全 文 ：荆豆凝集素修饰脂质体对小鼠口服吸收胰岛素的促进作用
张　娜 1, 2 , 平其能 1* , 徐文方 2
(1. 中国药科大学 , 江苏 南京 210009;2. 山东大学 , 山东 济南 250012)
摘要:目的　研究荆豆凝集素(UEA1)修饰的胰岛素脂质体在小鼠胃肠道的吸收作用。方法　采用碳二亚胺偶
联法制备荆豆凝集素修饰的磷脂酰乙醇胺(PE),将 PE-UEA1参入胰岛素脂质体中制成凝集素修饰脂质体 , 并证实
UEA1凝集活性不受影响。分别对正常小鼠及糖尿病模型小鼠灌胃给予 350 u kg -1胰岛素的修饰脂质体溶液 , 用
葡萄糖酶试剂盒测定小鼠血糖 ,并与同剂量普通胰岛素脂质体比较。 结果　对于正常小鼠 ,荆豆凝集素修饰脂质体
在 4 h使血糖降至初始水平的(84±15)%, 8 h降至(78±11)%, 12 h为(90±12)%。胰岛素普通脂质体几乎没有
降糖作用 , 与生理盐水对照组相当。对于糖尿病模型小鼠 , 荆豆凝集素修饰脂质体在 4 h使血糖降至初始水平的(73
±7)%, 8 h降至(74±9)%, 12 h为(86±9)%。结论　荆豆凝集素修饰的脂质体可能通过与 M 细胞表面特异性受
体的结合促进大分子药物的胃肠吸收。
关键词:胰岛素;荆豆凝集素;脂质体;血糖
中图分类号:R943. 4;R943. 42　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513 -4870(2004)12 - 1006 - 05
收稿日期:2004-02-09.
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(39930200).
*通讯作者　Tel:86 - 25 - 83271321, Fax:86 - 25 - 83301606,
E-m ai l:pingqn@ cpu. edu. cn
Enhancing effect of U lex europaeus agglutinin Imod ified liposomes
on oral insulin absorption in m ice
ZHANG N a
1, 2 , PING Q i-neng1* , XU W en-fang2
(1. China Pharm aceutica lUn iversity, Nan jing 210009 , China;2. Shandong Un iversity, J inan 250012 , China)
Abstract:Ami 　To investigate the enhancing effect on insu lin absorption through G I. tract in m ice
by using the U lex eu ropaeus agg lutinin I (UEA 1)modified liposomes as the carrie r. Methods　UEA1
modified phosphatidy le thanolam ine (PE ) was prepared by conjugating method of 1-e thy l-3-(3′-
dime thy lam inopropyl) carbodiim ide (EDC), then the modified compound (PE-UEA 1)was inco rpo rated
in to the conven tiona l liposomes of insulin to ob tain UEA1 mod ified liposomes. The agg lu tina tion testw as
performed to exam ine the UEA1 b io log ical activities after syn thesis andmodifica tion. When liposomesw ere
app lied to healthym ice o r diabe ticm ice at insulin dose o f 350 u kg -1 o ra lly, the hypog lycem ic e ffectw as
investiga ted acco rd ing to the b lood g luco se level de te rm ination. Results　The b lood g lucose leve ls o f the
healthy m ice reduced by UEA1modified liposomesw ere (84±15)% at 4 h, (78±11)% at 8 h and (90
±12)% at 12 h after oral adm inistra tion. The conven tiona l lipo somes and saline show ed no effec.t The
blood g lucose levels of the d iabe tic m ice reduced by UEA1 modified lipo somes w ere (73±7)% at 4 h,
(74±9)% at 8 h, (86±9)% a t 12 h after o ral adm inistration. Conc lusion　The UEA1 modified
liposomes promote the oral abso rp tion o f insu lin due to the specific-site combina tion onM ce llmembrane.
