全 文 ：第３３卷第８期　　　　　　　　　 西 南 大 学 学 报 （自然科学版）　　　　　　　　　　　２０１１年８月
Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．８ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ａｕｇ．　２０１１
文章编号：１６７３－９８６８（２０１１）０８－００６３－０５
梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达
＊
马　鑫，　王　斌，　胡雨晴，　李名扬，　眭顺照
西南大学 园艺园林学院，重庆市花卉工程技术研究中心，教育部 南方山地园艺学重点实验室，重庆４００７１６
摘要：基于ＧｅｎＢａｎｋ公布的葡萄糖基转移酶（ＬＧＴ）基因的核苷酸序列，设计并合成特异性引物，以梁平柚成年树
幼叶总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增葡萄糖基转移酶基因，将该基因片段克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ
（＋）上，构建了该基因的融合表达载体ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ，转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中．经１．０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱
导表达获得大小约为６２Ｋｄ的目的融合蛋白．
关　键　词：葡萄糖基转移酶；ＣｍＬＧＴ基因；克隆；原核表达
中图分类号：Ｑ７８５ 文献标志码：Ａ
柠檬苦素类似物是三萜类的植物次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科植物中，特别在柑橘属中含
量最为丰富，是引起柑橘汁苦味的主要原因之一［１－２］．迄今已从柑橘属植物中分离出３６种柠檬苦素类似物
和１９种配糖体［３］．大量的动物试验表明，柠檬苦素类似物具有抗肿瘤［４］、昆虫拒食［５］、抗炎、镇痛［６］等很
多药理活性功能，所以人们对柠檬苦素类似物的需求日益增加，但是苦味的存在限制了人们对它的摄取．
柠檬苦素类似物配糖体具有水溶性且无苦味等特性，其生物学活性和柠檬苦素类似物是相似的．因而将其
作为功能性的食品添加剂，有很好的市场前景．
柠檬苦素类似物配糖体是在柠檬苦素类似物－ＵＤＰ－葡萄糖基转移酶的催化下，在柠檬苦素类似物上连
接一个葡萄糖分子转变而来的［７－８］．本试验从梁平柚中扩增出了葡萄糖基转移酶基因ＣｍＬＧＴ，构建了
ＣｍＬＧＴ基因的原核表达载体并进行了诱导表达，以期为研究梁平柚ＬＧＴ基因在植物基因工程上的应用
提供理论依据，也为进一步研究ＬＧＴ蛋白在调控柚类柠檬苦素类似物合成中扮演的角色和柑橘品种改良
打下基础．
１　材料与方法
１．１　植物材料
供试材料为梁平柚成年树幼叶，取新鲜叶片于－７０℃冰箱保存备用．
１．２　菌株、载体及主要试剂
大肠杆菌感受态菌株ＤＨ５α购自天根生物技术（北京）有限公司，原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）及宿主菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）为本实验室保存．克隆载体ｐＭＤ１９－Ｔ、限制性内切酶ＢａｍＨ　Ｉ和ＳａｃＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、反转
＊
收稿日期：２０１１－０３－２４
基金项目：教育部博士点基金资助项目（２００８０６３５１０１５）．
作者简介：马　鑫（１９８５－），女，河南周口人，硕士研究生，主要从事植物细胞工程研究．
通信作者：眭顺照，副研究员．
DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2011.08.014
录试剂盒ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ均购于大连ＴａＫａＲａ公司．ＲＮＡ提取试剂盒为ＴＩＡＮＧＥＮ公司
生产的ＲＮＡｐｒｅｐ　ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ试剂盒．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ低分子量标准蛋白质及其他分析纯均购于上海生物工
程有限公司．引物由上海生物工程有限公司合成．
１．３　叶片ＤＮＡ、总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ第一链的合成
以梁平柚成年树幼叶为试材，按照ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ［９］．用ＴＩＡＮＧＥＮ公司的ＲＮＡｐｒｅｐ　ｐｕｒｅ
Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ试剂盒提取总ＲＮＡ，按ＴａＫａＲａ公司的ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ试剂盒说明书合成ｃＤ－
ＮＡ第一链，－２０℃保存备用．
１．４　葡萄糖基转移酶基因的克隆
根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的柠檬苦素类似物———葡萄糖基转移酶基因ＣｍＬＧＴ全长ｃＤＮＡ序列（登录号：
ＥＵ３０４８２８），分析该基因的限制性酶切位点并结合原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）的特点，在ＣｍＬＧＴ基因全
长ｃＤＮＡ开放阅读框（ＯＲＦ）的５′和３′末端设计１对特异性引物．上游引物Ｐ１：５′－ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧ－
ＧＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ－３′；下游引物Ｐ２：５′－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＴＡＣＴＧＴＡＣＡＣＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧ－
３′．在上下游引物的５′端分别加入ＢａｍＨ　Ｉ和ＳａｃＩ酶切位点（下划线部分）和保护碱基（斜体部分）．分别取
梁平柚ＤＮＡ、ｃＤＮＡ　１μＬ为模板，进行ＰＣＲ扩增，反应条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃１ｍｉｎ，５８℃
４５ｓ，７２℃１ｍｉｎ　３０ｓ，２８个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ．
ＰＣＲ产物的回收按ＢｉｏＦｌｕｘ公司的Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ说明书进行，连接按ＴａＫａＲａ公司的ｐＭＤ１９－Ｔ
载体说明书进行，对重组质粒进行抗生素、α－互补筛选以及ＰＣＲ扩增进行检测，将阳性克隆送华大基因测
序．连接有ＣｍＬＧＴ基因ｃＤＮＡ序列的重组质粒记作ｐＭＤ１９Ｔ－ＣｍＬＧＴ．
１．５　表达载体ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ的构建及鉴定
将重组质粒ｐＭＤ１９Ｔ－ＣｍＬＧＴ与原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）分别用ＢａｍＨ　Ｉ和Ｓａｃ　Ｉ双酶切后回收并
纯化，用Ｔ４连接酶过夜连接后转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取其质粒，进行ＰＣＲ扩
增及ＢａｍＨ　Ｉ和Ｓａｃ　Ｉ双酶切鉴定，将阳性克隆送华大基因测序．融合表达载体命名为ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ．
１．６　ＬＧＴ蛋白在ＢＬ２１（ＤＥ３）中的表达
将重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ转化表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取单个菌落，接种于３ｍＬ含５０μｇ／ｍＬ
卡那霉素的液体ＬＢ培养基中，３７℃过夜培养，次日按１∶１００的比例转接至新鲜的ＬＢ液体培养基中
（含５０μｇ／ｍＬ卡那霉素），３７℃振荡培养使其ＯＤ６００≈０．６时，吸取１．０ｍＬ菌液作为未诱导对照．以空载
体转化菌加ＩＰＴＧ（终浓度１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）诱导为阳性对照，以未加ＩＰＴＧ诱导的空载体转化菌为阴性对照．
在剩余菌液中加入ＩＰＴＧ至终浓度１．０ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃振摇培养６ｈ进行诱导表达，吸取１．０ｍＬ诱导培养
物样品．将所有收集的菌液１２　０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，弃上清液，用５０μＬ　ｐＨ＝７．４的ＰＢＳ液悬浮沉淀菌，
加入等体积的２×ＳＤＳ上样缓冲液，水浴煮沸１０ｍｉｎ，然后１０　０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，取上清液作为蛋白样
品上样．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳分析有无目的融合蛋白的表达．
１．７　原核表达体系的优化
在保持菌种不改变的前提下，按照依次改变诱导时间２ｈ，４ｈ，６ｈ，８ｈ，诱导温度３７℃，２８℃，２２℃及
ＩＰＴＧ终浓度０．１，０．４，０．８，１．０ｍｍｏｌ／Ｌ来优化表达并分别收集培养产物．分离培养基和菌体，菌体超声
破碎后，分离上清液和沉淀，分别经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析蛋白的分布情况及确定最适表达条件．
