全 文 ： 2011年第 69卷 化 学 学 报 Vol. 69, 2011
第 20期, 2427～2433 ACTA CHIMICA SINICA No. 20, 2427～2433

* E-mail: yjjiang@nit.zju.edu.cn; Tel.: 0574-88229517
Received January 17, 2011; revised May 18, 2011; accepted June 16, 2011.
国家自然科学基金(No. 20803063)、宁波市自然科学基金(No. 2010A610024)资助项目.
·研究论文·
洋刀豆脲酶与抑制剂相互作用的分子对接和分子动力学研究
吕 婧 a 蒋勇军*,b 俞庆森 a,b 邹建卫 b
(a浙江大学化学系 杭州 310027)
(b浙江大学宁波理工学院分子设计与营养工程市重点实验室 宁波 315104)
摘要 通过洋刀豆脲酶抑制剂的筛选实验得到具有较好抑制活性的化合物 2-乙酰基-γ-丁内酯(COM), 其半数抑制浓度
在微摩尔浓度级别(IC50＝375 μmol•L－l). 在此基础上, 使用分子对接和分子动力学(MD)模拟的方法研究洋刀豆脲酶与
抑制剂乙酰氧肟酸(AHA)及活性化合物 COM之间的相互作用. 用 Gold3.0程序将两个小分子与洋刀豆脲酶的晶体结构
进行对接, 对接得到的复合物模型使用 Amber 程序进行 MD 模拟研究. 模拟过程中, 脲酶结构中的双核镍离子活性中
心选用 non-bonded模型. 研究结果显示: AHA与洋刀豆脲酶结合时, Ni(1)和 Ni(2)均为五配位; COM与洋刀豆脲酶结合
时 Ni(1)为五配位, Ni(2)为六配位的结合模型更加合理. 这些研究为了解洋刀豆脲酶与抑制剂之间的相互作用提供了重
要的参考信息.
关键词 洋刀豆脲酶; 分子对接; 分子动力学模拟; MM_GBSA; 镍离子
Molecular Docking and Molecular Dynamics Simulations of Inhibitors
Binding to Jack Bean Urease
Lü, Jinga Jiang, Yongjun*,b Yu, Qingsena,b Zou, Jianweib
(a Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310027)
(b Key Laboratory for Molecular Design and Nutrition Engineering of Ningbo City, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang
University, Ningbo 315104)
Abstract From the bioassay tests, compound 2-acetyl-γ-hydroxybutyric (COM) showed good inhibitory
activity against Jack bean urease with IC50＝375 µmol•L－l. Then the molecular docking and molecular dy-
namics (MD) simulations were performed to investigate the interactions between Jack bean urease and in-
hibitor aceto hydroxamic acid (AHA) and COM. GOLD3.0 program was used to perform the docking, and
Amber was used to model the docking complex structures of inhibitor-Jack bean urease. Nonbonded model
used for the nickel ions provided good reproduction of the active site of Jack bean urease during the MD
simulations. The results confirmed that both nickel ions were pentacoordinated in AHA-Jack bean urease
model. The binding model of the COM-Jack bean urease showed that Ni(1) was pentacoordinated while
Ni(2) was hexacoordinated. The models provided useful information for understanding of the interactions
between inhibitors and the protein.
Keywords Jack bean urease; molecular docking; molecular dynamics simulation; MM_GBSA; Nickel ion
脲酶(又称酰胺基水解酶)广泛存在于各种细菌、真
菌、植物、动物和人体中, 可以快速催化尿素水解生成
氨和二氧化碳[1,2]. 脲酶的催化特性在各个领域被广泛
的研究: 医学上, 脲酶与肾炎、肝昏迷和消化溃疡等发
病机理密切相关[3]; 农业上, 尿素的过快水解易导致植
物幼株的氮中毒或碱诱导植物的损害; 尿素的非生产性
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挥发, 对环境也造成了一定的污染[4]. 因此, 了解脲酶
的水解机理, 抑制脲酶活性, 降低脲酶带来的负面影响
具有重要的意义.
