全 文 ：园艺学报，2015，42 (10)：1919–1930.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0114；http：//www. ahs. ac. cn 1919
桑树类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定
及主效基因功能分析
梁燕梅 1，朱攀攀 1，李 军 2，赵爱春 1，刘长英 1，UMUHOZA Diane1，
李镇刚 3，鲁 成 1，余茂德 1,*
（1 西南大学生物技术学院，重庆 400715；2贵阳中医学院，贵州 550002；3 云南省农业科学院蚕桑蜂蜜研究所，云
南蒙自 661101）
摘 要：根据同源比对，从川桑（Morus notabilis）基因组数据库（morus.swu.edu.cn/morusdb/）中鉴
定类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因（MaUFGT）家族成员。采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析
MaUFGT 在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟，MaUFGT1、MaUFGT2 和 MaUFGT3
的表达模式相似，均呈上升趋势；在从顶芽依次向下不同叶位中，3 个 UFGT 基因表达呈现先降低后升高，
再降低又升高的趋势；在幼茎皮层和托叶中大量表达，幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低，有的甚
至不表达。MaUFGT2 的表达量在 3 个基因中都是最高的，推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种
‘嘉陵 40’成熟果实中克隆了 UFGT2 基因，命名为 MaUFGT2，登录号 KP455729.1。其 cDNA 全长为
1 386 bp，编码 461 个氨基酸，推测蛋白质分子量约为 51 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种
间保守性不高。将 MaUFGT2 克隆到 pET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行诱导表达，
表达产物经 SDS-PAGE 分析显示，融合蛋白大小约为 55 kD，主要以包涵体形式表达，在上清液中也有少
量表达。MaUFGT2 蛋白经纯化和复性后，最后通过高效液相色谱（HPLC）分析该蛋白的酶活性，结果
表明，体外酶活性鉴定 MaUFGT2 能够催化 UDP 葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素 3–β–D–葡萄糖苷，
验证了其具有糖基转移酶的功能。
关键词：桑树；果实；类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶；UFGT 基因；表达；酶活性分析
中图分类号：S 663.9 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）10-1919-12

Identification of MaUFGTs from Mulberry and Function Analysis of the
Major Gene
LIANG Yan-mei1，ZHU Pan-pan1，LI Jun2，ZHAO Ai-chun1，LIU Chang-ying1，UMUHOZA Diane1，
LI Zhen-gang3，LU Cheng1，and YU Mao-de1,*
（1 College of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400715，China；2 Guiyang College，Traditional Chinese
Medicine，Guizhou 550002，China；3Institute of Sericulture and Apiculture，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，
Mengzi，Yunnan 661101，China）
Abstract：The members of the MaUFGT（flavonoid 3-O-glucosyltransferase gene）family were

收稿日期：2015–05–20；修回日期：2015–09–17
基金项目：农业部公益性行业科研专项（201403064）；国家自然科学基金项目（31360190）；国家现代农业产业技术体系建设专项资
金项目（CARS-22）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yumd@163.com；Tel：023-68250191）
Liang Yan-mei，Zhu Pan-pan，Li Jun，Zhao Ai-chun，Liu Chang-ying，Umuhoza Diane，Li Zhen-gang，Lu Cheng，Yu Mao-de.
Identification of MaUFGTs from mulberry and function analysis of the major gene.
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identified from Morus notabilis genome database（http：//morus.swu.edu.cn/morusdb/）by means of
homology alignment，and their expression in different tissues and at different growth stages of mulberry
was analyzed with qRT-PCR（quantitative real-time fluorescent PCR）. With the development and
maturation of the fruit，the expression of MaUFGT1，MaUFGT2 and MaUFGT3 showed an upward trend.
Their expression generally dropped first and then increased，and was followed by another drop and another
rise at different leaf positions. They were expressed abundantly in the cortex and stipule，but scantily in the
epidermis，xylem and petiole. Of the three members of the MaUFGT family，MaUFGT2 always had the
highest expression，therefore，is speculated to be the major gene. A full-length 1 386 bp cDNA of the
MaUFGT2 gene，which encodes 461 amino acids，was cloned from the ripe fruit of mulberry‘Jialing 40’.
Its calculated molecular mass was about 51 kD. Sequence alignment showed that the encoded proteins
were not highly conservative between different species. MaUFGT2 thus cloned was inserted into the
vector pET-28a(+) and expressed in E. coli BL21(DE3). SDS-PAGE results showed that the obtained
MaUFGT2 protein was approximately 55 kD in size and was abundantly expressed in inclusion bodies and
scarcely as a soluble protein. High performance liquid chromatography（HPLC）of the enzymatic activity
of the purified and renaturated MaUFGT protein showed that the recombinant protein could catalyze UDP
glucose to quercetin to form the quercetin 3-β-D-glucoside，thus confirming that MaUFGT2 possessed a
glycosyltransferase function.
Key words：mulberry；fruit；flavonoid 3-O-glucosyltransferase；UFGT gene；expression；enzymatic
activity analysis