２　结果与分析
２．１　梁平柚ＣｍＬＧＴ基因编码框全长ｃＤＮＡ的克隆
以特异引物进行ＰＣＲ，从梁平柚叶片基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ中扩增得到大小一致的特异产物（图１），
并将其克隆到ｐＭＤ１９－Ｔ载体中，进行测序分析．结果表明，该ＤＮＡ克隆与ｃＤＮＡ序列对应部分完全相
同，获得的片段是梁平柚ＣｍＬＧＴ基因编码框ｃＤＮＡ序列，长１　５３６ｂｐ且无内含子．
４６ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３３卷
图１　梁平柚葡萄糖基转移酶基因的ＰＣＲ扩增
２．２　原核表达载体的构建及重组子鉴定
采用ＢａｍＨ　Ｉ和Ｓａｃ　Ｉ双酶切重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ，
结果表明，扩增的ＣｍＬＧＴ 片段已插入原核表达载体质粒中．
进一步用特异引物进行ＰＣＲ扩增鉴定，得到了与已知ＣｍＬＧＴ
基因ＯＲＦ框大小一致的特异片段（图２）．对重组表达质粒
ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ进行测序，结果也证实ＣｍＬＧＴ 基因已正确
插入到原核表达载体ｐＥＴ２８ａ中，未出现碱基突变及移码现
象，成功构建ＣｍＬＧＴ基因的原核表达载体．
２．３　ＬＧＴ的诱导表达和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析
将构建好的重组表达质粒转化表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）并经
ＩＰＴＧ诱导表达后，对大肠杆菌总蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析．
结果显示，插入有目的基因片段的重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ经诱导表达后，出现了一条分子量约６２Ｋｄ
的蛋白条带，与预期结果一致．而未经诱导的转化重组子、诱导的转化空载体以及未诱导的空载体转化子
均未出现该蛋白条带（图３）．表明重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ 在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中诱导表达了ＬＧＴ
蛋白．试验中通过调整诱导时间、温度、ＩＰＴＧ终浓度，以获得该融合蛋白的最佳诱导条件．在相同的
ＩＰＴＧ终浓度和温度条件下，进行时间单因素分析，发现随着诱导时间的增加，目的蛋白的表达量逐渐增
加（结果未显示）．４ｈ时达到最大值，４ｈ后表达量没有继续增加．因此，选择４ｈ作为最优诱导时间．对诱
导条件进行温度单因素分析发现，２２℃，２８℃和３７℃都出现了６２Ｋｄ左右的表达特异带，且３７℃要比２８
℃，２２℃表达量明显增高．破碎沉淀中有目的条带，而上清液中没有出现目的条带，表明融合蛋白多以包
涵体形式存在（结果未显示）．综合表明诱导温度在试验范围内对可溶性融合蛋白的产生影响不大，且温度
下降会降低融合蛋白的表达量．于是选择３７℃作为最佳诱导温度．进行ＩＰＴＧ浓度单因素分析时发现，加
入ＩＰＴＧ的浓度变化对表达量影响不明显（结果未显示）．
图２　原核表达载体ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ的双酶切和ＰＣＲ鉴定 图３　ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
３　讨　论
根据已有的研究，柑橘的苦味主要有两方面的原因，一方面是由于柚皮苷引起的，另一方面是由柠檬
苦素类似物引起的［１０］．从柑橘中分离得到的编码１，２鼠李糖基转移酶基因（Ｃｍ１，２Ｒｈａｔ）进行的功能研究
表明，此酶对柚皮苷引起的苦味有直接作用［１１］．眭顺照等从柚中得到编码葡萄糖基转移酶的基因并初步推
测ＣｍＬＧＴ基因编码的糖基转移酶对柚中由柠檬苦素类似物引起的苦味具有一定的调控作用［１２］．融合蛋
白表达是在原核生物中表达外源蛋白的一种有效方法［１３］．本研究在获得柚ＣｍＬＧＴ编码框ｃＤＮＡ序列的
基础上将其克隆至原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）中，并成功地在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中实现表达，以期从蛋
５６第８期　　　　　　 　马　鑫，等：梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达
白质水平上研究ＬＧＴ蛋白在梁平柚中的生物化学与分子生物学功能．
大肠杆菌表达菌株、原核质粒表达载体、诱导表达时间和温度以及诱导剂的浓度等是影响外源基因在
大肠杆菌中是否表达的重要因素［１４］．本研究前期试验曾利用ｐＥＴ－３２ａ（＋）载体，构建重组表达质粒
ｐＥＴ３２ａ－ＣｍＬＧＴ，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行了表达．结果显示，重组表达质粒ｐＥＴ３２ａ－ＣｍＬＧＴ，在
