全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月

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椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达
罗 静，裴 瑾*，康亚兰，刘 薇，刘 维，陈翠平，吴清华
成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 610075
摘 要：目的 克隆中药橘核主要来源品种椪柑 Citrus reticulata 的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶（limonoid-UDP-glucosyl
transferase gene，LGT）基因，并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法 克隆获
得 LGT 序列，通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析，构建 LGT 与相关物种 LGT 的系统进化树，利用 RT-PCR 分析
橘皮、橘肉以及橘核中 LGT 基因表达量，并进行分析和比较。结果 测序所得椪柑 LGT 序列全长为 1 530 bp，具有 1 509 bp
的完整开放阅读框，编码 502 个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑 LGT
基因在橘核中表达量最低，其次为橘皮，表达量最高为橘肉。结论 成功克隆、分析并表达了椪柑 LGT 基因，为橘核中柠
檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。
关键词：椪柑；橘核；柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因；基因克隆；生物信息学分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)18 - 2691 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.18.022
Cloning, analysis, and expression of limonoid UDP-glucosyl transferase gene in
Citri Reticulatae Semen
LUO Jing, PEI Jin, KANG Ya-lan, LIU Wei, LIU Wei, CHEN Cui-ping, WU Qing-hua
Ministry of Education Key Laboratory of standardization of Chinese herbal medicines of Pharmacy, Chengdu University of
Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China
Abstract: Objective To cloning limonoid-UDP-glucosyl transferase (LGT) gene in Citrus reticulata, analyze the bioinformations of
LGT, and compare the expression to provide the foundation for the composite and regulation mechanism of the active ingredient in
Citri Reticulatae Semen. Methods LGT gene was cloned the protein characteristics were analyzed using bioinformatics and
constructing phylogenetic tree. The expression of LGT in the different parts was analyzed using real time-PCR. Results A 1 530 bp
LGT sequence in in C. reticulata, was obtained, which had a 1509 bp ORF and could encode 502 amino acids. And protein analysis and
forecast of its secondary and tertiary structures were carried out. Gene expression analysis revealed the expression of citrus LGT was
the lowest in semen, and was followed by skin, and the highest expression of fresh. Conclusion LGT gene of C. reticulata, and is
successfully cloned, analyzed, and expressed a basis for the study of matter in the synthesis and regulation of limonoids is provided.
Key words: Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan; Citri Reticulatae Semen; limonoid-UDP-glucosyl transferase gene; gene cloning;
bioinformations analysis

橘核 Citri Reticulatae Semen 为芸香科植物桠柑
Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan 及其栽培变种的
干燥成熟种子；具有理气、散结、止痛的功效。临
床用于疝气疼痛、睾丸肿痛、乳痈乳癖[1]。橘核的
主要化学成分为柠檬苦素类似物如柠檬苦素
（limonin）、诺米林（nomilin）等[2]，柠檬苦素类似
物是以柠檬苦素的化学结构为基本单位的一系列化
合物，是一类高度氧化的四环三萜类植物次生代谢
产物，具有抗肿瘤、昆虫拒食、抗病毒、镇痛、抗
炎、催眠等多种生物活性。可用于功能性食品添加
剂、抗癌食品、杀虫剂、饲料添加剂等[3]。主要分
布于芸香科和楝科植物体内，特别在柑橘属中含量
丰富[4]，在柑橘属果实的不同部位中，又以种子中
的量最高，其次是果皮，果肉中的量最低[5-6]。研究
表明在柑橘生长和成熟的过程中，柠檬苦素 A-环内
酯在柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶（ limonoid-
UDP-glucosyl transferase gene，LGT）基因的催化下
转变成了无苦味的柠檬苦素类似物[7]。LGT 基因是

收稿日期：2014-03-25
作者简介：罗 静（1989—），女，陕西咸阳人，硕士研究生，研究方向为中药资源开发与利用。Tel: 18224426244 E-mail: xiaojing.er123@163.com
*通信作者 裴 瑾（1970—），女，教授，中药品质与资源开发。Tel: 13880369322 E-mail: peixjin@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月