桑椹中含有丰富的天然水类黄酮化合物。其中槲皮素（quercetin）是最典型的的类黄酮。类黄
酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因（UFGT）是催化糖基从尿苷–5′–二磷酸二钠盐（UDP）–葡萄糖
转移至槲皮素形成槲皮素 3–β–D–葡萄糖苷的一类转移酶基因，研究其编码基因的表达及功能，
对了解植物合成和积累类黄酮机制具有重要意义（Hu et al.，2011）。植物中含有大量糖基转移酶基
因家族。在拟南芥中发现超过 120 个 UFGT，苜蓿中含有 165 个 UFGT（Modolo et al.，2007）。到
目前为止，已经从许多植物中克隆了 UFGT 基因，如葡萄、苜蓿、红枫（Ford et al.，1998；冯立娟
等，2008；Pang et al.，2008）等。许多研究表明，UFGT 是花青素合成途径的最后一个关键酶基因，
该基因的表达强度与花青素的合成密切相关，控制 UFGT 酶活性比控制其他酶更能影响花色素苷的
合成（王惠聪 等，2004）。本研究小组前期从桑树中克隆并鉴定了花青素生物合成的关键酶基因，
发现其中二氢黄酮还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）和花青素合成酶（anthocyanidin
reductase，ANS）基因与花青素在果实中的积累呈正相关，但没有分析 MaUFGT 的功能。
本研究中从解析桑树 UFGT 基因结构及表达模式的解析入手，研究该基因在花青素生物合成中
的功能。从川桑（Morus notabilis）基因组中鉴定 UFGT 基因，以果桑品种‘嘉陵 40 号’的不同叶
位、不同发育时期的果实以及不同组织为材料，通过定量分析 UFGT 基因家族成员的表达情况；同
时以成熟果实为材料，采用 RT-PCR 获得主效基因全长 cDNA 序列，并构建原核表达重组载体，通
过纯化、复性以及 HPLC 等方法，鉴定 UFGT 基因的功能。以期解析在桑树果实着色过程中的作用
机理，为以后利用基因工程手段调控桑椹花青素的生物合成奠定基础。
梁燕梅，朱攀攀，李 军，赵爱春，刘长英，UMUHOZA Diane，李镇刚，鲁 成，余茂德.
桑树类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析.
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1 材料与方法
1.1 试验材料、缓冲液及主要试剂配制
于 2014 年 3 月 26 日至 5 月 1 日，取西南大学生物技术学院桑树品种资源圃中的‘嘉陵 40 号’
幼茎的表皮、皮层、木质部、托叶、叶柄；于盛花期（雌花柱头发白）后 0、8、14、21、26、31、
34、37 d 取果实；叶片从顶芽燕口幼叶开始向下逐一取 8 个叶位的叶片。样品采后立即用液氮速冻，
于–80 ℃冰箱保存备用。
LB 液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，混匀，灭菌后，4 ℃保存。
PBS 缓冲液：137 mmol · L-1 氯化钠，2.7 mmol · L-1 氯化钾，10 mmol · L-1 磷酸氢二钠，2 mmol · L-1
磷酸二氢钾，混匀，灭菌后，室温保存。
平衡缓冲液：100 mmol · L-1 磷酸二氢钠，10 mmol · L-1 Tris-Cl，8 mol · L-1 尿素，调 pH 8.0。
洗脱液：50 mmol · L-1 Tris-Cl，500 mmol · L-1 氯化钠，调 pH 8.0（不同浓度的洗脱液咪唑浓度
不同）。
蛋白透析试剂：透析液Ⅰ（100 mmol · L-1 Tris-Cl，10 mmol · L-1 EDTA，0.5% SDS，5% 甘油，
2 mmol · L-1 β–巯基乙醇，6 mol · L-1 尿素）、透析液Ⅱ（100 mmol · L-1 Tris-Cl，10 mmol · L-1 EDTA，
0.5% SDS，5% 甘油，2 mmol · L-1 β–巯基乙醇，4 mol · L-1 尿素）、透析液Ⅲ（100 mmol · L-1 Tris-Cl，
10 mmol · L-1 EDTA，0.5% SDS，5%甘油，2 mmol · L-1 β–巯基乙醇，2 mol · L-1 尿素）、透析液Ⅳ（100
mmol · L-1 Tris-Cl，10 mmol · L-1 EDTA，0.1% SDS，5% 甘油，2 mmol · L-1 β–巯基乙醇，1 mol · L-1
尿素）、透析液 V（100 mmol · L-1 Tris-Cl，10 mmol · L-1 EDTA，0.1% SDS，5%甘油，2 mmol · L-1
β–巯基乙醇）、透析液Ⅵ（50 mmol · L-1 Tris-Cl，5 mmol · L-1 EDTA，5% 甘油，2 mmol · L-1 β–巯
基乙醇）、透析液Ⅶ（20 mmol · L-1 Tris-Cl，2 mmol · L-1 EDTA，5% 甘油，2 mmol · L-1 β–巯基乙
醇），各透析液均调 pH 8.0，过滤后 4 ℃保存。
1.2 川桑UFGT基因的鉴定
分别以苹果及草莓的 UFGT 基因的氨基酸序列作为 query 序列，在 MorusDB（http：//morus.swu.
edu.cn/morusdb/）中的 TBLASTN 程序检索桑树基因组以及预测基因序列，期望值设置为 10-10。将
获得的期望值较低的氨基酸作为 query 序列，检索苹果及草莓的基因组（http：//www.rosaceae.org）
及预测基因序列，如两次结果一致，则视为直系同源基因。利用 Sequencer 4.2、Genetyx-version 等
软件设计引物和序列分析，利用 MEGA4.1 程序，采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建 MaUFGT
基因的系统进化树，校验参数重复 1 000 次。
1.3 桑树总RNA的提取及cDNA第 1 链的合成
以果桑‘嘉陵 40’不同发育时期的果实、不同叶位的叶片及不同组织为材料。各取 50 mg 新鲜
样品于预冷的研钵中加液氮迅速研磨成粉末状，参照 RNA 抽提试剂盒（TaKaRa 公司）提取总 RNA，
将提取的 RNA 用 DNA 酶消化，最后用 40 µL DEPC 水溶解 RNA，经过 1%琼脂糖变性凝胶电泳检
测后，紫外分光光度计测定浓度。以总 RNA 为模板，以 Oligo(dT)18 为引物，利用 M-MLV 反转录
酶合成 cDNA 第 1 链，置–80 ℃保存备用。

