全 文 ：收稿日期: 2002-11-16.
作者简介: 马兴铭 ( 1969-) ,男 ,副教授 . ① 通讯联系人 .
　　文章编号: 0455-2059( 2003) 06-0074-04
西藏砂生槐生物碱抑菌抑瘤的实验研究
马兴铭 1, 3 , 李红玉 1,① , 尹少甫3 , 孟雪琴1 , 周攻克1 , 陆晓明2
( 1.兰州大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　 730000; 2.兰州同健生物科技股份有限公司 , 甘肃 兰州　 730000;
3.兰州医学院 免疫学教研室 , 甘肃 兰州　 730000)
摘 要: 砂生槐是西藏南河谷地带分布极广的一种多年生豆科灌木 ,为青藏高原特有植物种 ,是一种极为宝贵
的植物资源 .我们首次从砂生槐种子中提取生物碱 ,用 K-B法和最低抑菌浓度测定法进行体外抑菌活性研究 ,
用 M T T法测定生物碱对肿瘤细胞增殖的抑制作用 .结果表明砂生槐种子总生物碱具有抑制金黄色葡萄球菌、
大肠埃希菌、铜绿假单胞菌生长繁殖的活性 ,对 SPC-A-1和 GLC-82肺腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用 ,且抑
制作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强 ,这一发现为开发砂生槐的药用价值提供了重要依据 .
关键词: 砂生槐 ; 生物碱 ; 抑菌作用 ; 抑瘤作用 ; M T T法
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A
　　砂生槐 ( Sophora moorcrof tiana )又名“西藏狼
牙刺”、“刺柴” ,豆科槐属 ,多年生矮灌木 ,茎尖和托
叶硬化为尖长刺 ,产于西藏波密、拉萨、米林等地 ,
为青藏高原特有植物种 ,具有抗旱、耐瘠薄、抗风沙
等生态适应性和很好的防风固沙 ,保持水土的功
能 .在雅鲁藏布江河谷呈大片分布 [1 ] .藏医药记
载 [2 ]砂生槐多以种子入药 ,味苦性凉 ,消炎解毒、催
吐 ,主治湿热黄疸、白喉、痢疾、赤巴病、消化不良、
虫病等 ,是一种极为宝贵的植物药用资源 .但是目
前当地群众仅利用其植株作为生活燃料或牲畜饲
料 .为充分开发其药物利用价值 ,我们从砂生槐种
子中提取了亲脂性总生物碱 ,研究了其抑菌的药理
作用 ,为开发砂生槐的药用价值提供理论依据 .
1 材料与方法
1. 1 总生物碱体外抑菌实验 [3 ]
1. 1. 1 试剂与菌株
MH琼脂、 MH肉汤、平板菌落计数琼脂: 杭州
微生物试剂厂 ;亲脂性总生物碱: 本室提取 , 4℃保
存备用 ;细菌标准菌株: 金黄色葡萄球菌 A209、大
肠 埃 希 菌 ATCC25922、 铜 绿 假 单 胞 菌
A TCC27853:兰州医学院基础医学院免疫学教研
室提供 .
1. 1. 2 菌液制备
取试验菌种接种于 M H琼脂平板培养基中 ,
35℃培养 14 h,用 M H液体培养基制备菌悬液 ,菌
液浓度为 1. 5× 108 CFU( co lony forming uni t ) /mL
和 5. 5× 105 CFU /mL备用 .
1. 1. 3 含砂生槐生物碱纸片制备
将砂生槐子生物碱溶解于体积分数 0. 5%二甲
亚砜水溶液 ,灭菌备用 .每张纸片 (直径 6 mm)加药
物样品 10μL,其含砂生槐生物碱样品分别为 2, 4,
8, 16 mg ,阴性对照分别是体积分数 0. 5% DMSO
水溶液 ,空白对照 0. 85%生理盐水 .
1. 1. 4 含生物碱盐酸盐纸片制备
将砂生槐子生物碱溶解于体积分数 0. 5%盐酸
水溶液 ,调 pH= 7. 2～ 7. 6,过滤除菌备用 .每张纸
片 (直径 6 mm)加药物样品 10μL,其含砂生槐生物
碱盐酸盐样品分别为 2, 4, 8, 16 mg ,阴性对照是体
积分数 0. 5%盐酸水溶液 ,空白对照 0. 85%生理盐
水 .
1. 1. 5 K-B法
取菌液浓度为 1. 5× 108 CFU /mL的菌株 0. 2
mL,均匀涂布整块 MH琼脂培养基表面 ,室温 3～
5 min后 ,贴加含药纸片 ,置入 35℃孵箱培养 16～
18 h,测定其纸片周围抑菌环直径的大小 ,结果经
SPSS软件统计处理 .