Key words:insu lin;U lex eu ropaeus agg lu tinin I;liposomes;blood g lucose
　　胰岛素口服给药是药剂学领域长期努力的研究 方向 ,利用 M细胞增加大分子的吸收已引起人们的
重视 [ 1] 。M细胞具有特殊的摄取结构和极大内吞
能力 [ 2] ,如表面微绒毛分布稀疏或完全没有微绒
毛 ,细胞顶部的胞浆内有大量的小囊泡 ,还经常可见
多囊泡体 ,因而 M细胞是更为有效的大分子药物吸
1006 药学学报 Acta Pha rmaceutica Sinica 2004, 39(12):1006 -1010
收途径 。肠细胞与 M 细胞相比 ,内吞能力很弱 ,而
且有很多屏障结构 。另外上皮细胞基底膜表达
MHC II型抗原 ,有耐受性[ 3] 。所以 M 细胞是主要
的内吞细胞 ,是特异位点靶向药物转运系统靶向的
主要位点[ 4] 。
微粒药物转运系统的表面性质影响药物吸收 ,
虽然改变粒子大小 、疏水性 、表面电荷及粒子表面化
学组成可增加吸收 ,但最为有效的是通过受体介导
来增加吸收 ,因而可以利用 M细胞特异凝集素作为
口服药物或疫苗的靶向介导因子[ 5] 。
荆豆凝集素 (UEA1)[ 6 -8]是报道较多的与 M细
胞结合的凝集素 ,其专属识别并结合小鼠小肠 M细
胞 。本文结合应用凝聚素与脂质体的优点 ,制备了
荆豆凝集素修饰的胰岛素脂质体 ,研究了正常小鼠
灌胃给予该脂质体后的降血糖促进作用 ,探讨凝集
素修饰脂质体作为生物大分子药物口服给药系统的
可能性 ,并初步验证 M细胞在微粒转运中的作用。
材料与方法
仪器　 JY-92 II型超声波细胞粉碎机 (宁波新
芝科器研究所);Agilent 1100 HPLC系统 (包括 DAD
二级阵列检测器 、四元梯度泵 、1100数据工作站 ,美
国安捷伦);Luna C18色谱柱 (4.6 mm ×250 mm ,配
Security Guard TM 3 mm 保护柱 , 美国 Phenomenex
公司 );Zetasize r 3000SH 激 光测粒 仪 (Malvern
Instrumen ts L td);FD-1000冷冻干燥机 (日本东京理
化 )。
试剂　荆豆凝集素(UEA 1, Sigma);磷脂酰乙醇
胺 (PE , S igma);1-乙基-3-(3′-二甲氨基丙基 )碳二
亚胺 (EDC , Fluka);2, 4, 6-三硝基苯磺酸 (TNBS ,
S igma);2′-盐藻糖基乳糖胺-牛血清白蛋白复合物
(2′-fuco sy llactosam ine BSA conjugate, Sigma);L-盐藻
糖 (上海伯奥生物科技有限公司 ,批号:020310);胰
岛素 (徐州生化制药厂 , 批号:020805, 效价 28
u mg- 1);注射用大豆磷脂 (上海浦江磷脂有限公
司 ,批号:020527);乙腈(色谱纯 );葡萄糖酶测定试
剂盒(上海荣盛生物技术有限公司 ),其他试剂皆为
分析纯 。
动物　昆明种小鼠 ,体重 20 - 22 g,由山东大学
实验动物中心提供。
荆豆凝集素-磷脂酰乙醇胺 (PE-UEA1)的合
成 [ 9] 　取 PE(60 mg)溶于氯仿中 ,加入过量戊二酸
酐室温孵化 5 h。反应液过硅胶柱 ,收集戊二酰磷脂
酰乙醇胺(N-g lut-PE),收率大于 92%。取N-g lu t-PE
12mg,加入 DMSO 250 μL和 0.15 mol L - 1氯化钠
1mL,超声处理 15 s,调 pH值至 3.5,加入 EDC 20
mg和 含 80 mg mL- 1 UEA1的 Tris-HC l溶液 1
mL,冰浴搅拌反应 24 h。薄层色谱监测反应进程 ,
反应液用硅胶柱分离 , 洗脱液为丁醇-乙酸-水
(4∶1∶1),收集产物。分别以N-glut-PE和 UEA1为