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1.4 MaUFGT的表达分析
根据荧光定量引物设计原则，以桑树肌动蛋白基因 Actin2（GenBank：HQ163774）为内参基因，
以克隆的桑树 3 个 MaUFGT 基因为靶基因，分别设计特异引物（表 1）。根据 3 个基因核苷酸序列，
设计特异引物（表 1），分析 3 个基因在不同时期的果实、不同叶位的叶片以及不同组织的表达情况。
实时定量 PCR 按照 TaKaRa 公司的定量试剂盒使用说明书进行操作，表达量分析采用 2-∆∆Ct 计算。

表 1 PCR 引物
Table 1 The primers for PCR analysis
基因
Gene
上游引物
Forward primer（5′–3′）
下游引物
Reverse primer（5′–3′）
产物/bp
Product
ACT-1
MaUFGT1
MaUFGT2
MaUFGT3
UFGT2
MaUFGT-2
GCATGAAGATCAAGGTGGTG
CATCGGACCCTTTACCCTAA
AACATAGAGATGGCGGTGGT
AAGATCGGGTGTTTGGTCTC
ATGGCACCATCACCACCTTGCC
CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC
CATCTGCTGGAAGGTGCTAA
AACCAGTCTAAGCAGCCGTT
GAGCCAACTCTCCTCCAAAC
GTCGAATCTTCTCGCTCTCC
TTATATCAGTCTTACAACTCCT
GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT
95
81
88
139
1 386
1 386
注：下划线指酶切位点。EcoRⅠ：GAATTC；NotⅠ：GCGGCCGC.
Note：The underline represents restriction sites. EcoRⅠ：GAATTC；NotⅠ：GCGGCCGC.

1.5 MaUFGT2 基因的克隆
采用 UFGT2 的特异引物 UFGT2-F 和 UFGT2-R（表 1），以 cDNA 为模板，使用 DNA 聚合酶进
行 PCR 扩增，用 DNA 凝胶回收试剂盒（OMEGA 公司）回收 PCR 扩增产物，回收产物与 pMD19-T
载体进行连接，连接产物转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，在含氨苄霉素的培养基上进行抗性
筛选，随机挑选菌落，进行菌落 PCR 鉴定。选取阳性克隆送至南京金斯瑞基因有限公司进行测序。
蛋白氨基酸序列的分子量、等电点分析在 ExPasy（http：//web.expasy.org/）网站上进行。
1.6 MaUFGT2 基因的原核表达载体构建及诱导表达
采用 MaUFGT2 的特异引物 MaUFGT2-F 和 MaUFGT2-R（表 1，下划线标记为酶切位点，上游
为 EcoRⅠ，下游为 NotⅠ)，以 pMD19-MaUFGT2 质粒为模板，回收扩增产物。目的片段与 pMD19-T
载体进行连接，转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中。选取阳性克隆送至南京金斯瑞公司测序。含
目的基因的阳性质粒经EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化后插入已被EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化后的表达质粒
载体 pET28a(+)，构建原核表达载体 pET28a(+)-MaUFGT2，将重组质粒转化至大肠杆菌 BL21(DE3)
感受态细胞，挑选阳性菌液，进行测序鉴定。
筛选出来的表达宿主菌接种于 5 mL LB 液体培养基（含 50 μg · mL-1 卡那霉素）中，37 ℃培养
过夜；然后按体积比 1︰100 接种于 250 mL 的含卡那霉素的 LB 液体培养基，37 ℃培养至 OD600 值
0.6 ~ 0.8 之间，加入 IPTG 至终浓度为 0.4 mmol · L-1，在 28 ℃下培养 4 h，对所收集菌体处理后进
行 SDS-PAGE 分析。
1.7 MaUFGT2 蛋白的纯化和复性
将收集到细胞培养物于 4 ℃下 5 000 r · min-1 离心 15 min。弃上清液，每克菌体加入 3 mL PBS，
轻轻用玻棒旋动，使菌体悬起，冰浴超声波破碎（功率 500 W，工作 1 s 停 2 s，共 20 min）。4 ℃
下 10 000 r · min-1 离心 20 min，分别取上清液和沉淀进行电泳分析（图 4），沉淀用适量的 8 mol · L-1
