基线分离，分离度大于 1. 5，而且其对应的
位置无干扰［8-9］。具体见图 1。
2. 2 线性关系考察 取 “1. 3”项下混合对照品
溶液适量，进样 1、2、5、10、15、20 μL 分析，
记录色谱峰面积。以对照品进样量 (μg)为横坐
标 (X)，相应的峰面积积分值为纵坐标 (Y)进行
回归，绘制标准曲线，结果见表 1，可知 4 种成分
均呈良好的线性关系。
2. 3 精密度试验 在 “1. 2”项色谱条件下，将
“1. 3”项下混合对照品溶液进样 6 次，每次
10 μL，测得没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素［10］
和鞣花酸的峰面积 ＲSD 分别为 0. 85%、0. 87%、
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1． 没食子酸 2． 没食子酸甲酯 3． 儿茶素 4． 鞣花酸
1． gallic acid 2． methyl gallate 3． catechin 4． ellagic acid
图 1 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms
表 1 4 种成分的回归方程
Tab. 1 Ｒegression equations of four constituents
成分 回归方程 线性范围 /μg 相关系数
没食子酸 Y = 703. 89X + 98. 069 0. 106 ～ 2. 64 0. 999 8
没食子酸甲酯 Y = 856. 28X + 31. 303 0. 106 ～ 1. 59 0. 999 7
儿茶素 Y = 127. 89X + 28. 029 0. 024 ～ 0. 288 0. 999 6
鞣花酸 Y = 2 082. 7X + 244. 75 0. 252 ～ 6. 30 0. 999 9
0. 87%和 0. 92%，表明仪器精密度良好。
2. 4 重复性试验 称取同一批紫地榆粉末适量，
先在相同条件下提取乙醇浸膏，再分别萃取乙酸
乙酯、正丁醇和水提取物，按 “1. 4”项下方法
将其各平行制备 6 份，最后在 “1. 2”项色谱条
件下进样测定，结果见表 2，表明该方法重复性
良好。
2. 5 稳定性试验 精密吸取紫地榆乙酸乙酯、正
丁醇和水提取物适量，按 “1. 4”项下方法配制供
试品溶液，于 0、3、6、9、12、24 h在 “1. 2”项
色谱条件下进样测定，结果见表 2，表明供试品溶
液在 24 h内稳定性良好。
表 2 重复性和稳定性试验结果 (n =6)
Tab. 2 Ｒesults of reproducibility and stability tests (n =6)
成分
重复性 ＲSD /% 稳定性 ＲSD /%
乙酸乙酯 正丁醇 水 乙酸乙酯 正丁醇 水
没食子酸 1. 56 1. 56 0. 67 0. 66 0. 98 1. 36
没食子酸甲酯 2. 45 — — 2. 50 — —
儿茶素 2. 48 — — 2. 05 — —
鞣花酸 2. 68 1. 15 2. 33 2. 20 2. 70 1. 41
注:—表示未检测出
2. 6 加样回收率试验 分别精密称定 3 个部位含
有量已知的同一批样品 6 份，其中乙酸乙酯提取物
约 30. 5 mg，正丁醇提取物约 60. 0 mg，水提取物
约 40. 0 mg，置于量瓶中，分别精密加入相应的对
照品溶液，60%甲醇定容至 10 mL，按照 “1. 4”
项下方法制备供试品溶液，在 “1. 2”项色谱条件
下测定，计算加样回收率。结果见表 3 ～ 5。
表 3 乙酸乙酯提取物加样回收率试验结果 (n =6)
Tab. 3 Ｒesults of recovery tests for ethyl acetate extract
(n =6)
成分
称样量 /
mg
原有量 /
μg
加入量 /
μg
测得量 /
μg
回收率 /
%
平均回收
率 /%
(ＲSD /%)
没食子酸 30. 52 155. 35 155. 25 308. 05 98. 36 98. 26
30. 51 155. 29 155. 25 311. 96 100. 91 (1. 4)
30. 50 155. 25 155. 25 307. 55 98. 09
30. 52 155. 35 155. 25 306. 64 97. 45
30. 49 155. 20 155. 25 307. 23 97. 74
30. 51 155. 29 155. 25 305. 87 97. 00
没食子酸 30. 52 144. 35 144. 30 283. 56 96. 47 98. 49
甲酯 30. 51 144. 31 144. 30 288. 85 100. 16 (2. 0)
30. 50 144. 27 144. 30 290. 79 101. 53
30. 52 144. 35 144. 30 285. 90 98. 09
30. 49 144. 22 144. 30 285. 35 97. 80
30. 51 144. 31 144. 30 284. 12 96. 89
儿茶素 30. 52 135. 81 135. 75 270. 50 99. 22
30. 51 135. 77 135. 75 267. 53 97. 06
30. 50 135. 73 135. 75 267. 39 96. 99 97. 46
30. 52 135. 81 135. 75 268. 25 97. 56 (0. 9)
30. 49 135. 68 135. 75 266. 90 96. 66
30. 51 135. 77 135. 75 267. 83 97. 28
鞣花酸 30. 52 382. 72 382. 60 761. 20 98. 92
30. 51 382. 60 382. 60 757. 46 97. 98
30. 50 382. 47 382. 60 755. 14 97. 40 98. 56
30. 52 382. 72 382. 60 758. 98 98. 34 (1. 2)
30. 49 382. 34 382. 60 756. 85 97. 89
