全 文 ：[中药指纹图谱 ]
广西粉葛药材高效液相色谱指纹图谱的研究
李小燕 1 , 　潘洪平 2 , 　杨立芳1 , 　罗伟强 1 , 　邓光辉 1 , 　韦冬萍 1
(1.广西民族大学化学与生态工程学院 ,广西南宁 530006;2.广西壮族自治区人民医院 ,广西南宁 530021)
收稿日期:2006-04-14
基金项目:广西壮族自治区教育厅科学基金资助项目(桂教科研 [ 2004] 20号)
作者简介:李小燕(1961～ ),女 ,副教授。从事天然产物的分析研究。电话:13517687016, E-m ail:lj j@ gxu. edu. cn
关键词:粉葛;指纹图谱;高效液相色谱法
摘要:目的:采用高效液相色谱法对广西粉葛药材进行指纹图谱的研究 ,为粉葛药材质量控制提供实验依据。方法:实验
采用 Phenomenex Gem ini C18色谱柱(4. 6 mm ×250 mm , 5 μm), 以乙腈 - 0. 4 磷酸水溶液为流动相进行二元梯度洗脱 ,
流速 1. 0 m L /m in,柱温 30°C, 检测波长 250 nm。结果:以 15个共有峰为评价指标 , 精密度和重复性试验中各共有峰相
对保留时间和相对峰面积的 RSD均小于 3 , 符号有关规定要求。 结论:此方法操作简单 , 精密度 、稳定性和重复性良
好 , 有助于粉葛药材的质量控制。
中图分类号:R284. 1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2006)09-1249-05
F ingerpr int of Rad ix Puerar iae thom son ii by HPLC
LIX iao-yan1 , 　PAN Hong-ping2 , 　YANG Li-fang1 , 　LUO Wei-qiang1 , 　DENG Guang-hu i1 , 　WEI Dong-
ping
1
(1. Co llege of Chem istry and E co log ica lE ng in eering, Guang xiU niversity forNa tiona lities, Nann ing 530006 , China;2. Peop lesHospita l ofGuang xi Au-
tonom ous Reg ion, Nann ing 530021 , Ch ina)
KEYWORDS:Radix Puerariae thom sonii;fingerprint;HPLC
ABSTRACT:AIM:The fingerprint chromatog ram s w ere estab lished for quality evaluation of Radix Puerariae
thomsonii byHPLC. METHODS:The ana ly sis w as pe rformed on a Phenomenex G em in i C18 co lumn (4. 6 mm ×
250mm , 5μm)w ith acetonitrile - 0. 4 phosphoric acid as mobile phase in a gradientmode a t a flow ra te of 1. 0
mL /m in, and a t a co lumn tempera ture o f 30°C. The detection o fw ave leng th w as a t 250 nm. RESULTS:F ifteen
peaksw ere se lected as the common finge rprin t peaks. The re lative standard dev iations fo r rela tive reten tion values
and re lative peak areas we re less than 3 in the precision and repea ted tes.t CONCLUSION:Themethod is reli-
able and can be he lpful to effectively the qua lity con trol of Radix Puerariae thom soni.i
　　粉葛为豆科植物甘葛藤 (Pueraria thom sonii Ben th)的干
燥根 , 味甘 、辛 、凉 ,归脾胃二经。 粉葛中的主要生物活性成
分有葛根素等异黄酮类化合物 [ 1] 。具有解肌退热 , 生津 , 透
疹 , 升阳止泻之功效 [ 2] , 临床应用广泛 [ 3-8]。 广西为粉葛药
材的主要产地之一 , 药源丰富。由于受产地 、生态环境等因
素的影响 , 有效生物活性成分的含量会有较显著的差异 , 从
而影响药材质量。由于中药的药效不是来自任何单一活性
成分 , 而是多种活性成分的协同综合作用。因此 , 仅采用单
一化学成分的定性定量来评价中药质量已不能满足对中药
质量控制的要求。由于指纹图谱能够从宏观和整体上表征
中药材的特征 , 目前已成为国际上公认的控制天然药物质
量的有效手段 [ 9 ～10] 。笔者采用高效液相色谱法对广西粉葛