1. 1. 6 最低抑菌浓度测定 [4 ] ( M IC)
用 M H液体培养基 ( 2 mL /管 )将药物 ( 160
mg /mL)对倍稀释成系列浓度 ,每个浓度 2个复管 ,
第 39卷第 6期
2003年 12月
兰 州 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 )
Journal of Lanzhou Univ e rsity ( Natura l Sciences)
Vol. 39 No. 6
Dec. 2003
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 2003. 06. 019
然后加入 0. 1 mL浓度为 5. 5× 105 CFU /mL菌液
混匀 ,在 35℃孵箱培养 24 h, 以浊度为指标检查该
管中有无细菌生长 ,以不显示混浊试管的终浓度为
最低抑菌浓度 ,不易观察结果者 ,转种 MH固体培
养基确定是否抑菌 .
1. 2 MTT法测定生物碱对肿瘤细胞的增殖抑制作
用 [ 6]
1. 2. 1 细胞系与药物
上皮型低分化肺腺癌细胞 ( GLC-83)、上皮型
人肺腺癌细胞 ( SPC-A-1)引自兰州医学院第一附
属医院实验中心 ;砂生槐生物碱用二甲亚砜
( DM SO)配成 70. 4 mg /mL储液 . DM SO终浓度小
于体积分数 0. 1% , - 20℃冰箱保存 ,实验时用细胞
培养液稀释 .
1. 2. 2 试剂与仪器
RPM I-1640粉剂、四氮噻唑蓝 ( M TT)、十二烷
基磺酸钠 ( SDS) ,均为华美公司产品 ; DG-3022酶
联免疫测定仪 (华东电子医疗设备厂 ) ;超净工作
台 ; CO2 细 胞 培 养 箱 ( U SA ) ; 倒 置 显 微 镜
( OLYM PUS) .
1. 2. 3 M T T比色法
生长于 RPM I-1640完全细胞培养液 (含体积
分数 10%灭活小牛血清、 L-谷氨酰胺 2 mmol /L、青
霉素和链霉素各 100 U /L)中的指数生长期细胞 ,
以 1. 5× 105 CFU /mL的浓度接种于 96孔塑料培
养板 ,每孔 100μL.设阴性对照组 (不加药物 ,加体
积分数 0. 1% DM SO)、药物组 (分别加不同浓度的
生物碱 ,每组 4复孔 )和调零孔 (以 RPM I-1640全
培养液代替细胞 ,不加药物 ) .置 37℃ ,体积分数
5% CO2饱和湿度的培养箱中培养 24, 48, 72 h,实
验终止前 4 h每孔加入 MT T液 10μL,孵育结束
时 ,弃取上清 ,加入 DMSO 150μL,振荡器振荡摇
匀 ,用酶联免疫检测仪于 570 nm波长处测定各孔
的 OD值 .实验重复 3次 ,按下式求出抑制率: 抑制
率 (% )= (对照组 OD均值 -实验组 OD均值 ) /对
照组 OD均值× 100% .
2 实验结果
2. 1 砂生槐生物碱抑菌结果
以金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性 ( G+ )菌 ,
以大肠埃希菌和铜绿假单胞菌代表革兰氏阴性
( G- )菌 ,对砂生槐种子总生物碱进行体外抑菌药
理活性的初步研究 ,其生物碱的抑菌结果见表 1.
砂生槐生物碱能抑制 G+ 金黄色葡萄球菌、 G-
表 1 砂生槐种子生物碱抑菌结果 (X±S )
Table 1 The bacteriostasis action of alkaloids f rom SM seed in vitro
菌名 抑菌环直径 /m m
2 mg 4 mg 8 mg 16 mg
生理盐水 0. 5% DMSO
金黄色葡萄球菌 8. 92± 0. 47 11. 92± 0. 55 16. 17± 0. 61 20. 08± 0. 78 - -
大肠埃希菌 7. 67± 0. 36* 9. 08± 0. 45* 10. 58± 0. 82* * 12. 16± 0. 86* * - -
铜绿假单胞菌 7. 75± 0. 31* 9. 08± 0. 45* * 10. 75± 0. 81* * 12. 16± 0. 46* * - -
F检验 P < 0. 05 P < 0. 05 P < 0. 01 P < 0. 01
　　　 Dunnet t法检验:与金黄色葡萄球菌比: * P < 0. 05,* * P < 0. 01,其余各组之间比 P> 0. 05.