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柠檬苦素类似物合成过程中重要的基因。
本研究设计特异性引物，从椪柑中成功克隆获
得 LGT 基因、分析并表达了椪柑 LGT 基因。结果
发现椪柑 LGT 基因在橘核中表达量最低，其次为橘
皮，表达量最高为橘肉。旨在探索 LGT 基因表达量
差异，为柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
椪柑于 2013 年 12 月采于四川省蒲江县，由成
都中医药大学裴瑾教授鉴定为芸香科植物椪柑
Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan，果实洗净，经乙
醇擦拭及 DEPC 水处理，将果皮、果肉、橘核分离
后立即放入液氮中保存，带回实验室，于−80 ℃冰
箱保存。用于 RNA 提取。
Trizol 总 RNA 提取试剂（TIANGEN），2×Taq
PCR MasterMix（TIANGEN），ddH2O（TIANGEN），
cDNA 反转录试剂盒（TOYOBO），THUNDERBIRD
SYBR qPCR Mix（TOYOBO），多功能 DNA 纯化回
收试剂盒（BioTeke）。
1.2 RNA 提取和 cDNA 合成
使用 Trizol 总 RNA 提取试剂分别提取橘皮、
橘肉以及橘核中总 RNA。凝胶电泳检测为 3 条带的
总 RNA 进行反转录，反转录反应按 cDNA 合成试
剂盒说明书进行。
1.3 LGT 基因克隆与测序
根据文献报道[8]LGT 基因，使用软件 Primer
Primer 5.0、在线软件 http://www.yeastgenome.org/
cgi-bin/web-primer 设计引物，见表 1。以 cDNA 为
模板，使用 2×Taq PCR MasterMix 分别进行 PCR
扩增，扩增体系 20 μL：2×Taq PCR MasterMix，10
表 1 引物设计
Table 1 Primer design
编号 引物序列(3’—5’)
引物 1 正向：ATGGGAACTGAATCTCTTGTTCAT
反向：TCAATACTGTACACGTGTCCGTCG
引物 2 正向：CGGGATCCATGGGAACTGAATCTCTTGTTCAT
反向：CGAGCTCTCAATACTGTACACGTGTCCGTCG
引物 3 正向：GCTGCTTATTACCATCACTTTCACGG
反向：GAAAGGATAAGGAGTTGACGGATGC
引物 4 正向：TGCTATGCTTTGGGTTCAATC
反向：CGTTGCCGTCTTCTCCACTA
μL；正向引物，1 μL；反向引物，1 μL；cDNA 模板，
5 μL；dd H2O 3 μL。考察扩增条件为 94 ℃，3 min；
30 循环（94 ℃， 30 s；55～65 ℃，30 s；72 ℃，
1 min）；72 ℃，5 min。PCR 结果凝胶电泳检测，多
功能 DNA 纯化回收试剂盒（BioTeke）纯化回收 PCR
产物，由上海生工生物工程有限公司测序。
1.4 LGT 生物信息学分析
使用在线软件 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html，找出 LGT 基因的开放阅读框（open
reading frame，ORF），并获得其编码蛋白质序列；
使用在线软件 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，
将结果与 NCBI 中已登录的类似物种进行对比分
析；使用软件 MEGA 5.1 将结果相似性达 90%以上
的 物 种 LGT 构 建 进 化 树 ； 使 用 在 线 软 件
http://web.expasy.org/protparam/，分析其编码蛋白质
序 列 的 一 级 结 构 。 运 用 SOPMA 软 件
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page ＝
npsa_sopma. html 预测椪柑 LGT 蛋白的二级结构。
使用 SWISS-MODEL 软件 http://swiss model. exp-
asy. org/workspace/对其三级结构进行分析。
1.5 椪柑橘皮、橘肉、橘核 LGT 基因的表达
查阅文献报道[9]，得到 LGT 基因的 real-time
PCR 引物序列和内参基因 β-actin 的RT-PCR 引物序
列，见表 2。扩增体系 20 μL：Thunderbird SYBR
qPCR Mix，10 μL；正向引物 1 μL；反向引物 1 μL；
cDNA 模板，5 μL；dd H2O，3 μL。考察引物扩增
曲线、熔解曲线及标准曲线，考察 RT-PCR 条件：
95 ℃，2 min；40 个循环（94 ℃，15 s；55～65 ℃，
45 s；60 ℃，45 s）。65～95 ℃进行熔解曲线分析，
每个温度以每步 0.5 ℃上升。确定条件后测试果实
不同部分 LGT 基因表达量和 β-actin 基因的表达量。
数据通过 Bio-Rad cycle IQ 进行分析，用 2－△△Ct法
获得 LGT 基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 RNA 提取结果
Trizol 法提取所得 RNA 紫外分光光度法测定
表 2 β-actin 和 LGT 基因引物序列
Table 2 Primer sequences of β-actin and LGT genes
基因名称 引物序列(3’—5’)
正向：CCAAGCAGCATGAAGATCAA β-actin
反向：ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG
正向：GCTGCTTATTACCATCACTTTCACGG LGT
反向：GAAAGGATAAGGAGTTGACGGATGC
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A260 和 A280，A260/A280 为 2.0，凝胶电泳检测可见清
晰 3 条带，可用于后续实验，见图 1。
2.2 LGT 基因克隆及测序结果
引物 2 在扩增条件：94 ℃，3 min；30 循环（94
℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min）；72 ℃，5
min 下，可以得到 1 000 bp 左右的产物，见图 2。
测序结果为 1 530 bp 的序列。
2.3 LGT 生物信息学分析结果
测序分析表明，椪柑 LGT 基因全长 1 530 bp，
包含一段 1 509 bp 的 ORF，编码 502 个氨基酸组成
的蛋白，见图 3。
将该蛋白通过 NCBI 上的 Blastp 比对发现，该蛋
白属于葡萄糖基转移酶基因家族。比对结果显示，椪
柑 LGT 基因与 100 余种 NCBI 上登录的植物有相似