30. 51 382. 60 382. 60 768. 37 100. 83
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表 4 正丁醇提取物加样回收率试验结果 (n =6)
Tab. 4 Ｒesults of recovery tests for n-butyl alcohol extract
(n =6)
成分
称样量 /
mg
原有量 /
μg
加入量 /
μg
测得量 /
μg
回收率 /
%
平均回收
率 /%
(ＲSD /%)
没食子酸 6. 02 15. 11 15. 07 30. 20 100. 13 98. 23
6. 00 15. 06 15. 07 30. 01 99. 20 (1. 3)
6. 05 15. 18 15. 07 30. 05 98. 67
6. 04 15. 16 15. 07 29. 83 97. 36
6. 00 15. 06 15. 07 29. 66 96. 88
6. 01 15. 08 15. 07 29. 72 97. 15
鞣花酸 6. 02 69. 83 69. 60 138. 23 98. 28 98. 30
6. 00 69. 60 69. 60 137. 89 98. 12 (0. 9)
6. 05 70. 18 69. 60 139. 20 99. 17
6. 04 70. 06 69. 60 139. 04 99. 11
6. 00 69. 60 69. 60 136. 97 96. 80
6. 01 69. 72 69. 60 138. 14 98. 30
表 5 水提物加样回收率试验结果 (n =6)
Tab. 5 Ｒesults of recovery tests for water extract (n =6)
成分
称样量 /
mg
原有量 /
μg
加入量 /
μg
测得量 /
μg
回收率 /
%
平均回收
率 /%
(ＲSD /%)
没食子酸 4. 01 45. 20 45. 00 89. 80 99. 11 98. 16
4. 00 45. 20 45. 00 88. 23 95. 62 (1. 9)
4. 00 45. 08 45. 00 90. 12 100. 09
4. 03 45. 42 45. 00 90. 06 99. 20
4. 02 45. 30 45. 00 89. 78 98. 84
4. 02 45. 30 45. 00 88. 53 96. 07
鞣花酸 4. 00 23. 22 23. 20 45. 70 96. 90 98. 41
4. 00 23. 22 23. 20 46. 83 101. 76 (2. 0)
4. 00 23. 16 23. 20 46. 21 99. 35
4. 03 23. 33 23. 20 46. 18 98. 50
4. 02 23. 28 23. 20 45. 89 97. 46
4. 02 23. 28 23. 20 45. 66 96. 47
2. 7 含有量测定 精密称取 3 批紫地榆乙酸乙
酯、正丁醇和水提取物，每批 3 份，置于量瓶中，
按“2. 4”项下方法制备供试品溶液，在 “2. 1”
项色谱条件下计算含有量，结果见表 6。
表 6 含有量测定结果 (mg/g，n =3)
Tab. 6 Determination results of contents (mg/g，n =3)
部位 没食子酸 没食子酸甲酯 儿茶素 鞣花酸
乙酸乙酯 5. 09 4. 73 4. 45 12. 54
正丁醇 2. 51 0 0 11. 60
水部位 11. 27 0 0 5. 80
3 讨论
3. 1 检测波长的选择 4 种成分的对照品溶液分
别进样经二极管阵列检测器［11］ (DAD)检测，所
得图谱 (190 ～ 400 nm)以及 3D 图谱显示，没食
子酸甲酯、儿茶素在 207 nm 处有最大吸收，而鞣
花酸在 260 nm处左右。为准确反映各成分含有量，
本实验利用 Aglient 1200 色谱仪的波长切换功能来
选择各成分最大吸收波长，发现杂质干扰更少。
3. 2 流动相的选择 HPLC 法采用的流动相［12-13］
大多为甲醇-水、甲醇-酸水、乙腈-水、乙腈-酸水
溶液等。参考相关文献，在预实验中曾采用甲醇-
水、甲醇-0. 2% 乙酸、甲醇-0. 1% 磷酸、乙腈-
0. 1%磷酸和乙腈-0. 05%磷酸水溶液等，最终选择
乙腈-0. 5%磷酸水溶液作为流动相，所得色谱图峰
形较好，基线平稳，分离度高。
3. 3 柱温和流速的选择 没食子酸甲酯和儿茶素
对照品的极性相近，为了达到满意的分离效果，本
实验分别考察了在柱温为 20、25、30 和 40 ℃，以
及体积流量为 0. 6、0. 8、1. 0、1. 2 和 1. 5 mL /min
时对分离度的影响。结果表明，随着温度升高，分
离度增加;随着体积流量增大，分离度降低。综合
考虑，在体积流量为 1. 0 mL /min、温度为 25 ℃的
条件下，可使没食子酸甲酯和儿茶素完全分离。
3. 4 小结 目前，有关紫地榆的质量研究仅涉及
到没食子酸含有量［14］，难以全面反映其质量情况。
作为紫地榆药理活性研究课题［15］的重要部分，本
实验通过测定其中没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶
素和鞣花酸在乙酸乙酯、正丁醇和水提取物中的含
有量，发现乙酸乙酯提取物中 4 种成分的含有量均
较高，并以鞣花酸为最高;水提取物中，没食子酸
含有量最高，但正丁醇及水提取物中均未检测到没
食子酸甲酯和儿茶素。本实验所建立的分析方法简
单、准确，重复性好，对紫地榆的质量控制和临床
安全用药具有积极意义。
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定［J］． 大理学院学报，2014，13(2):12-14．
［5］ 禹奇男，熊永爱，杨荣平，等． UPLC 法测定地榆乙酸乙
酯部位中 4 个鞣质类成分［J］． 中成药，2015，37(3):
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9601
2016 年 5 月