药材的指纹图谱进行了研究 ,为粉葛药材的鉴别和质量控制
提供实验依据。
1　实验部分
1. 1　仪器与药品
仪器　美国 Pe rK in E lm e r公司 Series200高效液相色谱
仪(包括 Series 200紫外检测器 、 Se ries 200二元泵 、600 Series
接口及色谱工作站 )。 Phenomenex Gem ini C18色谱柱 (4. 6
mm ×250 mm , 5μm)。
药材　粉葛(产地:广西 ,经广西南宁食品药品检验所中
药室鉴定 ,均为豆科植物甘葛藤的干燥根。来源见表 1)。
试剂　乙腈 、甲醇为色谱纯 , 乙醇 、磷酸为分析纯 , 水为
高纯水 ,葛根素对照品 (中国药品 生物制品检定所 , 批号
1249
2006年 9月
第 28卷　第 9期
中 成 药
Chine se T raditiona l PatentM ed icine
Septem be r 2006
Vo .l 28　No. 9
110752-2004110)。
1. 2　色谱条件
以乙腈-0. 4 磷酸水溶液为流动相进行二元梯度洗脱 ,
流速 1. 0 mL /m in, 柱温 30°C, 检测波长 250 nm , 进样量 20
μL。梯度洗脱程序见表 2。
表 1　 粉葛药材样品来源及批号
Tab. 1　 The source s and batches of samp les
编号 来源 批号
1 南宁 A中药饮片有限公司 040901
2 桂林 B医药有限公司 040928
3 南宁 C医药有限公司 2005051503
4 南宁 D中药饮片有限公司 20050103
5 柳州 E药材批发站中药饮厂 040927
6 南宁 D中药饮片有限公司 031030
7 桂林 F大药店 050302
8 南宁 A中药饮片有限公司 050401
9 南宁 H中药饮片有限公司 20050924
10 广西 J药业股份有限公司 20051001
表 2　 流动相梯度洗脱程序
Tab. 2　 Grad ien t ofm ob ile phase
时间 /m in 乙腈 / 0. 4 磷酸水溶液 /
5 0 100
20 11 89
15 17 83
10 35 65
20 78 22
1. 3　实验方法
参照物溶液的制备:取葛根素对照品适量 , 用 30 乙醇
溶解 , 定容 ,作为参照物溶液(120 μg /mL)。
　　供试品溶液的制备:取各批粉葛药材粉末 (过 2号筛 )
约 2. 0 g,精密称定 , 置于锥形瓶中 ,精密加入 30 乙醇溶液
50 mL, 超声处理 1. 0 h, 放冷 , 再称定重量 , 用 30 乙醇溶液
补足减失的重量 , 摇匀 , 滤过 , 取续滤液 , 即得。不立即分析
的样品可暂存于 4℃的冰箱保存。
测定方法:分别精密量取参照物溶液和各供试品溶液
20 μL,注入液相色谱仪 , 记录 70 m in色谱图即得。以葛根
素的色谱峰(S)的保留时间和峰面积为 l, 计算其它各峰的
相对保留时间和相对峰面积比值。
2　结果与讨论
2. 1　方法学考察
精密度　以 6#药材制备供试品溶液 ,在 “ 1. 2”项下色谱
条件下 , 连续进样 5次 ,检测指纹图谱。结果表明 ,色谱图中
各色谱峰的相对保留时间的 RSD 小于 1. 08 ;相对峰面积
的 RSD 小于 2. 52 , 符合指纹图谱要求 ,表明仪器精密度良
好。
重复性　以 6#药材 5份 , 制备供试品溶液 , 分别检测指
纹图谱 , 结果表明各色谱峰的相对保留时间的 RSD 小于
1. 50 ;单峰面积大于等于 5 总峰面积的色谱峰其相对峰
面积的 RSD 小于 2. 90 , 表明方法的重复性良好。
稳定性　取 6#药材制备供试品溶液 , 分别在 0, 2, 5, 17,
24 h检测指纹图谱 ,结果表明 , 各主要色谱峰的相对保留时
间的 RSD小于 2. 10 , 相对峰面积的 RSD 小于 3. 00 , 表
明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 2　指纹图谱的建立及分析
2. 2. 1　指纹图谱及共有峰的标定
对 10个粉葛药材样品进行了测定 , 其色谱图有 15个主
要的共有特征峰 (占总峰面积的 90 以上 )。 其典型的
H PLC-UV指纹图谱见图 2, 其中 5号峰为葛根素 (与参照物
对照确认 ,图谱见图 1)。
图 1　葛根素 HPLC图谱
Fig. 1　HPLC chrom atogram of puerar in
图 2　粉葛药材 HPLC指纹图谱(样品 6#)
F ig. 2　HPLC fingerpr in t chrom atogram of rad ix
puerariae thom son ii of samp le No. 6
　　10批样品中 ,单峰面积与总峰面积的比值大于 20 的
共有峰只有 5号峰;大于 10 的共有峰有 13号峰 ,大于 5
的共有峰有 7号峰。其指纹峰面积之和与总峰面积之比值
均大于 90 (结果见表 4)。结果表明 1、2、3、 4、 5、 6、7、8、9、
10、11、12、13、14、 15号峰在 10批样品的色谱图中均出现。
以葛根素对照品保留时间为参照 , 计算各共有特征指纹峰的
