全 文 ：龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻抑制机理的研究
周晓见1，2，夏 洁1，靳翠丽1，2，缪 莉1，2，董昆明1，2，封 克1，2*
(1．扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州 225127;2．扬州大学海洋科学与技术研究所，江苏扬州 225127)
摘要 ［目的］对前期研究发现的具有显著抑制铜绿微囊藻的龙爪槐正己烷提取物进行抑制机理分析。［方法］采用龙爪槐正己烷提取
物处理铜绿微囊藻，通过考察铜绿微囊藻的叶绿素 a含量、蛋白质含量、细胞膜透性和 SOD活性，初步分析龙爪槐提取物对铜绿微囊藻
抑制作用的机理。［结果］龙爪槐正己烷提取物破坏铜绿微囊藻的细胞膜系统，增加细胞膜透性;叶绿素 a和蛋白质含量在培养 7 d后
分别减少为对照组的 10%和 50%左右，对藻细胞的光合反应系统造成破坏;另外，藻细胞的 SOD活性在龙爪槐正己烷粗提物作用下，在
初期呈现为应激性上升，在后期表现为抑制的阶段性变化。［结论］龙爪槐正己烷提取物抑制铜绿微囊藻的可能机理是:破坏细胞膜，使
膜通透性增大;破坏光合反应系统，造成光合色素和蛋白质含量减少;SOD活性发生阶段式变化。
关键词 龙爪槐;铜绿微囊藻;正己烷提取物;抑制机理
中图分类号 X131． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)29 －18135 －03
Study on the Inhibitory Mechanism of Sophora japonica N-hexane Extract on Microcystis aeruginosa
ZHOU Xiao-jian et al (College of Environmental Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225127)
Abstract ［Objective］The research aimed to analyze the inhibitory mechanism of Sophora japonica n-hexane extract to Microcystis aerugino-
sa． ［Method］S． japonica n-hexane extract was used to treat M． aeruginosa． By inspecting chlorophyll-a content，protein content，cell mem-
brane permeability and superoxide dismutase (SOD)activity，the inhibitory mechanism of S． japonica n-hexane extract to M． aeruginosa was
analyzed initially． ［Result］S． japonica n-hexane extract destroyed the cell membrane system of M． aeruginosa and increased membrane per-
meability． The contents of chlorophyll-a and protein respectively declined to 10% and 50% of control group after cultivation for 7 d，which de-
stroyed the photosynthetic reaction system of M． aeruginosa． In addition，under the effect of S． japonica n-hexane extract，SOD activity of M．
aeruginosa presented the irritabillity increase in the early period and decreased in the latter period． ［Conclusion］Maybe the inhibitory mecha-
nism of S． japonica n-hexane extract to M． aeruginosa was destroying the cell membrane to increase the membrane permeability，destroying the
photosynthetic reaction system to decrease the contents of photosynthetic pigment and protein，changing SOD activity．
Key words Sophora japonica;Microcystis aeruginosa;N-hexane extract;Inhibitory mechanism
基金项目 国家自然科学基金项目(41076097、41006097、41106113) ;教
育部科学技术研究重点项目(211065) ;江苏省自然科学基
金项目(BK2010322) ;江苏省环境材料与环境工程重点实验
室开放课题(K090027、K090025、K090026、K090028) ;扬州
大学“新世纪”人才工程支持项目。
作者简介 周晓见(1976 － ) ，男，安徽安庆人，副教授，博士，从事水环
境生物学研究。* 通讯作者，教授，博士，从事环境科学研
究，E-mail:fengke@ yzu． edu． cn。