的尿素溶解过夜，10 000 r · min-1 离心 20 min 取上清液，即得包涵体溶液。
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采用 Ni-NTA 亲和柱对超声波破碎的包涵体溶液中的表达蛋白进行分离纯化，纯化步骤为：首
先将 NTA 树脂装入合适的层析柱，用 10 倍柱体积平衡液冲洗 Ni 柱，然后将样品加入层析柱中，
流速控制在 15 mL · h-1，待样品完全通过柱子后，依次用 5 倍柱体积的 10、40、100 和 250 mmol · L-1
咪唑洗脱液进行洗脱，所得蛋白–80 ℃保存；取纯化的蛋白 10 μL，进行 SDS-PAGE 电泳。收集到
的目的蛋白 4 ℃进行透析，依次用 500 mL 的透析液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ 透析除去尿素，
各透析 4 h，透析液于 10 000 r · min-1 离心 15 min 以去除不溶蛋白（隋昕，2011），–80 ℃冰箱保
存备用。
1.8 MaUFGT2 蛋白质谱鉴定
蛋白胶酶解及脱盐：将含目的蛋白的胶粒切除后转入到 1.5 mL 的 EP 管中，加入 300 μL 的 0.1
mol · L-1 NH4HCO3/30%ACN 脱色液脱色，直至透明，吸取上清液，加入 0.1 mol · L-1 NH4HCO3，混
匀后室温静置 15 min。然后将上清液冻干，加入 5 μL 测序级 Trypsin（2.5 ~ 10 ng · μL-1，Promega）
溶液（酶与蛋白质质量比为 1︰10），37 ℃反应 20 h 左右，吸取酶解液，转移至新的 EP 管中，原管
加入 100 μL 60% ACN/0.1% TFA，超声 15 min，合并酶解液并冻干，采用 Ziptip（millipore）进行脱
盐处理。
质谱分析：冻干样品采用 2 μL 20%的乙腈溶解。取 1 μL 溶解样品，点于样品靶上，干燥后再
取 0.5 μL 过饱和 CHCA 基质溶液（溶剂为 50% CAN，0.1% TFA）点至对应靶位处并自然干燥。样
品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用串联飞行时间质谱仪（4800 Plus MALDITOF/TOFTM
Analyzer）进行测试分析，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。
1.9 桑树MaUFGT2 蛋白体外酶活性测定
表 2 洗脱条件
Table 2 Elution condition
洗脱时间/min
Elution time
洗脱液 A（0.1%甲酸水溶
液）比例/%
The proportion of eluent A
（0.1% formic acid
aqueous solution）
洗脱液 B（100%乙
腈）比例/%
The proportion of
eluent B（100%
acetonitrile）
0 ~ 5 5 ~ 10 95 ~ 90
5 ~ 10 10 ~ 20 90 ~ 80
10 ~ 25 20 ~ 40 80 ~ 60
25 ~ 40 40 ~ 25 60 ~ 75
40 ~ 50 25 ~ 5 75 ~ 95
取纯化的蛋白液 200 μL，加入 200 μL 50 mmol · L-1 甘氨酸缓冲液（pH 8.5），30 μL 2 mg · mL-1
的槲皮素和 20 μL 15 mg · mL-1的UDP葡萄糖，
30 ℃水浴反应 20 min。加入 150 μL 20%三氯
乙酸甲醇溶液终止反应。10 000 × g 离心 5 min，
取上清液保存于–20 ℃，待测。采用高效液相
（HPLC）对反应产物进行定性分析。洗脱液
及洗脱条件见表 2，C18 柱，流速为 1 mL · min-1。
产物槲皮素–3–葡萄糖苷在 350 nm 下被洗脱
下来，标准样品为槲皮素–3–葡萄糖苷，
MaUFGT2 酶活性以样品中槲皮素–3–葡萄
糖苷的含量表示。
2 结果与分析
2.1 桑树类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因（MaUFGT）的鉴定及信息学分析
通过对川桑全基因组的检索分析，发现了 3 个 UFGT 基因，分别命名为 MaUFGT1、MaUFGT2
和MaUFGT3。将其编码的氨基酸序列上传到NCBI网站进行Blast比对。结果显示，与毛果杨（Populus
trichocarpa，XP_006376354）、葡萄（Vitis vinifera，ABF59818）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，