相对保留时间 ,相对保留时间的 RSD 小于 3. 00 (n =10,结
果见表 3)。因此标定此 15个峰为共有指纹峰 ,并据此建立
粉葛药材的 HPLC指纹图谱。
2. 2. 2　共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值
以葛根素峰面积为参照 ,计算各批药材供试品共有指纹
峰的峰面积比值 , 结果见表 4。由表 4和图 3可见 ,各批供试
品指纹图谱的重现性较好 ,但各批样品间共有指纹峰的相对
1250
2006年 9月
第 28卷　第 9期
中 成 药
Chine se T raditiona l PatentM ed icine
Septem be r 2006
Vo .l 28　No. 9
峰面积有一定差异。
2. 2. 3　非共有峰面积
供试的 10批样品共有指纹峰面积之和占总峰面积比值
平均为 93. 86 ,则非共有峰面积占总峰面积的比值平均为
6. 14 , 符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》[ 11] 。
结果见表 4。
表 3　 10批粉葛药材共有特征指纹峰的相对保留时间
Tab. 3　 Re lat ive reten tion tim e of comm on peaks for ten batches of samp les
峰号 样品
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 9# 10# 平均值 RSD
1 0. 19 0. 20 0. 19 0. 19 0. 19 0. 19 0. 18 0. 19 0. 18 0. 19 0. 19 3. 00
2 0. 46 0. 47 0. 47 0. 46 0. 45 0. 47 0. 44 0. 46 0. 44 0. 46 0. 46 2. 40
3 0. 66 0. 67 0. 66 0. 66 0. 64 0. 66 0. 66 0. 66 0. 65 0. 64 0. 66 1. 47
4 0. 82 0. 84 0. 83 0. 82 0. 81 0. 82 0. 79 0. 82 0. 78 0. 81 0. 81 2. 18
5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0. 00
6 1. 16 1. 14 1. 16 1. 18 1. 14 1. 13 1. 19 1. 15 1. 17 1. 14 1. 16 1. 69
7 1. 34 1. 38 1. 38 1. 37 1. 34 1. 36 1. 30 1. 34 1. 29 1. 34 1. 34 2. 28
8 1. 40 1. 45 1. 45 1. 44 1. 41 1. 43 1. 40 1. 40 1. 40 1. 40 1. 42 1. 55
9 1. 49 1. 54 1. 55 1. 55 1. 50 1. 51 1. 48 1. 50 1. 48 1. 50 1. 51 1. 79
10 1. 66 1. 70 1. 68 1. 75 1. 69 1. 69 1. 68 1. 66 1. 65 1. 69 1. 68 1. 66
11 1. 98 2. 07 2. 04 2. 00 1. 99 2. 02 1. 90 1. 98 1. 88 1. 99 1. 99 2. 93
12 2. 17 2. 25 2. 23 2. 19 2. 18 2. 21 2. 09 2. 17 2. 07 2. 18 2. 17 2. 59
13 2. 52 2. 62 2. 58 2. 53 2. 52 2. 56 2. 40 2. 52 2. 40 2. 52 2. 52 2. 78
14 2. 60 2. 69 2. 65 2. 60 2. 60 2. 64 2. 47 2. 60 2. 47 2. 60 2. 59 2. 74
15 2. 71 2. 79 2. 76 2. 71 2. 71 2. 74 2. 60 2. 71 2. 61 2. 71 2. 70 2. 19
表 4　 10批粉葛药材共有指纹峰的相对峰面积
Tab. 4　 R e lative areas of comm on peaks for ten batches of samp les
峰号 样品
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 9# 10#
1 0. 05 0. 04 0. 03 0. 05 0. 04 0. 03 0. 04 0. 05 0. 05 0. 04
2 0. 08 0. 07 0. 05 0. 07 0. 06 0. 07 0. 07 0. 08 0. 05 0. 06
3 0. 05 0. 04 0. 02 0. 05 0. 04 0. 04 0. 04 0. 05 0. 07 0. 05
4 0. 03 0. 02 0. 01 0. 02 0. 01 0. 02 0. 02 0. 03 0. 04 0. 01
5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