已知的植物、真菌和细菌的脲酶亚基的结构、数目
与类型均有不同, 但脲酶的氨基酸序列具有高度的保守
性[1,5], 它们的活性中心都有两个镍离子和配基. 这些结
构中, 镍离子之间的距离非常相似, 均在 3.5～3.7 Å之
间. 活性中心通常含有一个羧酸化的赖氨酸, 通过羧基
的两个O与镍离子分别配位; 两个镍离子又分别与两个
组氨酸配位, Ni(2)再与一个天冬氨酸作用, 如图 1 所
示[6～8]. 从洋刀豆中得到的脲酶晶体结构中含有两个抑
制剂分子, 这在已知的脲酶结构中是一个特例[9]. 具有
弱抑制作用的磷酸根位于活性中心与镍离子相互作用
(图 1a), 作用模式类似于磷酸抑制巴氏杆菌脲酶(BPU)
的晶体结构, 其中 Ni(1)为五配位, Ni(2)为六配位. 晶体
结构中另一个抑制剂分子β-巯基乙醇(BME)远离活性口
袋, 与 Flap区域的 Cys592形成双硫键作用, 这与 BME
抑制 BPU 的作用模式不同. 在 BME-BPU 晶体结构中,
BME 进入脲酶的活性口袋, 巯基的 S 位于两个镍离子
中间, 作为桥键与它们同时配位, 同时通过羟基的 O与
Ni(1)配位, 这一构象中两个镍离子均为五配位, 如图1b
所示[10]. 尽管人们对脲酶结构和作用机理做了大量的
研究, 迄今关于脲酶结构和作用机理尚无定论.

图 1 脲酶活性中心镍离子的配位情况
Figure 1 Schemes for active site Ni coordinations of ureases
(a) phosphate inhibited Jack bean urease; (b) BME inhibited BPU; (c) AHA
inhibited BPU; (d) native BPU
脲酶抑制剂可以有效的抑制脲酶活性, 减少氨气产
生, 在农业、畜牧业等领域被广泛的使用. AHA(图 2a)
是一种使用较早的高效特异脲酶抑制剂, 也是国内推广
应用较广的脲酶抑制剂, 通常它以负离子的形式与脲酶
作用[11,12]. 洋刀豆脲酶与抑制剂小分子作用机理的相关
报道并不多, 近年来我们课题组在洋刀豆脲酶抑制剂的
设计和筛选方面做了一些工作[13,14]. 选用 AHA 作为标
准品参比, 使用酚红指示法测定化合物对洋刀豆脲酶的
抑制剂活性, 测得 AHA 的半数抑制浓度 IC50 为 42
μmol•L－l, 与文献报道结果非常接近[15]. 以同样的方法
对 85 个化合物进行洋刀豆脲酶抑制活性的测试, 其中
化合物 2-乙酰基-γ-丁内酯(COM, 图 2b)显示了较好的
抑制活性, 半数抑制浓度在微摩尔浓度级别(IC50＝375
μmol•L－l).
目前, 分子对接和MD模拟已经成为研究生物大分
子和大分子与抑制剂相互作用的重要工具, 这类研究方
法从分子层次上提供抑制剂与蛋白分子的结合细
节[16～21]. 在上述活性数据的基础上, 我们通过分子对接
和MD模拟方法相结合的方法研究了 AHA和活性小分
子 COM 与洋刀豆脲酶的作用模式, 对辅助设计新型高
效的洋刀豆脲酶抑制剂有一定的参考价值.

图 2 化合物 AHA (a)和 COM (b)的分子结构
Figure 2 Molecular structures of AHA (a) and COM (b)
1 计算和实验方法
1.1 分子对接
使用 GOLD3.0 程序[22], 去除洋刀豆脲酶晶体结构
(PDB 代码: 3LA4)中自带的小分子, 与抑制剂 AHA 和
COM 对接. 程序的打分函数选择默认的输入和退火参
数的 Chem-Score; 使用遗传算法的默认设置. 选择以镍
离子为中心的 10 Å 范围作为对接的活性中心, 对镍离
子选择五和六配位两种作用模式. 每个小分子对接得到
10 个打分较好的对接模型, 根据模型的得分情况和小
分子的定位方式选择其中一个作为最佳对接模型.