收稿日期 2011-06-30
由于水体富营养化引起藻类的暴发性增殖，形成水华，
已成为世界范围内的重大环境问题，并且有毒的蓝藻水华无
论在频率还是范围上都有扩大和蔓延之势［1 －2］。蓝藻水华
的主要优势种之一是铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa) ，该
种水华暴发除了引起养殖生物因缺氧死亡之外，大量藻体堵
塞水体过滤系统，造成人类饮用水短缺，更为严重的是它能
向水中分泌毒素，除了直接对鱼类、人畜产生毒害之外，还是
肝癌的诱发因素［3 －4］。因此，铜绿微囊藻的控制成为水华治
理研究的重要课题。
化感作用是一种生物通过释放到环境中的化学物质，对
它种生物产生直接的或间接的抑制或促进作用，近年来已经
成为控制藻类水华的方法之一［5］。化感物质是生物产生的
次生代谢物质，通常在自然环境中易于降解，不会带来潜在
的持久性生态危害，因此，具有较好的应用前景［6］。近年来，
控制有害藻类的活性物质的种类和来源范围正在不断增多
和扩大。相关研究表明，植物秸秆根茎中的化感物质能够抑
制水华蓝藻的生长［7］;Ikawa 等报道了 C14 ～ C18脂肪酸能抑
制绿藻 Chlorella pyrenoidosa的生长［8］;浮叶植物荇菜(Nym-
phoides peltatum)能分泌活性物质，抑制铜绿微囊藻生长［6］;
龙须菜的化感物质能破坏锥状斯氏藻的亚显微结构［9］;鼠尾
藻和鸭毛藻的水提液对三角褐指藻的生长具有抑制作
用［10］。笔者前期研究也发现，3种陆生植物广玉兰、龙爪槐、
黄杨的提取物能有效抑制铜绿微囊藻的生长［11］。龙爪槐叶
片的无水乙醇浸提物经正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水依次
分配后，正己烷相提取物具有显著抑制铜绿微囊藻生长的效
果。在 25和 50 mg /L正己烷相组分作用下，铜绿微囊藻 7 d
的生长抑制率分别达 75%和 90%以上［12］。
在前期研究的基础上，笔者对龙爪槐正己烷相提取物进
行更进一步的研究，测试在正己烷提取物处理下，铜绿微囊
藻的叶绿素 a含量、蛋白质含量、细胞膜透性和 SOD活性，初
步分析龙爪槐提取物对铜绿微囊藻抑制作用的机理。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试龙爪槐(Sophora japonica)叶片采自扬州市
郊外。供试铜绿微囊藻(M． aeruginosa)属蓝藻门、色球藻
科、微囊藻属，购自中国科学院武汉水生生物研究所，编号
FACHB-905。
1． 2 铜绿微囊藻培养基及培养条件 铜绿微囊藻的培养采
用 BG11培养基［13］。藻种活化后，在光照培养箱内进行培
养，培养条件为温度 25 ℃，光暗比为 12 h∶ 12 h。
1． 3 龙爪槐正己烷提取物制备 称取 350 g龙爪槐叶片，置
于广口瓶中，加入无水乙醇溶液500 ml，浸提48 h，重复3次。
合并 3次浸提液，30 ℃旋转蒸发浓缩至浸提液体积不再变
化。加入 300 ml水，置于 1 000 ml 分液漏斗，加入等体积正
己烷后分层，上层为正己烷相，呈淡绿色。将正己烷相萃取
液经 30 ℃旋转蒸发仪蒸干，得到正己烷提取物。
1． 4 铜绿微囊藻生理指标测定方法 将龙爪槐正己烷提取
物溶解于二甲亚砜(DMSO) ，配制成质量浓度为 10 g /L的母
液。取对数生长期的藻液，加入正己烷提取物母液，摇匀，使
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(29):18135 － 18137 责任编辑 郑丹丹 责任校对 傅真治
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.29.015
提取物最终质量浓度为 50 mg /L，对照组中加入同体积的
DMSO，平行样作 3次。
铜绿微囊藻叶绿素 a 含量采用丙酮法测定［14］;蛋白质
含量采用考马斯亮蓝法测定［15］;SOD活性采用 Stewert 等的
方法测定［16］;细胞膜透性采用谢田等的方法测定［17］，取适量
藻体置于一定量的双蒸水中数小时，离心后在 264 nm 处测
定光密度，以 OD264 nm /［g /(FW)·h］表示。
2 结果与分析
2． 1 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻叶绿素 a含量的影
响 正己烷提取物对叶绿素 a 含量有明显的抑制作用(图
1)。对照组叶绿素 a含量上升趋势明显，从试验开始的 250
mg /L增加到第 7天的 502 mg /L，在整个试验过程中，浓度增
加了 1倍。而处理组叶绿素 a含量则表现为持续下降，在第
7天时降到最低值，仅为 38 mg /L，浓度不足对照组的 1 /10。
图 1 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻叶绿素 a含量的影响
Fig． 1 Influence of Sophora japonica n-hexane extract to chloro-
phyll-a content of Microcystis aeruginosa
2． 2 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻蛋白质含量的影
响 铜绿微囊藻蛋白质含量明显受到龙爪槐正己烷提取物
的抑制(图 2)。对照组蛋白质含量在整个试验过程中比较
平稳，维持在 11． 5 mg /g(FW)左右;而处理组蛋白质含量从
第 2天开始逐渐显示出受抑制状态，含量持续下降，到第 7