对照 ,薄层色谱检查 PE-UEA1。产物用流动去离子
水透析过夜 ,继用 PBS缓冲液透析 48 h, 收集透析
内液 ,冻干后即得纯化的 PE-UEA1。
PE-UEA1修饰程度的测定　三硝基苯磺酸法
测定修饰程度 [ 10] 。精密量取 1.84×10- 7mol L - 1
UEA1溶液 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6和 2.0 mL,分
别定量加入 1 mo l L -1硼酸钠缓冲液 (pH 9.3)
2.0, 1.8, 1.6 , 1.2, 0.8, 0.4和 0 mL,混匀 ,再依次加
入 0.03 mol L - 1 TNBS 25 μL, 混合放置 30 m in,
在分光光度计 420 nm测定吸收度值 ,得标准曲线:
A=0.259 6×10 -7C - 0.011 7(r =0.999 9)。取
1.84×10- 7 mo l L -1 PE-UEA1溶液 1.6 mL,同法
加入硼酸钠缓冲液和 TNBS溶液后测定 ,根据吸收
度值计算 PE-UEA 1中游离氨基占同量 UEA1中游
离氨基的百分数 ,进而计算 PE-UEA1修饰程度 。
凝集素修饰脂质体的制备　用逆相蒸发法制备
胰岛素脂质体 。取一定量的磷脂和胆固醇溶解于乙
醚中 ,加入胰岛素磷酸盐缓冲液 (pH 7.0),使胰岛
素含量为 1.0 mg mL -1。浴式超声 5 m in,除去有
机溶剂 ,探针式超声 1 m in,得胰岛素脂质体。取脂
质体混悬液 3 mL,加入 PE-UEA 1的 PBS(pH 7.0)
溶液 (含 UEA1 12 mg, PE 1.5 mg, 相当于每摩尔
UEA中含 PE 12 mo l) 3 mL,于 0 - 4 ℃孵化 2 h,即
得荆豆凝集素修饰胰岛素脂质体 。透射电镜下观察
凝集素修饰和未修饰脂质体的表面形态 , Ze tasizer
测定粒径 。
糖结合活性及结合专一性测定　修饰于脂质体
表面的 UEA1的糖结合活性用体外凝集实验检测。
将 UEA1的底物 2′-盐藻糖基乳糖胺-牛血清白蛋白
复合物(2′-fucosy llac to sam ine BAS conjugate)用磷酸
盐缓冲液 (pH 7.0)配成不同质量浓度溶液 (0.1,
0.2, 0.3和 0.4 mg mL -1),吸取 200 μL加至凝集
素修 饰 脂 质 体 混 悬 液 (相 当 于 磷 脂:0.33
mg mL -1 , UEA1:0.02 mg mL -1)中 ,总体积为 10
mL,充分混合 ,于 25 ℃孵化 15 m in,用分光光度计
测定脂质体浊度(A450)。
修饰于脂质体表面的 UEA1的糖结合专一性用
单糖抑制体外凝集实验检测。将 UEA1的单糖抑制
1007 张　娜等:荆豆凝集素修饰脂质体对小鼠口服吸收胰岛素的促进作用
剂 L-盐藻糖 (10 mg mL -1)加至凝集素修饰脂质体
混悬液 (相当于磷脂:0.33 mg mL -1 , UEA:0.02
mg mL - 1)中充分混合 ,于 25 ℃孵化 15 m in ,再加
入底物依上法处理 ,测定脂质体浊度 (A450)。
脂质体中胰岛素含量测定　采用 HPLC方法 。
色谱条件为流动相:0.01%三氟乙酸溶液-乙腈
(70∶30),流速:1.0 mL m in-1 ,紫外检测波长:210
nm ,进样量:20 μL。用 10 mg mL -1胆酸钠破坏胰
岛素脂质体和修饰胰岛素脂质体 ,氯仿提除脂质后 ,
取上清液测定。
包封率测定　柱色谱条件:凝胶柱Sephadex-G50
(20 cm ×2.5 cm),分别上样胰岛素脂质体和修饰
胰岛素脂质体 1mL,磷酸盐缓冲液 (pH 7.0)洗脱 ,
流速 0.5 mL m in- 1。应用 HPLC法分别测定游离
药物和脂质体中包封药物量。包封率 =W /(W +