大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的生长繁殖而形成抑
菌环 (图 1) ;当砂生槐生物碱药物样品为 2 mg时 ,
图 1 砂生槐种子生物碱抑菌结果
Fig . 1 The bacteriostasis action of alkaloids from SM seed
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌形成
的抑菌环直径分别为 8. 92, 7. 58和 7. 75 mm, 3种
菌株各药物浓度间比较显示出统计学差异 ( P <
0. 05) ,砂生槐生物碱浓度越大 ,其纸片周围抑菌环
直径越大 ,砂生槐生物碱浓度与抑菌效应呈正相
关 .纸片的药物浓度相同时 ,对金黄色葡萄球菌形
成的抑菌环直径均大于大肠埃希菌和铜绿假单胞
菌形成的抑菌环直径 ,金黄色葡萄球菌与大肠埃希
菌和铜绿假单胞菌分别比较 ,具有统计学意义 .大
肠埃希菌与铜绿假单胞菌比较未显示出统计学差
异 (P> 0. 05) ,表明对金黄色葡萄球菌的抑制效应
更显著 .砂生槐种子总生物碱对金黄色葡萄球菌的
最低抑菌质量浓度为 9. 47 mg /m L、铜绿假单胞菌
的最低抑菌质量浓度为 28. 41 mg /mL(表 2) .
2. 2 砂生槐生物碱盐酸盐抑菌结果
砂生槐生物碱盐酸盐能抑制 G+ 金黄色葡萄球
菌的生长繁殖而形成抑菌环 , 2, 4, 8, 16 mg /m L质
量浓度形成的抑菌环直径分别为 7. 16± 0. 21 mm,
75第 6期　　　　　　　　　　　　马兴铭等: 西藏砂生槐生物碱抑菌抑瘤的实验研究　　　　　　　　　　　　　　
表 2 砂生槐种子生物碱的最低抑菌质量浓度
Table 2 MIC on bacterium of alkaloids f rom SM seed
菌名 菌液浓度
/C FU· mL- 1
最低抑菌质量浓度
/mg· mL- 1
金黄色葡萄球菌 5. 5× 105 9. 47
大肠埃希菌 5. 5× 105 18. 94
铜绿假单胞菌 5. 5× 105 28. 41
7. 91± 0. 24 mm , 9. 58± 0. 30 mm , 11. 16± 0. 64
mm.砂生槐生物碱盐酸盐在≤ 16 mg /mL的质量浓
度时 ,对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的生长繁殖无
抑制作用 ,未形成抑菌环 .
2. 3 砂生槐生物碱抑制肺腺癌细胞增殖的结果
由表 3～ 4可以看出砂生槐生物碱在 0. 6～ 4. 8
mg /mL的范围内均对 SPC-A-1和 GLC-82细胞的
增殖有明显的抑制作用 ,且抑制作用随药物浓度的
增加和作用时间的延长而增强 .同等条件下 ,砂生
槐生物碱对 SPC-A-1细胞增殖的抑制作用强于其
对 GLC-82细胞增殖的抑制作用 .
表 3 砂生槐生物碱抑制肿瘤细胞增殖反应的结果
Table 3 Antiprolif erative ef f ect of alkaloids f rom SM seed on GLC-82 and SPC-A-1 cells
生物碱质量浓度
/mg· mL- 1
GLC-82细胞抑制率 /%
24 h 48 h 72 h
SPC-A-1细胞抑制率 /%
24 h 48 h 72 h
0. 0 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
0. 6 5. 91 16. 10 29. 21 6. 20 11. 45 20. 73
1. 2 18. 44 27. 98 37. 08 17. 05 24. 42 30. 10
2. 4 24. 90 38. 96 40. 45 32. 81 43. 51 51. 86
4. 8 44. 48 51. 46 60. 11 44. 96 59. 92 74. 91
表 4 砂生槐生物碱抑制肺腺癌细胞增殖的 IC50
Table 4 IC50 on tumor cells of alkaloids f rom SM seed
mg /m L
细胞株 GLC-82 SPC-A-1
24 h 7. 29 9. 81
48 h 4. 47 3. 21
72 h 2. 66 2. 08
3 分析讨论
许毓英 [ 6] ,李玉祥 [7 ]对砂生槐种子进行营养成
分分析 ,蛋白质含量高达 29. 42% ～ 31. 23% ,仅次
于大豆 , 17种氨基酸含量 24. 53%以上 ,除色氨酸
外其余 7种必须氨基酸含量均高于豌豆 ,这对于植
物蛋白资源极缺的西藏具有重要意义 .
本实验表明砂生槐生物碱具有抑制 G+ 金黄色
葡萄球菌、 G-大肠埃希菌和铜绿假单胞菌生长繁殖
的功效 , 尤其对金黄色葡萄球菌的抑制作用更显
著 ,这可能与 G+ 葡萄球菌与 G-杆菌细胞结构不同
有关 ,浓度与抑菌效应呈正相关 .砂生槐生物碱盐
酸盐质量浓度在 2～ 16 mg /mL范围仅抑制金黄色
葡萄球菌的生长繁殖 ,对大肠埃希菌和铜绿假单胞
菌的生长繁殖无抑制作用 ,砂生槐生物碱的直接抑
菌效应明显强于砂生槐生物碱盐酸盐 .