1.2 动力学模拟
对对接得到的复合物结构进行MD模拟, 所有模拟
使用 Amber 9程序中的 Sander模块. 使用 Amber ff 03
力场[23]模拟脲酶结构, GAFF 力场[24]模拟小分子. 小分
子电荷和立场参数通过标准 antech 模型得到[25]. 由于
Amber中没有镍离子参数, 在处理镍离子时我们选用了
non-bonded模型, 给活性区域提供了一个相对柔性的环
境, 设置参数如下: q＝＋2 e－, σ＝1.10 Å, ε＝0.054
kJ•mol－1[26]. 复合物体系用 Na＋中和至电中性, 质心周
围包 10 Å 的 TIP3P水溶剂[27]. 体系用最陡下降法进行
2500 步的能量优化, 再通过共轭梯度法进行 2500 步的
能量优化. 经 300 ps的平衡后在恒温 300 K下进行 1 ns
动力学模拟, 步长为 2 fs; 模拟过程中使用 Berendsen
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等[28]提出的温度和压力耦合方程.
1.3 结合自由能计算
体系中结合自由能 ΔGbind 的计算使用 MM_GBSA
的方法, 假设复合物体系的自由能来自以下几个方面的
贡献[29,30]: ΔGbind＝ΔEgas＋ΔGsolv－TΔS, 结合自由能可
以分解为真空能量(ΔEgas)、溶解自由能(ΔGsolv)和熵效用
(TΔS)三个能量项. 其中真空能量采用 Sander 模块计算
包括内能 (ΔEint)、静电作用 (ΔEele)和范德华作用能
(ΔEvdw). 而溶解自由能包括极性溶解自由能(ΔGpb)和非
极性溶解自由能(ΔGnopolar)两部分. 结合自由能(ΔGbind)
可以极性溶解自由能通过 Generalized Born(GB)模型[31]
计算, 该方法与 Poisson-Boltzmann (PB)方法[32]具有相
似的精度, 并且计算速度快; 非极性溶解自由能通过计
算溶剂可及表面积拟合得到. 熵效应中, 分子的熵变化
(ΔS)通过分子水平的 NMA (normal mode analysis)的谐
振频率计算[33]. 通常, 由于生物大分子体系中熵效应的
计算比较耗时且较为复杂, 定性的比较结合能力的计算
中可以忽略熵效应的变化[34,35]. 从动力学模拟的最后
500 ps的轨迹文件中, 每间隔 10 ps取一次构象, 对得到
的 50 个构象进行结合自由能计算, 使用 Amber 模块中
的MM_GBSA方法完成.
2 结果与讨论
2.1 洋刀豆脲酶与 AHA的分子对接和动力学模拟
2.1.1 洋刀豆脲酶与 AHA的分子对接
洋刀豆脲酶的活性中心含有两个金属镍离子, 两者
的距离为 3.68 Å. 其中羧酸化的 Lys490 通过羧基的两
个 O与镍离子分别配位; Ni(1)通过 N(δ)与 His519配位,
通过 N(ε)和 His545配位; Ni(2)则通过 N(ε)与 His407和
His409配位, 通过O(δ1)与Asp633配位(如图 1a和图 3b
所示). 洋刀豆脲酶与 AHA 对接的最佳模型如图 3b 所
示, AHA 位于活性中心, 与正电性较强的镍离子配位,
氧肟酸的 O－(OB)位于两个镍离子的中心位置, 作为桥
键与两个镍离子配位[OB…Ni(1) 2.00 Å, OB…Ni(2) 2.02
Å], 另一个羰基 O与 Ni(1)配位(O…Ni(1)＝1.98 Å). 此
外, AHA 的 NH 与 Asp633 的 O(δ1)有氢键作用[NH…
O(δ1) Asp633＝2.72 Å]. 在这一对接模型中, 两个镍离
子均为五配位, 与洋刀豆脲酶晶体结构中 Ni(1)为五配
位, Ni(2)为六配位的结合模式不同. 这个对接模型与
AHA-BPU 的作用模式一致(图 1c)[11], 两者的活性中心
叠合, 均方根偏差值(RMSD)为 0.125 Å. 为了考察该模
型的稳定性和合理性, 我们对复合物模型进行 MD 模
拟.
