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不同产地大血藤药材指纹图谱研究及红景天苷和绿原酸的含量测定



全 文 :不同产地大血藤药材指纹图谱研究
及红景天苷和绿原酸的含量测定
李宛蓉1,桂双英1,2,3,王举涛1,陶曜天1,施伶俐1
(1.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012;2.安徽省中药制剂工程技术研究中心,
安徽 合肥 230012;3.安徽省“115”新安医药研究与开发创新团队,安徽 合肥 230012)
[摘要]目的 建立不同产地大血藤药材的高效液相色谱指纹图谱,同时测定红景天苷和绿原酸2种成分的含
量。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为Phenomenex-C18(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈-0.05%磷酸水
溶液为流动相进行梯度洗脱;检测波长:280nm;流速:1.0mL/min;进样量:15μL;柱温:30℃。结果 10个产
地的大血藤药材指纹图谱相似度达0.9以上,共标定14个共有峰,可确认红景天苷和绿原酸两个峰。红景
天苷和绿原酸含量在不同产地大血藤中差异很大,以安徽产大血藤药材中含量为最高。结论 所建立的高效
液相色谱指纹图谱测定方法准确可靠,重现性好,可作为大血藤药材的鉴别和内在质量评价的依据。
[关键词]大血藤;指纹图谱;红景天苷;绿原酸;高效液相色谱法
[中图分类号]R284.1 [文献标志码]A [DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.025
  大血藤又名红藤、血藤,为木通科植物大血藤
Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.Et Wils的干
燥藤茎,归大肠、肝经,具有清热解毒、活血、袪风止
痛之功效[1]。大血藤作为一种传统中药,为第三纪
古热带植物区系的孑遗植物,目前主要分布在江西、
湖北、四川、云南、安徽等地。大血藤中主要含有蒽
醌类、黄酮类、酚类、挥发油类化合物等[2-4]。现代药
理研究表明,大血藤具有抗炎、抗癌、止痛、抗辐射、
抗菌及心血管系统活性等作用[5-7]。临床多以其复
方用于治疗慢性盆腔炎、肠痈腹痛、风湿痹痛、跌打
扑痛、阑尾炎等[8]。目前,《中华人民共和国药典》尚
无大血藤成分含量测定的记载。因此,对大血藤药
材进行鉴别与测定,进一步完善大血藤药材质量控
制方法尤为重要。中药指纹图谱能比较全面地反映
中药所含化学成分,本研究采用高效液相色谱法,以
红景天苷、绿原酸为指标性成分,对不同产地大血藤
药材进行指纹图谱研究,并对其成分进行含量测定,
以期为大血藤药材质量评价及其进一步开发利用提
供参考依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器与试剂 Agilent 1260高效液相色谱仪:
包括在线真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱
温箱、DAD检测器;万分之一分析天平:梅特勒-托
基金项目:安徽省科技攻关项目(12010402094);安徽省高等
学校省级自然科学研究项目(KJ2013Z181);康缘中医
药科技创新基金项目(KYCX201004)
作者简介:李宛容(1990-),女,硕士研究生
通信作者:桂双英,guishy0520@126.com
利多仪器上海有限公司;KQ2200型超声波清洗器:
江苏省昆山市仪器有限公司。乙腈、甲醇均为色谱
纯;水为超纯水,使用前经0.45μm滤膜滤过;其他
试剂均为分析纯。
1.2 对照品与样品 红景天苷:成都曼斯特生物科
技有限公司,批号 MUST-12102401;绿原酸:中国
食品药品检定研究院,批号110753-200413;不同产
地大血藤药材样品来源见表1。
表1 大血藤药材来源
样品
编号
药材
产地
采购
时间
样品
编号
药材
产地
采购
时间
S1 江西 2012年10月 S6 云南 2012年11月
S2 湖北 2012年10月 S7 安徽 2012年9月
S3 广西 2012年10月 S8 安徽 2012年9月
S4 湖北 2012年10月 S9 安徽 2012年9月
S5 四川 2012年11月 S10 安徽 2012年9月
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Phenomenex-C18色谱柱(250mm×
4.6mm,5μm);流动相为乙睛-0.05%磷酸水,梯度
洗脱条件见表2;流速:1.0mL/min;检测波长:280
nm;进样量:15μL;柱温:30℃。
表2 流动相梯度洗脱
时间/
min
乙腈/