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NP_197207）、甜樱桃（Prunus avium，AHL45018）、红凤菜（Gynura bicolor，BAP47703）、可
可（Theobroma cacao，XP_007014139）、石榴（Punica granatum，AHZ97875）的同源性分别为 62%、
63%、59%、56%、54%、53%和 56%，这些氨基酸序列的 C–末端中都含有 44 个氨基酸组成的 PSPG
结构域，该序列被认为是 UDP-Glucose 的结构域。
2.2 桑树类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因（MaUFGT）的进化分析
利用 MEGA4.0 软件采用 UPGMA 法构建类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶的系统进化树（图 1）。
分析发现，这些基因可以聚为两个大类。第Ⅰ类以类黄酮 3–O–糖基转移酶（3GT）的植物为主，
如烟草、大麦、玉米等。第Ⅱ类以类黄酮 5–O–糖基转移酶（5GT）的植物为主，如拟南芥、芍药、
紫苏等。MaUFGT1 3GT 和 MaUFGT3 3GT 的亲缘关系非常近，与 MaUFGT2 3GT 的亲缘关系较远。
主效基因 MaUFGT2 3GT 与其他植物的 UF3GT 的亲缘关系明显高于 5GT，对于 3GT 基因家族而言，
MaUFGT2 3GT 与双子叶植物（山葡萄、甜樱桃、草莓）3GT 亲缘关系高于单子叶植物的 3GT，并
且由于桑树与草莓、甜樱桃等同属于蔷薇科植物，因此它们的亲缘关系较近。


