图 1 Trizol 法提取 RNA 凝胶电泳图
Fig. 1 Gel electrophoresis of RNA extracted by Trizol

图 2 PCR 产物凝胶电泳图
Fig. 2 Gel electrophoresis of PCR products
性，其中与同科植物甜橙 Citrus sinensis L.、阿尔及
利亚橘 C. clementina Hort. ex Tan、葡萄柚 C.
paradise Macf. 的相似性分别达 100%、99%、98%。
将相似性达 90%以上的比对结果用 MEGA5.1 构建
进化树，见图 4。
通过 ProtParam 预测 LGT 蛋白分子式为
C4585H7642N1530O1932S328，相对分子质量为 125 629.8，
理论等电点为 4.99。对该氨基酸序列进行亲疏水性
分析，结果见图 5，横坐标表示氨基酸残基的序号，
纵坐标表示残基的疏水、亲水特性，正值为疏水，
负值为亲水。椪柑 LGT 蛋白中疏水性最大值为
2.111，最小值为−0.567，总平均疏水指数（GRAVY）
为 0.711，预测其为疏水性蛋白。SOPMA 软件预测
椪柑 LGT 蛋白的二级结构为 α-螺旋占 40.24%，β-
转角占 4.18%，无规则卷曲占 41.04%，延伸链占
14.54%，结果见图 6。SWISS-MODEL 对其三级结
构进行预测，结果见图 7。

图 3 椪柑 LGT 基因编码的氨基酸序列
Fig. 3 Amino acid sequence encoded by LGT gene in C. reticulata