0.05%磷酸
水溶液/%
时间/
min
乙腈/

0.05%磷酸
水溶液/%
0  5  95  97  21  79
10  7  93  104  23  77
46  10  90  110  25  75
70  16  84  120  25  75
81  17  83
2.2 对照品溶液的制备 分别精确称取红景天苷
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对照品、绿原酸对照品适量,加甲醇配成含红景天苷
和绿原酸分别为0.160、0.189mg/mL的混合对照
品溶液,备用。
2.3 供试品溶液的制备 称取样品粉末(过60目
筛)0.5g,精密称定,置50mL具塞三角烧瓶中,精
密加入25mL甲醇,超声30min,冷却过滤,补质
量,取续滤液20mL至50mL容量瓶中,定容,制得
供试品溶液。
2.4 指纹图谱研究
2.4.1 精密度试验:取S1号大血藤样品,精密称
定,按照“2.2”项下方法操作,连续进样6次,测得共
有峰面积的RSD为2.01%,说明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性试验:取S1号大血藤样品,精密称
定,按照“2.2”项下样品制备方法操作,分别在0、3、
6、9、12h进样,测得各共有峰相对峰面积的RSD为
2.47%,表明样品在12h内稳定。
2.4.3 重复性试验:精密称取S1号大血藤样品6
份,按照“2.2”项下样品制备方法操作,分别测得各
共有峰面积的RSD为2.19%,表明该方法重复性
良好。
2.4.4 大血藤共有指纹峰的建立:获得10批不同
产地大血藤样品的高效液相色谱图,采用国家药典
委员会开发的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》
2004A版相似度软件进行处理,得到10批大血藤样
品的高效液相色谱指纹图谱的叠加图(见图1)。以
S1为参照图谱,经过多点校正,自动匹配,以平均数
法,生成对照图谱 R,由匹配数据的输出结果得到
共有峰14个。经过与对照品的紫外图谱及保留时
间的比较,确认6号峰为红景天苷,7号峰为绿原
酸。由于6号峰峰面积适中,且分离度与峰形较好,
因此选作参照色谱峰。设其保留时间和峰面积分别
为1,其他各共有峰的保留时间和峰面积分别与参
照峰的保留时间和峰面积相比,计算各样品指纹图
谱中共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结果分
别见表3、表4,并且建立大血藤的高效液相色谱指
纹图谱共有模式,结果见图2。
图1 10批不同产地大血藤药材的高效液相色谱叠加图
图2 不同产地大血藤的高效液相色谱指纹图谱共有模式
表3 不同产地大血藤药材指纹图谱各共有峰的相对保留时间
峰号
相对保留时间
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1  0.145 1  0.144 6  0.144 9  0.145 1  0.146 7  0.146 3  0.145 9  0.147 1  0.145 9  0.144 1
2  0.605 5  0.605 6  0.604 8  0.605 5  0.605 6  0.604 5  0.606 0  0.605 9  0.606 1  0.604 6
3  0.667 0  0.666 4  0.667 1  0.668 8  0.667 1  0.666 3  0.666 8  0.667 4  0.666 8  0.666 7
4  0.790 1  0.790 9  0.789 2  0.790 1  0.790 1  0.787 4  0.791 0  0.790 4  0.791 1  0.789 8
5  0.892 1  0.892 1  0.891 0  0.895 3  0.892 1  0.891 5  0.893 4  0.892 5  0.893 5  0.892 8
6  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0
7  1.581 2  1.581 1  1.581 5  1.586 8  1.581 1  1.579 8  1.581 3  1.580 9  1.581 3  1.580 8
8  1.785 2  1.785 6  1.783 0  1.785 2  1.785 1  1.786 1  1.780 0  1.786 1  1.787 3  1.793 0