图 1 MaUFGTs 的氨基酸与其他物种 UFGT 氨基酸序列的系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree of MaUFGTs with UFGT proteins from other species

2.3 MaUFGT基因在不同组织中的表达
3 个 UFGT 基因的表达模式存在较大差异。在从顶芽依次向下不同叶位中，3 个 UFGT 基因表
达呈现先降低后升高，再降低又升高的趋势（图 2）。在不同组织中，MaUFGT2 表达量由高到低依
次为幼茎皮层、托叶、叶柄、幼茎木质部、幼茎表皮，MaUFGT1 和 MaUFGT3 表达量很低，有的
甚至检测不到（图 3）。在不同发育时期的果实中，MaUFGT2 的表达量为先升高、后降低、再升高，
其中花后 37 d 的果实中的表达量是盛花期的 39 倍，是花后 21 d 的 31 倍；MaUFGT3 的表达量为先
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升高、后降低；而 MaUFGT1 基本不表达（图 4）。在所有的表达中，MaUFGT2 的表达量在 3 个基
因中都是最高，推测 MaUFGT2 是该基因家族的主效基因。











图 2 花青素生物合成途径中的 MaUFGT 基因在不同叶位（从顶芽向下）的表达分析
Fig. 2 Expression analysis of anthocyanidin biosynthesis MaUFGT gene in different leaves（down from bud）















图 3 花青素生物合成途径中的 MaUFGT 基因在不同组织的表达分析
Fig. 3 Expression analysis of anthocyanidin biosynthesis MaUFGT gene in different tissues














图 4 花青素生物合成途径中的 MaUFGT 基因在不同时期果实的表达分析
Fig. 4 Expression analysis of anthocyanidin biosynthesis MaUFGT gene in different stages of the fruit

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2.4 MaUFGT2 基因的克隆
为了进一步研究 MaUFGT2 基因的功能，
采用特异性引物 UFGT2-F 和 UFGT2-R，以‘嘉
陵 40 号’成熟果实的 cDNA 为模板进行 PCR
扩增（图 5）。目的片段经过回收、连接到
pMD19-T 载体上、转化大肠杆菌 DH5α，挑选
出阳性克隆测序。测序结果表明 MaUFGT2 基
因编码区长 1 386 bp，编码 461 个氨基酸，推
测蛋白质分子量为 51.2 kD，理论等电点为
7.77。









图 5 UFGT2 基因克隆
1：pMD19-UFGT2 扩增产物；M：Trans 2000。
Fig. 5 Cloning of UFGT2
1：Amplification of pMD19-UFGT2；M：Trans 2000. 2.5 主效基因MaUFGT2 的原核表达分析
2.5.1 原核表达载体构建
以 pMD19-MaUFGT2 质粒为模板进行 PCR 扩增，产物经 EcoRⅠ和 NotⅠ酶切后连接到被同样
酶切后的 pET-28a(+)载体上，阳性克隆通过测序及双酶切鉴定，获得了 pET-28a(+)-MaUFGT2 的重
组质粒（图 6）。
2.5.2 重组蛋白的诱导表达
将构建好的重组质粒转入到大肠杆菌 BL21(DE3)中，在加有 0.4 mmol · L-1 IPTG 的 LB 液体培
养基中诱导表达 4 h，收集菌体，超声破碎，4 ℃，14 000 r · min-1 离心 10 min，保留上清液，并将
沉淀用 8 mol · L-1 尿素重悬。将菌体超声破碎后的上清液和重悬的沉淀进行 SDS-PAGE 电泳，确定
MaUFGT2 蛋白在大肠杆菌中的表达形式（图 7）。结果表明重组蛋白在大肠杆菌 BL21(DE3)中以包
涵体形式存在，大小约为 55 kD。













图 6 重组质粒的双酶切鉴定
M：Trans 2000；1 ~ 4：双酶切重组质粒；
5：未酶切的空载 pET-28a(+)质粒。
Fig. 6 Verification of recombinant plasmid
by double digestion
M：Trans 2000；1–4：Recombinant plasmid by double
digestion；5：Plasmid of pET-28a(+) without digestion.