W游 )×100%。W表示脂质体中包封药物量 ,W游表
示游离药物量。
正常小鼠降血糖实验　正常小鼠 24只 ,均分为
4组 。每只小鼠分别 po 0.5 mL。第 1组为生理盐
水对照组 ,第 2组为胰岛素溶液对照组 (相当于胰
岛素 350 u kg -1),第 3组为胰岛素脂质体组 (相当
于胰岛素 350 u kg -1),第 4组为荆豆凝集素修饰
脂质体组 (相当于胰岛素 350 u kg- 1 , UEA1 50
mg kg -1)。分别于口服前和口服后 0.5, 1, 2, 4, 6,
8, 12和 24 h于眼底静脉丛取血 ,离心 ,取血清 20
μL用葡萄糖酶测定试剂盒测定血糖。以零时刻为
100%,计算各时间点血糖的百分率。实验前小鼠不
禁食 ,并于给药 4 h后恢复正常饮食。
糖尿病模型小鼠降血糖实验　正常小鼠空腹
12 h后 ip四氧嘧啶 160 mg kg- 1 , 72 h后测空腹血
糖 ,以血糖值≥10.08 mmo l L- 1者为糖尿病模型小
鼠 。恢复正常饮食 12 h后将 24只糖尿病小鼠分为
4组 。第 1组为阴性对照组 ,每只小鼠分别 po生理
盐水 0.5 mL;第 2组为阳性对照组 ,每只小鼠分别
ip胰岛素 50 u kg- 1;第 3组为实验组 ,每只小鼠分
别 po胰岛素脂质体 (相当于胰岛素 350 u kg -1)
0.5 mL;第 4组为实验组 ,每只小鼠分别 po荆豆凝
集素修饰脂质体 (相当于胰岛素 350 u kg- 1) 0.5
mL。按上述方法测定血糖 ,计算各时间点血糖的百
分率 。
结果与讨论
1　PE-UEA1的合成
薄层色谱结果表明 , PE-UEA 1与 PE , N-g lut-PE
和 UEA1有不同的 Rf值:PE-UEA1为 0.66;PE为
0.32;N-glut-PE为 0.78;UEA1为 0。 PE-UEA1收率
以 UEA1计为 85%(n =3);PE-UEA1修饰率以
UEA1计约为 55% - 65%(n =3)。
2　UEA1修饰脂质体的形态和大小
凝集素修饰脂质体在电镜下外观颜色较深 ,与
普通脂质体明显的指纹状螺旋不同 , 表明经 PE-
UEA1修饰后脂质体的指纹状螺旋被干扰 (图 1)。
亲水性的 UEA 1不能直接与脂质体结合 ,本实验选
用带有正电荷的磷脂酰乙醇胺 (PE)与 UEA1偶联 ,
同时选用带有较多负电荷的大豆磷脂为脂质体主要
材料 ,有利于通过电性作用及疏水键作用将 UEA1
掺入脂质体双分子层 ,提高脂质体的定位靶向性质。
UEA1修饰脂质体的粒径为(57±22) nm。
3　糖结合活性及结合专一性测定结果
体外凝集实验浊度测定结果见图 2。由于底物
上存在多个与 UEA1结合的位点 ,因而会在 UEA1
修饰脂质体间 “架桥”。底物溶液与修饰脂质体孵
化 15 m in后 ,脂质体即可发生凝集 ,脂质体的凝集
可用浊度的增加定量说明[ 10] ,随使用的底物浓度越
高 ,与修饰脂质体结合的位点越多 ,浊度随之增加。
当只有一个 UEA1结合位点的抑制剂预先加入到修
Figure 1　Transm ission electron pho tom icrograms o f conventiona l liposomes(A) and U lex europaeus agg lutin in I (UEA 1)modified liposomes (B)
1008 药学学报 Acta Pha rmaceutica Sinica 2004, 39(12):1006 -1010
饰脂质体混悬液中时 ,抑制剂会竞争 UEA1的糖结
合位点 ,因而后加入的底物将不能和修饰脂质体结
合 ,脂质体凝集现象不会发生。
■— ■ Inhibi tor + subs trate;▲—▲ Substrate