2.1.2 洋刀豆脲酶与 AHA的分子动力学模拟
在对 AHA-洋刀豆脲酶复合物的 MD 模拟时, 活性
中心的镍离子对模拟是一个挑战: Amber程序中没有镍
离子的参数. 目前镍离子相关体系的MD模拟研究比较
少, 尤其是处理这样一个双核多配位的镍离子活性中
心, 需要人为地添加相应的参数. 通常对金属离子蛋白
体系的 MD 模拟时, 处理金属配位中心可以有 bonded
和 non-bonded两种模型选择. Bonded模型中, 通过设定
与金属配位的各键长和键角的参数来约束与金属配位
的各原子, 是一种较为刚性的模型, 适用于稳定的金属
区域模拟[36]. Non-bonded模型则主要通过静电作用和范
德华作用来约束金属离子与周围各配基, 提供一个相对

图 3 洋刀豆脲酶的晶体结构和 AHA-洋刀豆脲酶MD模拟平均结构的叠合及 AHA-洋刀豆脲酶复合物的对接模型
Figure 3 A superposition of the X-ray structure of Jack bean urease and the model of AHA-Jack bean urease
(a) A backbone superposed structure of X-ray structure of Jack bean urease and the model of AHA-Jack bean urease (get from the MD average conformation), (b) the
active site of the model of AHA-Jack bean urease






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柔性的环境, 适用于模拟过程中对金属配位体系的评
估 [37,38]. 因此研究过程中 , 我们对镍离子选择 non-
bonded模型. 为了检查模拟过程, 镍离子 non-bonded模
型下的配位情况, 从MD模拟的轨迹文件中提取Ni与各
配体(L)之间的距离(图 4), 并将 Ni-L的平均距离与洋刀
豆脲酶晶体结构对比, 如表 1 所示. 数据显示, non-
bonded模型下, AHA-洋刀豆脲酶的模拟过程中, 活性中
心的镍离子与各配体之间的距离无显著变化, 这说明在
模拟过程中 Ni 与各配位残基及抑制剂之间始终保持良
好的配位作用.
在MD模拟过程中, RMSD的变化是衡量体系是否
稳定的重要依据之一. 如图 5所示, 起初 200 ps, 主链的
RMSD上升较快, 这是蛋白内部结构优化造成的, 400 ps
后 RMSD 基本稳定, 在 1.8～1.9 Å 之间波动, 抑制剂
AHA的 RMSD一直非常稳定, 在 0.03 Å附近波动. 图
3a显示了MD模拟后复合物和晶体结构的叠合, 蛋白的
结构变化很小. 因此在 1 ns的MD模拟过程中, 脲酶结
构得到充分的放松, AHA与镍离子的活性中心始终保持
良好的配位作用, 1 ns的MD模拟足以证实该模型稳定
合理.
2.1.3 洋刀豆脲酶与 AHA的结合自由能的计算
为了从能量的角度考察 AHA 与洋刀豆脲酶的结合
情况, 使用MM_GBSA的方法对 AHA与洋刀豆脲酶复
表 1 洋刀豆脲酶晶体结构中 Ni-L的距离和 MD模拟过程中
Ni-L平均距离对比
Table 1 Distance for Ni-L from the X-ray coordination and
average from MD simulations
Ni-L X-ray/ Å
AHA-Jack bean
urease/Å
COM-Jack bean
urease/Å
Ni(1)—Ni(2) 3.68 3.71 3.73
His519 N(δ)—Ni(1) 2.16 2.21 2.22
His545 N(ε)—Ni(1) 2.19 2.08 2.09
Lys490 O(θ1)—Ni(1) 2.07 2.13 2.12
Oa—Ni(1) 2.35 2.17 2.04
OBb—Ni(1) 2.20 2.01 2.00
His407 N(ε)—Ni(2) 2.15 2.11 2.08
His409 N(ε)—Ni(2) 2.08 2.13 2.10
Lys490 O(θ2)—Ni(2) 2.11 2.08 2.09
Asp633O(δ1)—Ni(2) 2.23 2.12 2.14
OB—Ni(2) 2.12 2.00 2.00
Oc—Ni(2) 2.16 — 2.06
a
O chelated Ni(1), b OB bridged Ni(1) and Ni(2), c O chelated Ni(2).