图 7 诱导 4 h 的类黄酮葡萄糖基转移酶蛋白表达分析
M：Marker；1：诱导 pET-28a(+)空载体表达产物；
2：诱导 4 h 的上清液表达产物；3：诱导 4 h 的沉淀表达产物。
Fig. 7 SDS-PAGE analysis of UFGT expression by 4 h induction
M：Marker；1：Expression products of the induced pET-28a(+)
bacterial strain；2：Supernatant of the induced pET-28a(+) UFGT
bacterial strain in four hours；3：Inclusions body of the induced
pET-28a(+) UFGT bacterial strain in four hours.


梁燕梅，朱攀攀，李 军，赵爱春，刘长英，UMUHOZA Diane，李镇刚，鲁 成，余茂德.
桑树类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析.
园艺学报，2015，42 (10)：1919–1930. 1927
2.5.3 重组蛋白的纯化及检测
将沉淀用裂解液重悬，得到目的蛋白的粗提液，用于蛋白的纯化。分别使用洗脱缓冲液 1、2、
3、4 进行不同咪唑浓度梯度洗脱，分别收集洗脱液，进行 SDS-PAGE 电泳。结果显示：40 mmol · L-1
咪唑能够洗去多余的杂蛋白，目的蛋白不能洗脱，当采用 100 和 250 mmol · L-1 咪唑时目的蛋白被大
量的洗脱，且纯度较高，可用于后续的酶活性分析（图 8）。












图 8 类黄酮葡萄糖基转移酶蛋白的纯化
M：Marker；1：诱导 pET-28a(+)空载体表达产物；2：沉淀穿透液。
Fig. 8 Purificationof UFGT protein
M：Marker；1：Expression products of the induced pET-28a(+) bacterial strain；2：Precipitation penetrating fluid.

2.5.4 目的蛋白的质谱鉴定
挑选纯化效果较好的蛋白，经过脱盐和质谱鉴定，在信号中检测到了7个肽段（图9）与MaUFGT2
基因的全长氨基酸序列相匹配，且覆盖了该基因的全部区域，结果证实纯化的目的蛋白为 MaUFGT2
基因的表达产物。











图 9 MaUFGT2 蛋白的质谱检测
红色为肽段。
Fig. 9 MaUFGT2 protein mass spectrometry detection
Red for peptide segment.

2.5.5 体外酶活反应的检测（HPLC）
将纯化得到的重组蛋白经过透析复性，用于体外酶活性试验。以槲皮素为底物，分析 MaUFGT2
蛋白的酶活性，发现该蛋白能够催化 UDP 葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素 3–β–D–葡萄糖甙（图
10），证实了原核表达诱导的蛋白具有一定的糖基转移酶活性。

Liang Yan-mei，Zhu Pan-pan，Li Jun，Zhao Ai-chun，Liu Chang-ying，Umuhoza Diane，Li Zhen-gang，Lu Cheng，Yu Mao-de.
Identification of MaUFGTs from mulberry and function analysis of the major gene.
1928 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (10)：1919–1930.