大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达量很低，几乎不能正常表达．将ＣｍＬＧＴ 基因克隆到ｐＥＴ－２８ａ（＋）表达载体
中，经ＩＰＴＧ诱导和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现，在ｐＥＴ－２８ａ（＋）中有目的融合蛋白的高水平表达，这可能与目
的融合蛋白分子量太大有关．试验中菌体经超声波破碎后分离上清液和沉淀，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果显示，
融合蛋白多以包涵体形式存在．一般认为，表达水平过高是包涵体形成的原因之一［１５］．在本研究中，通过
降低诱导温度可降低目的融合蛋白的表达量，但同时并不会促使产生可溶性目的融合蛋白．由此推测造成
包涵体形成的主要原因可能是因为缺乏一些蛋白质折叠过程中必须的酶或辅助因子［１６］．包涵体形式的融
合蛋白虽然能够有效抵御大肠杆菌中蛋白酶对其的降解，但不具有生物活性．所以本试验接下来的工作是
对包涵体蛋白进行分离纯化、复性及其在植物体内表达分析的研究．
４　结　论
本研究在获得梁平柚ＣｍＬＧＴ基因全长ｃＤＮＡ的基础上成功构建了原核表达载体ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴ，
摸索其在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中诱导表达的最佳条件，结果表明诱导培养时间４ｈ，温度３７℃和诱导剂
ＩＰＴＧ浓度１．０ｍｍｏｌ／Ｌ为最佳表达条件．这为ＬＧＴ蛋白的分离纯化、活性检测、三维结构的探讨奠定了
基础，也为柑橘品种改良提供了新的思路．
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６６ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３３卷
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Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｃｏｓｅ
Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＣｉｔｒｕｓ　ｍａｘｉｍａ　ｃｖ．‘Ｌｉａｎｇｐｉｎｇ’
ＭＡ　Ｘｉｎ，　ＷＡＮＧ　Ｂｉｎ，　ＨＵ　Ｙｕ－ｑｉｎｇ，
ＬＩ　Ｍｉｎｇ－ｙａｎｇ，　ＳＵＩ　Ｓｈｕｎ－ｚｈａｏ
Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｆｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，
Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７１６，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ（ＬＧＴ）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎ　ＧｅｎＢａｎｋ，ｓｐｅ－
ｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　ａｎ　ａｄｕｌｔ　ｔｒｅｅ　ｏｆ
Ｃｉｔｒｕｓ　ｍａｘｉｍａｃｖ．Ｌｉａｎｇｐｉｎｇ　ａｓ　ｔｈｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，ｔｈｅ　ＬＧＴｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ
ｔｈｅ　ＬＧＴｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ－２８ａ（＋）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ２８ａ－ＣｍＬＧＴｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）．Ｔｈｅ　ｔａｒ－
ｇｅｔ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ａｂｏｕｔ　６２Ｋｄ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　１．０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ａｒｅ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣｍＬＧＴｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
责任编辑　欧　宾　　　　
７６第８期　　　　　　 　马　鑫，等：梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达