9  2.156 3  2.153 3  2.157 1  2.161 0  2.156 3  2.149 0  2.154 5  2.157 9  2.154 5  2.156 5
10  2.496 0  2.490 4  2.493 0  2.496 0  2.492 1  2.492 5  2.479 1  2.498 1  2.489 9  2.495 1
11  3.074 5  3.066 0  3.073 5  3.077 1  3.072 4  3.064 2  3.061 2  3.078 9  3.061 1  3.071 5
12  3.301 9  3.291 9  3.301 0  3.303 8  3.301 9  3.290 8  3.286 0  3.306 4  3.285 7  3.298 1
13  3.381 9  3.372 3  3.377 8  3.384 6  3.381 9  3.370 5  3.365 1  3.387 2  3.365 1  3.374 1
14  5.352 7  5.336 2  5.346 3  5.355 3  5.352 7  5.342 0  5.316 3  5.359 7  5.323 1  5.344 0
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表4 不同产地大血藤药材指纹图谱各共有峰的相对峰面积
峰号
相对峰面积
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1  0.195 3  0.205 8  0.209 7  0.197 3  0.290 9  0.267 5  0.376 8  0.160 8  0.394 5  0.656 6
2  0.305 1  0.425 4  0.334 7  0.312 2  0.458 7  1.068 4  0.574 9  0.253 6  0.469 7  0.682 4
3  2.764 5  1.927 7  2.768 6  2.775 1  4.073 3  5.461 4  3.419 3  1.712 9  4.926 5  5.912 7
4  0.126 2  0.234 3  0.133 9  0.127 7  0.147 7  0.501 5  0.437 6  0.117 5  0.257 9  0.490 8
5  0.232 9  0.165 3  0.260 8  0.242 3  0.310 3  0.375 0  0.121 2  0.166 6  0.172 9  0.328 5
6  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0  1.000 0
7  3.949 9  2.383 4  4.516 1  3.928 8  5.920 7  12.261 0  4.949 8  4.006 1  8.255 1  19.079 0
8  0.226 3  0.269 9  0.284 7  0.233 6  0.282 4  0.669 0  0.202 1  0.161 2  0.321 8  2.311 8
9  0.936 5  0.800 8  0.982 6  0.973 5  1.279 2  3.116 4  1.226 4  0.762 6  1.495 1  3.207 2
10  0.735 1  0.628 6  0.839 8  0.767 9  1.233 4  2.198 5  1.315 5  0.508 3  1.619 9  2.447 7
11  0.522 5  0.427 2  0.536 1  0.532 9  0.697 5  1.840 5  0.709 0  0.447 7  0.865 5  2.039 3
12  0.409 0  0.337 5  0.402 3  0.416 5  0.506 2  1.595 9  0.130 5  0.336 3  0.664 3  1.827 1
13  0.197 1  0.164 2  0.191 2  0.205 8  0.244 4  0.696 5  0.220 0  0.159 4  0.272 0  1.228 0
14  0.154 3  0.104 1  0.184 6  0.153 5  0.232 7  0.501 1  0.312 4  0.097 5  0.454 5  0.664 1