6 0. 10 0. 05 0. 10 0. 10 0. 08 0. 05 0. 08 0. 10 0. 06 0. 08
7 0. 18 0. 21 0. 12 0. 24 0. 21 0. 20 0. 24 0. 18 0. 28 0. 21
8 0. 10 0. 08 0. 08 0. 10 0. 09 0. 08 0. 09 0. 10 0. 08 0. 10
9 0. 04 0. 03 0. 03 0. 06 0. 05 0. 03 0. 05 0. 04 0. 04 0. 05
10 0. 02 0. 02 0. 03 0. 03 0. 03 0. 02 0. 03 0. 02 0. 04 0. 03
11 0. 10 0. 09 0. 14 0. 12 0. 18 0. 08 0. 18 0. 10 0. 11 0. 18
12 0. 01 0. 01 0. 01 0. 01 0. 02 0. 01 0. 02 0. 01 0. 01 0. 02
13 1. 01 0. 31 0. 31 0. 71 0. 67 0. 28 0. 51 1. 01 0. 80 0. 66
14 0. 03 0. 02 0. 02 0. 03 0. 02 0. 01 0. 02 0. 03 0. 02 0. 02
15 0. 03 0. 01 0. 01 0. 02 0. 02 0. 01 0. 02 0. 03 0. 02 0. 02
΢共有峰面积百分比( ) 93. 05 93. 51 91. 89 96. 26 95. 00 93. 01 95. 63 93. 04 92. 15 95. 02
΢非共有峰面积百分比( ) 6. 95 6. 49 8. 11 3. 74 5. 00 6. 99 4. 37 6. 96 7. 85 4. 98
2. 3　指纹图谱的检验
取 10批粉葛药材 ,按供试品溶液的制备方法操作 , 分别
取各批药材制成的供试品溶液 , 按供试品检测法进行检测 ,
并与典型的指纹图谱相比较 ,结果表明各批样品指纹图谱相
似度较好 , 共有 15个共有峰 , 而且各共有峰的相对保留时间
的 RSD 均小于 3. 00 o结果见图 3和表 3。
3　讨论
3. 1　检测波长的确定:取粉葛药材供试品溶液进行紫外扫
描 , 结果表明在 240 nm ～ 260 nm 有较强的吸收且在 250 nm
有最大吸收 , 与葛根素对照品的最大吸收波长一致。检测波
长在 250 nm时 , 色谱峰较多 , 基线平稳 , 各峰分离度较好。
故采用 250 nm为指纹图谱的检测波长。
3. 2　试验过程中选择了多种流动相系统:①甲醇-水 , ②甲
醇-0. 4 磷酸水溶液 , ③乙腈-水 , ④乙腈-0. 4 磷酸水溶液
等度和梯度洗脱几种方式 , 并对梯度洗脱程序进行优化 , 结
果表明以 “ 1. 2”项下系统为最佳。各色谱峰分离度较好 , 峰
型尖锐 , 保留时间适中。
1251
2006年 9月
第 28卷　第 9期
中 成 药
Chine se T raditiona l PatentM ed icine
Septem be r 2006
Vo .l 28　No. 9
t /m in
图 3　粉葛药材 HPLC指纹图谱
F ig. 3　HPLC f ingerpr in t chromatogram of rad ix puerariae thom son ii for ten batches of samp les
1252
2006年 9月
第 28卷　第 9期
中 成 药
Chine se T raditiona l PatentM ed icine
Septem be r 2006
Vo .l 28　No. 9
3. 3　本实验结果表明 , 通过指纹图谱整体图形 、共有特征
峰 、相对保留时间等参数可对药材进行鉴定 , 通过各共有峰
相对峰面积可对药材的内在质量进行评价。 10批粉葛药材
指纹图谱中 , 15个共有峰相对保留时间符合程度较好 , 而且
峰面积比值较高的峰号(5、 7、 11、13号)相同 , 说明不同来源
的粉葛药材中上述含量较高的组分是基本一致的。但是 ,各
峰相对峰面积有一定的差异 ,说明药材之间的内在质量是有
差异的 , 提示药材应在固定产地的前提下才能保证药品内在
质量的一致性。同时说明单以一个或几个成分含量为主的
质量控制方法已不能真正反映中药材质量 , 而利用指纹图谱
对药材进行综合 、宏观的评价已成为当今对天然药物质量控
制的有效手段。
3. 4　本文建立的粉葛药材指纹图谱分析方法不同于一般含
量测定的特点在于:选择梯度洗脱以充分分离各组分 , 其中
葛根素的保留时间适中 , 与相邻色谱峰达基线分离 ,且分离
度大于 4,本法即可用于粉葛药材的鉴定 ,又可用于药材中葛
根素的含量测定 , 同时为粉葛药材中其它黄酮类化合物的含
量测定奠定了基础。本实验所建立的方法 , 精密度 、稳定性
和重复性符合指纹图谱研究的技术要求 [ 11] , 为广西粉葛药
材及制剂的质量控制提供了一定的科学依据。
参考文献:
[ 1] 　田宏哲 ,王　华 ,关亚风.液质联用分析葛根提取物及中药片
剂中异黄酮类化合物 [ J] .色谱 , 2005, 23(5):477.