图 10 MaUFGT2 蛋白酶活性分析
Fig. 10 Enzyme activity analysis of UFGT protein
3 讨论
在高等植物中，普遍存在着一类调节类黄酮化合物形成的结构基因（韩振云 等，2014）。本研
究涉及到的 UFGT 属于结构基因，催化了类黄酮生物合成。UFGT 基因能够将糖基连接到特定受体
上，形成了稳定的花青素苷。自然条件下，游离态的花青素苷元通过糖苷键与一个或多个葡萄糖、
半乳糖、阿拉伯糖等连接形成花色苷，最后贮存在植物细胞的液泡中。UFGT 属于 UDP–糖基转移
酶（GTs）超家族成员（Chen et al.，2011）。在疏水性分子上添加糖残基增加了花青素的溶解度和稳
定性，影响了分子内和分子间花青素颜色变化（Springob et al.，2003）。因此，该基因的克隆对类黄
酮合成的研究具有重要意义。
在桑树类黄酮糖基转移酶基因家族中含有 3 个成员，实时定量 PCR 显示该基因家族在大部分组
织都有表达，少量不表达，存在一定的特异性。在从顶芽依次向下不同叶位中，3 个基因表达存在
着相似的规律，表现出先降低后升高，再降低又升高的过程，说明 MaUFGT 基因在叶中的表达是一
个动态变化过程，其可能参与了花青素以外其他物质的生物合成。在不同发育时期的果实以及不同
的组织中，甚至不表达。在所有的表达情况中，MaUFGT2 的表达量在 3 个基因中都是最高的，推
梁燕梅，朱攀攀，李 军，赵爱春，刘长英，UMUHOZA Diane，李镇刚，鲁 成，余茂德.
桑树类黄酮 3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析.
园艺学报，2015，42 (10)：1919–1930. 1929
测 MaUFGT2 基因是该基因家族的主效基因。 MaUFGT2 在果实发育的前 3 个时期，随着果实的发
育，叶绿体含量逐渐积累；花后 21 d 开始，花青素开始积累。因而，MaUFGT2 在果实中的表达水
平逐渐升高，其中花后 37 d 的果实中的表达量是盛花期的 39 倍，是花后 21 d 的 31 倍，结果表明
桑椹果实的颜色是由花色素苷的合成和叶绿体的降解相互作用所致。MaUFGT2 基因的表达与花青
素的积累相关，暗示该基因也是花青素生物合成中的关键因子。3 个基因的表达模式存在较大差异，
暗示该基因家族的功能出现了较大的分化。进化分析发现，3 个 UFGT 基因的结构分属两类，一类
是 MaUFGT2，另一类是 MaUFGT1 和 MaUFGT3，MaUFGT1 和 MaUFGT3 之间的蛋白相似度较高，
两类之间蛋白质序列的同源性不高，推测两类基因的进化方式可能不一样。各物种之间的多序列比
对分析发现，UFGT 蛋白序列差异较大，只有少数的几个保守活性结构域，表明该基因在植物进化
过程中受到的选择压力可能较小。
目前，很难根据进化树或 UFGT 酶的酶学性质预测其精确功能，因为同一进化枝基因的蛋白或
同一家族的酶可能具有不同的供体或受体，即非特异性（Osmani et al.，2009）。本研究中克隆的
MaUFGT2 蛋白与其他物种的氨基酸序列相似性不高，可能不同 UFGT 具有底物特异性。蛋白的高
级结构与 UFGT 酶的催化功能或底物特异性有关，一些保守性较低的 UFGTs 酶，其蛋白却有较高
的保守结构（Unligil & Rini，2000；Hu & Walker，2002；Zhang et al.，2003）。本研究中以‘嘉陵
40’的成熟果实为材料克隆得到的 MaUFGT2 基因，通过比对分析表明属于葡萄糖基转移酶家族。
同时，将 MaUFGT2 基因成功连接到原核表达 pET-28a(+)载体中，表达的 MaUFGT2 蛋白主要存在
于包涵体中。本研究中获得的 UFGT 基因高效表达的试验方法对该基因的鉴定及功能研究提供了重
要的技术支持。为了便于酶活性的测定，解决的方案包括采用较低温度下表达，选择恰当浓度的诱
导剂（IPTG）诱导，使用不同的表达载体以及复性条件的优化等方式，获得的 MaUFGT2 蛋白表达
量高，酶活性高。
本研究中发现该基因的表达酶蛋白能够催化 UDP 葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素 3–β–D–
葡萄糖甙，验证了该基因的具有糖基转移酶的功能。这一试验结果暗示该基因可以作为基因工程中
的目的基因，在桑树体外进行生物合成槲皮素 3–β–D–葡萄糖苷，对生物制药具有重要意义。

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