M T T法通过测定细胞线粒体能量代谢水平间
接反应细胞的增殖情况 ,结果表明在 0. 6～ 4. 8 mg /
m L质量浓度范围下均对 SPC-A-1和 GLC-82细胞
的增殖有明显的抑制作用 ,且抑制作用随药物浓度
的增加和作用时间的延长而增强 ,对 SPC-A-1细胞
增殖的抑制作用强于其对 GLC-82细胞增殖的抑制
作用 .崔建芳等 [8 ]用薄层光密度法分析砂生槐种子
至少含有 4种生物碱: 1. 64%氧化苦参碱、 0. 5%氧
化槐果碱、 0. 172%苦参碱、 0. 005%槐果碱 .有关来
源于其他植物的四种生物碱活性研究已经有多篇
报道 ,具有抗肿瘤、抑病毒、调节 myc /ras的表达、
调节免疫及心血管功能等多种药理学作用 ,砂生槐
种子总生物碱抑菌抑瘤效应是否与这些生物碱有
关 ,有待将总生物碱分离纯化后进一步研究其有效
成分及抑菌和抑瘤的机理 .
参　考　文　献
[1 ]　中国科学院青藏高原综合科学考察队 .西藏植物志 ,第
二卷 [ M ].北京:科学出版社 , 1985. 717.
[ 2]　中国医学百科全书编辑委员会 .中国医学百科全书·
藏医学 [M ].上海: 上海科技出版社 , 1999. 204.
[3 ]　马兴铭 ,于红娟 ,刘燕玲 ,等 .藏药山生柳抑菌活性研究
[ J].中药药理与临床 , 2001, 17( 5): 21.
[ 4 ]　 Jeffey R, Aeschlimann, Linda D. Effects o f nor A
inhibito rs on in vitro antibacteria l ac tiv ities and
po stantibio tic effects o f lev o flo xacin, ciproflox acin,
andnor flo xacin ingene tically r ela ted strains o f
staphy loccus aur eus [ J ]. Antimicr ob Agents
Chemo ther, 1999, 43( 2): 335-340.
[ 5 ]　 Hussain R F, Nouri A M E, Oliv er R T D. A new
approach fo r measurement o f cy toto city using
co lo rmetrica ssay [ J]. Im muno l Methods, 1993, 160:
189
[6 ]　许毓英 .西藏砂生槐种子营养成分的初步研究 [ J]. 自
76　　　　　　　　　　　　　　　兰 州 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )　　　　　　　　　　　　　　　第 39卷
然资源学报 , 1992, 7( 4): 379-382.
[ 7]　李玉祥 .西藏砂生槐的生物学特性及综合利用 [ J]. 自
然资源学报 , 1993, 8( 5): 75-79.
[8 ]　崔建芳 ,章观德 .苦参等四种槐属植物药中生物碱的分
析 [ J]. 中药通报 , 1986, 2( 11): 38-39.
A study on bacteriostasis and inhibiting tumour cell proliferative
activity of alkaloids from Sophora moorcroft iana seed
MA X ing-ming
1, 3 , L I Hong -yu
1 , YIN Shao-pu
3 ,
MENG Xue-qin
1 , Z HOU Gong -ke
1 , LU X iao-ming
2
( 1. Schoo l o f Life Sciences, Lanzhou Univ ersity, Lanzhou, 730000, China;
2. Lanzhou Tong jian Bio technolog y Company , Lanzhou, 730000, China;
3. Depa rtm ent o f Immunology , Lanzhou M edical Colleg e, Lanzh ou, 730000, China )
Abstract: Sophora moorcrof t iana is a kind of perennial leguminous bush, w hich is widely dist ributed in
the Yaluzangbu Valley of Southern Tibet. It is a kind of v ery valuable na tural plant and g row s only in
the Tibetan altiplano. Alkaloids w ere ex t racted f rom Sophora moorcrof t iana seed in this study. The
bacteriostasis activities of alkaloid in vitro were tested w ith K-B method and minimal inhibi to ry
concentra tions ( M IC) . Inhibition proliferation activ ities on tumour cell o f alkaloid w ere measured by
M T T assay. The resul ts show there is a dramatic bacteriostasis activ ity on Staphyloccus aureus ,
Escherichia col i and Patina aerugionsa. SPC-A-1 cell and GLC-82 cell proli feration ef fect w ere inhibited
by alka loids in vit ro. The anti tumour activi ty wa s g radually enhanced wi th a alkaloid variety of time and
dose. The discovery provides an impor tant basis fo r possible medical application.
Key words: Sophora moorcrof tiana; alkaloid; bacteriostasis; inhibi ting tumour; M TT assay
77第 6期　　　　　　　　　　　　马兴铭等: 西藏砂生槐生物碱抑菌抑瘤的实验研究