Figure 2　 In vitro agg regation o f U lex eu ropaeus
agg lutinin I (UEA1)-liposomes in the presence o f the
substra te:2′-fucosy llactosam ine bov ine se rum a lbum in
(BSA) con juga te or in the presence of the substra te as
w e ll as inhibitors:L-fucose
4　脂质体中胰岛素的含量及包封率
方法专一性考察结果表明 ,在本色谱条件下 ,脂
质体及溶剂等不干扰胰岛素的含量测定。胰岛素峰
面积 A与药物质量浓度 C(mg mL - 1)成线性关系 ,
回归方程:A =39 840C - 1 043.82, r=0.999 6。线
性范围 5 - 100 μg mL - 1。脂质体混悬液中胰岛素
含量为 (1.0 ±0.4) mg mL -1 (n=3)。采用
Sephadex-G50凝胶柱可成功分离胰岛素普通脂质
体 ,脂质体出峰体积在 28 - 42 mL,游离胰岛素出峰
体积在 48 - 75mL。胰岛素脂质体包封率为 (38±
7)%(n=3);修饰脂质体包封率为 (40 ±7)%
(n =3)。
5　小鼠体内降血糖效果
正常小鼠降血糖试验结果见图 3。 UEA1修饰
脂质体在 4 h血糖降至初始水平的 (84±15)%, 8 h
降至(78±11)%, 12 h为 (90±12)%。胰岛素脂质
体组 、胰岛素溶液组与生理盐水对照组相似 ,均没有
降糖作用 ,且血糖水平较初始水平高。这主要是由
于反复眼底静脉丛取血造成的小鼠应激反应。血糖
升高是应激反应的一部分 ,是肌体自我保护的机制
之一[ 12] 。
糖尿病模型小鼠降血糖试验结果见图 4。
UEA 1修饰脂质体在 4 h血糖降至初始水平的 (73±
7)%, 8 h降至 (74±9)%, 12 h为 (86±9)%。实验
表明 ,与未修饰的脂质体相比 , UEA1修饰的脂质体
显著地促进了胰岛素的胃肠吸收 ,证实了 UEA1的
靶向作用 , UEA1对肠 M细胞的靶向性增加了载药
脂质体与肠 M细胞的接触和转运时间 。
◆— ◆ Saline solu tion;■— ■ C onvent iona l liposom es 350 u kg- 1;
▲— ▲ U lex eu ropaeus agglu tinin I (UEA1) m od ified liposom es 350
u kg - 1;○— ○ Insu lin solu tion 350 u kg- 1
Figure 3　E ffects o f o ra lly adm inistra ted some insu lin
preparations on the plasma g lucose levels(n =6)
◆— ◆ Solin e so lution, po;■— ■ In su lin solu tion 50 u kg -1 , ip;
▲— ▲ UEA1-liposom es350 u kg- 1 , po;○— ○ C onven tiona l liposom es
350 u kg- 1 , po
Figure 4　Plasma g lucose level changes afte r orally
adm inistra tion ofU lex europaeus agg lu tinin I(UEA 1)-
liposomes to diabeticm ice (n =6)
由于 UEA1仅识别并特异结合小鼠小肠 M 细
胞 ,本实验结果间接证明在微粒转运中小肠 M细胞
发挥了一定作用。
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