图 4 Ni-L的距离在MD模拟过程中随时间的变化
Figure 4 Time evolutions of Ni-L distance during the MD simulations

图 5 对接复合物在MD模拟过程中 RMSD变化
Figure 5 RMSD fluctuation of the complexes from the docking models in MD simulations


No. 20 吕 婧等：洋刀豆脲酶与抑制剂相互作用的分子对接和分子动力学研究 2431

合物的MD模拟体系进行结合自由能的计算. 表 2列出
了各能量项对结合自由能的贡献 , 其中静电作用对
AHA 与脲酶的结合具有最主要的贡献, 这是由于活性
中心两个正电性极强的镍离子的存在. 从总能量上看,
结合自由能为负值－209.70 kJ•mol－1, 说明该结合是稳
定有利的.
表 2 两个体系结合自由能计算结果中各能量项(kJ•mol－1)及
对应 IC50值(μmol•L－l)
Table 2 Energy terms of MM_GBSA results for two systems
(kJ•mol－1) together with the experimental IC50 values (μmol•L－l)
System ΔEele ΔEvdw ΔGsol ΔGelea ΔGbindb IC50
AHA-Jack
bean urease －623.50 44.18 369.61 －253.88 －209.70 42
COM-Jack
bean urease －550.78 36.99 377.69 －173.09 －136.10 375
a
ΔGele＝ΔEele＋ΔGsol, b ΔGbind＝ΔGele＋ΔEvdw.
使用分子对接和 MD 模拟的方法合理的给出了
AHA 与洋刀豆脲酶的作用模式 , 这一作用模式与
AHA-BPU 的作用模式一致 . 我们课题组已经采用
non-bonded模型对 AHA-BPU体系进行MD模拟, 研究
脲酶结构中镍离子的作用和功能[14]. 结果显示, 底物与
脲酶结合时, 底物与镍离子的配位作用为主要作用, 这
与目前的对接和模拟结果一致. AHA与洋刀豆脲酶结合
时, 两个镍离子均为五配位的作用模式合理. 对比洋刀
豆脲酶晶体结构中的镍离子五配位和六配位并存的作
用模式, 我们认为洋刀豆脲酶与不同的抑制剂结合时,
镍离子可以存在两种不同的配位方式.
2.2 洋刀豆脲酶与 2-乙酰基-γ-丁内酯(COM)的分子对
接和动力学模拟
COM-洋刀豆脲酶的最佳对接构象(model a)如图 6a
所示: COM的一个羰基的 O(OB)作为桥键作用于两个镍
离子的中心, 与其分别配位[OB…Ni(1) 1.93 Å, OB…
Ni(2) 1.88 Å], 另一个羰基的 O 与 Ni(1)配位[O…Ni(1)
2.01 Å]. 尽管这一构象评分较高, 在 MD 模拟过程中,
它并不是一个稳定构象. 如图 4所示, 模拟过程中 COM
与镍离子之间的距离随着时间渐渐增大, 最后超出配位
作用范围, 两者之间的配位作用消失, COM脱离活性口
袋. 这说明 model a 并不是一个稳定的结合构象, 这可
能由于羰基O的电负性较弱, 不合适作为镍离子之间的
桥键.