第 38 卷 第 5 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
May 2016
Vol． 38 No． 5
［7］ 王瑞娜，孙耀志，高 松，等． HPLC 波长切换法同时测
定安神解虑颗粒中 4 种成分［J］． 中成药，2015，37(5):
991-995．
［8］ 秦冬梅，胡利萍，张跃新． HPLC 同时测定没食子中没食
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［10］ 许 文，傅志勤，林 婧，等． UPLC-MS /MS 法同时测定
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［12］ 王瑞娜，孙耀志，高 松，等． HPLC 波长切换法同时测
定安神解虑颗粒中 4 种成分［J］． 中成药，2015，37(5):
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［13］ 陈晓静，何 杰，杨建云，等． ＲP-HPLC 法同时测定葡萄
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分抗粘性放线菌的体外研究［J］． 大理学院学报，2015，
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SPE-HPLC法测定三尖杉中的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱
吴方评， 金 苹， 姚祖福， 杨 勇， 刘良红
(湖南医药学院，侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000)
收稿日期:2015-07-28
基金项目:湖南省怀化市科技局科研项目 (2014-19)
作者简介:吴方评 (1972—)，男 (侗族)，硕士，副教授，从事药物制剂质量控制研究。Tel:15576513046，E-mail:wfp1013 @
163． com
摘要:目的 采用固相萃取-高效液相色谱 (SPE-HPLC)法测定三尖杉 Cephalotaxus fortunei Hook． f． 中的三尖杉酯碱
和高三尖杉酯碱。方法 三尖杉 90%乙醇提取液的分析采用迪马 Diamonil C18色谱柱 (250 mm × 4. 6 mm，5 μm);流
动相为乙腈 ∶ 水 (含 0. 1 g十二烷基磺酸钠和 0. 1%磷酸，42 ∶ 58)，等度洗脱;体积流量为 0. 5 mL /min;检测波长为
291 nm。结果 三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱在 2. 48 ～ 49. 60、2. 51 ～ 50. 20 μg /mL 范围内线性关系良好，平均回收率
(n = 5)分别为 95. 4%、95. 1%，ＲSD分别为 1. 83%、1. 91%。两种成分的含有量在茎中最高，而在叶中最低。结论
该方法可用于测定该植物中的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱，效果理想。
关键词:三尖杉;三尖杉酯碱;高三尖杉酯碱;SPE-HPLC
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2016)05-1070-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 05. 022
Determination of harringtonine and homoharringtonine in Cephalotaxus fortunei
by SPE-HPLC
WU Fang-ping， JIN Ping， YAO Zu-fu， YANG Yong， LIU Liang-hong
(Hunan University of Medicine，Hunan Provincial Key Laboratory of Dong Pharmaceutical Ｒesearch，Huaihua 418000，China)
ABSTＲACT:AIM To determine harringtonine and homoharringtonine in Cephalotaxus fortunei Hook． F． by sol-
id phase extraction-high performance liquid chromatography (SPE-HPLC)． METHODS The analysis of 90%
ethanol extract of C． fortunei was performed on Diamonil C18 column (250 mm × 4. 6 mm，5 μm)，mobile phase
was acetonitrile-water (containing 0. 1 g sodium dodecylsulphate and 0. 1% phosphate，42 ∶ 58)with isocratic
elution，flow rate was 0. 5 mL /min and detection wavelength was set at 291 nm. ＲESULTS Harringtonine and ho-
moharringtonine showed good linear relationships within the ranges of 2. 48 － 49. 60 μg /mL and 2. 51 －
50. 20 μg /mL，whose average recoveries (n = 5)were 95. 4% and 95. 1% with the ＲSDs of 1. 83% and 1. 91%，
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2016 年 5 月
第 38 卷 第 5 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
May 2016
Vol． 38 No． 5