[ 2] 　中国药典一部 [ S] . 2005:233.
[ 3] 　朱庆磊 ,吕欣然.葛根素的药理学和临床应用研究进展 [ J] .中
草药 , 1997, 28(11):693.
[ 4] 　禹志领 , 张广钦 , 赵红旗.葛根总黄酮对脑缺血的保护作用
[ J] .中国药科大学学报 , 1997, 28(11):310.
[ 5] 　潘洪平.葛根 、牛磺酸及其复方制剂降血糖作用的研究进展
[ J] .中成药 , 2002, 24(3):221.
[ 6] 　马翔凌 ,王莉.葛根素氯化钠注射液治疗急性脑梗死的疗效观
察 [ J] .中国临床保健杂志 , 2005, 8(4):335.
[ 7] 　李桂兰.葛根素对小儿心肌炎的作用及心功能影响 [ J] .医学
文选 , 2005, 24(4):487.
[ 8] 　李爱民.葛根素注射液治疗高黏血症 [ J] . 中华现代临床医学
杂志 , 2005, 3(15):1586.
[ 9] 　谢培山. 中药色谱指纹图谱 [M ] . 北京:人民卫生出版社 ,
2005:13.
[ 10] 　周玉新.中药指纹图谱研究技术 [M ] .北京:化学工业出版社 ,
2002:5.
[ 11] 　国家药品监督管理局. 中药注射剂指纹图谱研究技术要求
[ J] .中成药 , 2000, 22(10):671.
国际制药业者看好中国药物研发能力
美国辉瑞公司首席执行官马金龙博士目前在华发表演讲时指出 , 到 2010年 , 中国将会成为全世界五大药物市场之一;到
本世纪中叶 , 中国将成为全世界最大的药物市场。
马金龙认为 , 经过多年的发展 ,中国的药物研发水平已经获得了大幅提高 , 而近年来中国本土培养的大批高素质专业人
才的涌现 , 以及许多在国外接受教育的人才的大规模回流 , 都大大增强了中国的药物研发实力。
马金龙高度赞扬中国在专利和知识产权保护方面取得的巨大成就。他表示 , 中国建设创新型国家的政策 ,显示了政府致
力于开发本国科技创新资源的决心 ,从而为中国药物市场的发展提供了强有力的保障。
早在去年 , 辉瑞公司就已经在上海设立了中国研发中心 , 而欧洲最大制药企业赛诺菲 安万特集团 、瑞士罗氏公司和英
国葛兰素史克公司等世界主要制药企业也纷纷表示将在华设立研发中心。诸多国家制药巨头不仅看到了中国不断壮大的药
物市场 , 更开始将中国作为全球药物研发的新基地。正如辉瑞公司称 , 中国研发中心将成为该公司 “全球研发环节中非常重
要的一环” ,该中心即为中国服务 , 也将是 “亚洲的 、全球的”。
国际制药企业协会前经济政策总监韦伯博士曾经撰文指出 ,中国目前已经具备成为新药研发中心的五个必要因素:一是
政府重视医药研发 , 二是在知识产权知识方面取得巨大进步 , 三是医药研发的基础设施基本完善 , 四是医药产业模式比较合
理 , 五是拥有大量的医药类研发人才。
[新华社提供 ]
启 事
本刊于 2007年第 1期始正式扩版为 160页 ,每期定价为 19. 80元 ,全年订费为 230元。
因邮政资费的增加及审稿成本的提高 ,自 2007年 1月 1日始 ,本刊审稿费调整为每篇 50元。
　　　　特此敬告
中成药编辑部
1253
2006年 9月
第 28卷　第 9期
中 成 药
Chine se T raditiona l PatentM ed icine
Septem be r 2006
Vo .l 28　No. 9