在迄今已知的脲酶活性中心中, 两个镍离子之间通
常存在一个电负性较强的桥原子, 例如在野生的 BPU
结构中, 两个镍离子之间存在一个氢氧根, 与它们同时
配位(如图 1d). 这个氢氧根被认为在脲酶和底物的结合
和催化过程中具有重要意义[39,40]. COM中各原子的电负
性相对较弱, 没有适合的原子作为两个镍离子的桥原
子. 因此我们假设, 洋刀豆脲酶结构中也可以存在一个
氢氧根作为连接镍离子的桥键, 参与抑制剂的结合. 再
次对接时, 参照野生 BPU的结构, 在洋刀豆脲酶活性中
心的两个镍离子之间添加一个桥氢氧根[OH－的 OB…
Ni(1) 1.98 Å, OH－的 OB…Ni(2) 2.00 Å]. 在此结构上对
接得到的最佳构象如图 6b所示(model b): COM的两个
羰基 O 分别与镍离子配位[O…Ni(1) 1.99 Å, O…Ni(2)
1.87 Å], Ni(1)为五配位, Ni(2)为六配位. 这一模型与之
前文献中预测的双香豆素类化合物抑制洋刀豆脲酶可
能通过两个羰基 O 分别与镍离子作用的结合模式吻
合[41]. 将这一对接模型进行 MD 模拟, 考察其合理性和
稳定性, 如图 5所示, 蛋白的 RMSD在起初的 200 ps上
升较快, 400 ps后到达平衡, 在 1.9～2.0 Å之间波动, 小
分子的 RMSD始终维持在 0.4 Å作用. 对比 AHA与洋
刀豆脲酶复合物的模拟, COM 结合模型在模拟过程中
RMSD略微偏大, 这可能由于AHA的结构相比COM较
为刚性. 从模拟轨迹中提取镍离子与各配体之间的距
离, 如图 4和表 1所示, 镍离子与桥中心的氢氧根、COM
和各氨基酸配体之间的距离无显著变化, 模拟过程中始
终保持了良好的配位作用. 这些数据证明 1 ns的MD模
拟使整个体系达到平衡, model b是一个稳定合理的结合
构象 . 这一模型也说明 COM 与洋刀豆脲酶结合时 ,
Ni(1)是五配位而 Ni(2)是六配位的结合模式比两个镍离
子都是五配位的结合模式更稳定合适, 对接过程中氢氧
根作为桥键的引入合理.
使用MM_GBSA的方法对COM与洋刀豆脲酶结合
的体系 model b 进行结合自由能的计算, 各能量项的贡
献列于表 2中. 与AHA的结合情况一样, 静电作用仍然
是COM与脲酶结合的主要作用, 但其数值高于AHA的
结合体系 72.72 kJ•mol－1. 这是由于 AHA是以负离子的
形式结合到活性中心, 其静电作用较强; COM以中性分
子形式结合, 静电作用相对较弱. 两个体系中其余各项
对结合能的贡献相差甚微. 总能量上看, COM与洋刀豆
脲酶结合自由能为负值, 说明结合仍是稳定有利的; 但
其结合自由能高于 AHA的结合体系 73.60 kJ•mol－1, 说
明 COM与洋刀豆脲酶的结合能力弱于 AHA, 这也解释
了两者在抑制活性上的差异.
3 结论
通过分子对接的方法讨论了两种小分子抑制剂与
洋刀豆脲酶的作用模式 . 在 M D 模拟中 , 使用
non-bonded 的模型成功模拟了脲酶结构的双核多配位
镍离子活性中心. AHA与洋刀豆脲酶结合时, 两个镍离
子都是五配位, COM与洋刀豆脲酶的结合时, Ni(1)是五













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图 6 化合物与洋刀豆脲酶的两种对接模型
Figure 6 Two binding models of COM to Jack bean urease
配位而 Ni(2)是六配位. 这两种结合模式证实了洋刀豆
脲酶与抑制剂结合时, 镍离子可以有不同的配位方式,
同时镍离子中心桥键的选择非常重要. 当抑制剂结构中
没有合适的原子作为桥原子时, 可以引入一个氢氧根作
为桥键参与结合过程. 同时使用 MM_GBSA 的方法分
别计算两个体系的结合自由能, 计算结果证实小分子与
洋刀豆脲酶结合的主要作用是与活性中心镍离子的静
电作用, 而电负性较强的抑制剂 AHA 的结合优于电负
性较弱的化合物 COM.
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