10 000 bp
3 000 bp
1 000 bp
500 bp
Marker 产物
橘皮总 RNA 橘肉总 RNA 橘核总 RNA
1
46
91
136
181
226
271
316
406
451
496
541
586
631
676
721
766
811
856
901
946
991
1 036
1 081
1 126
1 171
1 216
1 261
1 306
1 351
1 396
1 441
1 486
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图 4 椪柑 LGT 基因与相似物种的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of LGT gene of C. reticulata and
other related species

图 5 LGT 蛋白质疏水性分析
Fig. 5 Analysis of hydrophobic LGT protein

氨基酸残基位点
蓝色-α-螺旋 红色-折叠 绿色-β-转角 紫色-卷曲
blue-α-helix red-turn green-β-extended strand purple-coil
图 6 LGT 蛋白二级结构预测图
Fig. 6 Two-dimensional structure prediction of LGT protein
2.4 椪柑 LGT RT-PCR 表达结果
引物序列可用于 RT-PCR，条件考察结果是 LGT
扩增条件：95 ℃，2 min；30 c 循环（95 ℃，15 s；
57 ℃，45 s；60 ℃，45 s），β-actin 扩增条件为 95
℃，2 min；30 循环（95 ℃，15 s；57 ℃，45 s；
60 ℃，45 s），65～95 ℃进行熔解曲线分析，每个

图 7 LGT 蛋白三级结构预测图
Fig. 7 Three-dimensional model prediction of LGT protein
温度以每步 0.5 ℃上升。
选择 β-actin为内参基因，每个样品做 4个重复，
用 2−△△Ct 法对样本基因进行表达差异相对定量分
析。在本研究中选择橘核的表达为校准样本，橘皮
和橘肉为待测样本。根据所得结果橘肉中 LGT 基因
表达量较高，约为橘核表达水平的 1.477 5倍（图 8）。

图 8 LGT 基因相对表达量
Fig. 8 Relative expression histogram of LGT gene
3 讨论
研究克隆获得的椪柑 LGT，序列全长为 1 530
bp，具有 1 509 bp 的完整 ORF，编码 502 个氨基酸。
将该蛋白通过 NCBI 上的 Blastp 比对发现，该蛋白
属于 LGT 家族。预测 LGT 蛋白分子式为
C4585H7642N1530O1932S328，相对分子质量为 125 629.8，
理论等电点为 4.99。并对该基因进行了生物信息学
分析，为椪柑 LGT 基因提供了更多更详尽的信息。
研究发现椪柑 LGT 基因表达存在一定的器官
组织特异性，在橘肉中表达量最高，有研究表明柠
檬苦素类物质在橘核中的量最高，其次是果皮，果
肉中量最低[5]。在今后研究中，可以同时结合化学
成分研究，找出基因表达与化学成分的的关联性，
为进一步研究该基因的功能及其在柠檬苦素类物
质合成过程中的作用及其调控机制研究提供更多
的信息。
开展柠檬苦素类物质代谢工程研究，进而利用
细胞工程生产柠檬苦素类物质前景良好。深入探讨
香橼
蜜柑
葡萄柚
柚
酸橙
栽培品种
枳
山菜蒙
裘罗克利蒙
莱蒙
澳大利亚亚青宁
宜昌
花柚
高雷立花橘
柑橘杂交品种
甜橙
椪橙
阿尔及利亚橘
柑橘变种-玛格丽塔
泰拉密
酒饼簕
菲律宾木桔
0 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400
氨基酸残基序号

2.0
1.5
1.0
0.5
0
−0.5
−1.0
疏
水
性

橘肉 橘皮 橘核
2.0
1.5
1.0
0.5
0 相
对
表
达
量

0 100 200 300 400
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柠檬苦素类物质合成代谢的关键酶的作用及调控机
制，期望以基因工程手段干预增加柠檬苦素类物质
的量成为现实。为最终实验利用基因工程结合细胞
工程生产柠檬苦素类物质生产奠定理论基础。
参考文献
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