天时仅为 5． 7 mg /g(FW) ，约为对照的 1 /2。
图 2 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻蛋白质含量的影响
Fig． 2 Influence of Sophora japonica n-hexane extract to protein
content of Microcystis aeruginosa
2． 3 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻细胞膜透性的影
响 正己烷提取物能使铜绿微囊藻细胞膜透性大幅增加(图
3)。对照组细胞膜透性在试验过程中保持稳定;处理组细胞
膜透性不断增大，于第 4天达到峰值，是对照组的 5 倍，之后
细胞外渗率有所下降。这说明正己烷提取物对细胞膜的完
整性有强烈的破坏作用，使细胞内物质大量外渗，之后由于
细胞内物质含量减少而外渗率有所降低。
图 3 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻细胞膜透性的影响
Fig． 3 Influence of Sophora japonica n-hexane extract to cell
membrane permeability of Microcystis aeruginosa
2． 4 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻细胞 SOD活性的
影响 铜绿微囊藻 SOD 活性受正己烷提取物影响，在试验
前期表现为促进作用，后期表现为抑制作用(图 4)。对照组
SOD活性保持平稳，略有波动;而处理组 SOD活性受到提取
物刺激，活性上升，至第 4 天达到峰值，之后又急剧下降。
SOD是细胞中的保护性酶，是生物体内清除自由基的首要物
质。SOD活性发生应激性上升，对细胞起保护作用。试验后
期，SOD活性下降，则表明细胞已经受到实质性伤害。
图 4 龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻 SOD活性的影响
Fig． 4 Influence of Sophora japonica n-hexane extract to SOD
activity of Microcystis aeruginosa
3 结论与讨论
浮游植物依靠光合作用生长，而叶绿素 a是藻类光反应
系统(PS I 和 PS II)的主要光合色素，位于反应中心的叶绿
素分子把光能转化为化学能。因此可以将叶绿素 a 含量作
为衡量其光合作用潜力的指标［6］。龙爪槐正己烷提取物使
铜绿微囊藻叶绿素 a含量大幅度降低，这意味着藻的光合作
用能力受到严重影响。叶绿素含量的降低，可能是正己烷提
取物抑制了叶绿素的合成过程，也可能是加速了叶绿素的分
解过程［18］。叶绿素受到破坏，说明光反应系统是化感活性
物质在微囊藻细胞内的重要作用位点，影响藻细胞光合系统
的结构或功能，是抑制藻类生长的机理之一［19 －20］。
蛋白质是重要的生物大分子，它不仅是构成生物体的结
构成分，还是细胞内新陈代谢反应的催化剂———酶。藻细胞
中含有多种蛋白质，包括参与代谢的各种酶、光合系统蛋白
以及藻胆蛋白等［19］。在受到环境胁迫时，细胞可能会合成
63181 安徽农业科学 2011 年
逆境蛋白用以对抗环境，但是该研究中，龙爪槐正己烷提取
物使铜绿微囊藻蛋白质含量持续降低，则意味着细胞的结构
受到不可逆破坏，蛋白质积累减少甚至停止，同时参与各种
生理活动的酶被大量分解或合成受到抑制。这些变化将导
致细胞代谢功能低下或紊乱，直至细胞死亡。此外，在藻类
细胞中，叶绿素 a 主要与蛋白质结合，存在于叶绿体类囊体
膜上。这类光合系统蛋白质的减少，加之光合色素含量的大
量降低，必将造成细胞的光合作用能力大幅度下降。
细胞膜是控制细胞和外界环境物质交换的屏障和通道，
也是多种酶促反应的场所。细胞原生质膜的稳定性为物质
运转、能量交换和信息传递等一系列功能的实现，以及维持
细胞内外离子的浓度差和物质的主动运输起着重要作
用［21］。正己烷提取物破坏了膜的完整性，表现为非电解质
大量外渗，这种对细胞内膜系统的破坏作用，是化感物质对
藻类抑制作用的重要方式之一［9，22］。
胁迫条件下，生物体产生活性氧自由基是一个普遍现
象，在正常情况下，生物体会通过抗氧化酶的联合作用对其
进行清除，以减轻机体损伤［23］。SOD 就是一种以自由基为
底物的抗氧化关键酶，其作用是将超氧阴离子催化为 H2O2，
之后再由 CAT将 H2O2 催化为 H2O和 O2。当生物体受到轻
度逆境胁迫时，SOD 活性会应激性升高，增强对活性氧的清
除能力;当受到重度环境胁迫时，细胞抗氧化系统的平衡遭
到破坏，SOD活性会受到抑制，使体内活性氧积累，引起机体
损伤［24］。龙爪槐正己烷提取物对铜绿微囊藻处理早期，SOD
活性诱发性上升，但随着处理时间的延长，细胞产生过量的
活性氧，超过细胞抗氧化系统的能力阈值，则 SOD活性转而
受到抑制，细胞发生严重损伤。这种 SOD 活性的变化规律
同宋超等发现的 SOD 活性的阶段性和时间性变化相
一致［25］。
龙爪槐正己烷提取物是多种低极性组分的混合物，其对
铜绿微囊藻的抑制作用具有多个作用位点，说明这种抑制作
用极有可能是多种不同物质共同作用的结果。
综上可知，龙爪槐正己烷提取物抑制铜绿微囊藻的可能
机理是:破坏细胞膜，使膜通透性增大;破坏光合反应系统，
造成光合色素和蛋白质含量减少;SOD 活性发生阶段式变
化。龙爪槐正己烷提取物中化感物质的种类和结构，及其分
离纯化和结构鉴定还有待进一步研究。
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