2.4.5 不同产地大血藤药材的相似度比较:将10
批不同产地大血藤样品的色谱数据导入《中药色谱指
纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件,考察
色谱峰相似度的一致性,进行相似度的评价。结果
10批不同产地大血藤样品图谱相对于对照指纹图谱
的相似度分别为0.989、0.959、0.994、0.991、0.987、
0.990、0.987、0.986、0.996、0.969。
2.4.6 指纹图谱相似度评价:对10批样品的指纹
图谱分析结果表明,产地不同的大血藤高效液相色
谱指纹图谱各共有峰相似度很高,相似度范围为
0.959~0.996。表4表明,10批样品的色谱图中,
峰面积最大的色谱峰均为7号峰绿原酸,其次为3
号峰。而S10、S6、S9的绿原酸相对峰面积分别达
到19.079、12.261、8.255,是其他各批次绿原酸均
值(4.236 4)的4.5倍,2.89倍和1.95倍。同时
S6、S9、S10三批样品的各峰相对峰面积明显高于其
他批次。结果表明,10批不同产地大血藤的化学成
分相似,但各化学成分含量有一定的差异。
2.5 含量测定
2.5.1 系统适用性试验:按“2.1”项下色谱条件进
行检测,以红景天苷峰计算理论塔板数大于3 000,
分离度大于1.5。对照品溶液及供试品溶液的色谱
图见图3。
图3 对照品溶液(A)与供试品溶液(B)的高效液相色谱图(1.红景天苷;2.绿原酸)
2.5.2 线性关系考察:分别精密吸取上述混合对照
品溶液1、2、5、8、12、15μL注入液相色谱仪,记录峰
面积,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标进行线性
回归,得到红景天苷回归方程y=612.51x+35.61,
r=0.999 2,绿原酸回归方程y=1 556.2x,r=0.999 1。
红景天苷、绿原酸进样量分别在0.160~2.400、0.189~
2.835μg时与峰面积的线性关系良好。
2.5.3 精密度试验:精密吸取S1大血藤供试品溶
液15μL,重复进样6次,记录峰面积,结果表明,红
景天苷和绿原酸峰面积的 RSD 分别为1.9%、
2.2%。
2.5.4 重复性试验:精密称取S1号大血藤样品6
份,按照“2.2”项下样品制备方法制样,各取15μL
进样,结果红景天苷与绿原酸含量的 RSD分别为
1.8%、1.9%。
2.5.5 稳定性试验:取S1号大血藤样品,精密称
定,按照“2.2”项下方法操作,分别在0、3、6、9、12h
进样,测得红景天苷与绿原酸峰面积 RSD分别为
2.5%和2.1%,表明样品在12h内稳定性良好。
2.5.6 回收率试验:精密称取已知含量的S1大血
藤样品6份,分别精密加入一定量的红景天苷与绿
原酸对照品溶液,按“2.2”项下方法制备样品溶液。
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依法测定,结果红景天苷与绿原酸的平均回收率分
别为98.4%、98.1%,RSD分别为2.3%、2.6%。
2.5.7 含量测定:分别精密吸取各批药材的供试品
溶液15μL,按“2.1”项下色谱条件进行测定,计算
红景天苷与绿原酸的含量,见表5。
表5 不同产地大血藤药材中红景天苷和绿原酸含量
样品
编号
红景天苷/

绿原酸/

样品
编号
红景天苷/

绿原酸/

S1  0.483 6  0.812 0 S6  0.092 6  0.633 8
S2  0.458 4  0.466 4 S7  0.267 8  0.597 2
S3  0.413 5  0.803 8 S8  0.772 9  1.279 7
S4  0.486 6  0.812 3 S9  0.285 1  1.052 4
S5  0.320 5  0.837 1 S10  0.100 8  1.047 8
3 讨论
3.1 超声时间的考察 对S6大血藤样品不同超声
时间的高效液相色谱图谱进行考察,发现超声15min
样品成分溶出不完全;而超声45min样品中较多低
含量成分溶出,影响高效液相色谱图谱各峰分离度;
30min样品成分溶出较完全且分离度较好。因此,本
实验样品溶解的超声时间确定为30min。
3.2 流动相的考察 流动相条件优化时试验了4
种流动相系统:甲醇-水﹑乙腈-水﹑乙腈-0.05%磷
酸水和乙腈-0.01%磷酸水,并尝试这4种流动相系
统的多种梯度洗脱程序。结果显示,以甲醇-水线性
梯度洗脱时,基线不稳,且各色谱峰分离效果不好;
采用乙腈-水、乙腈-0.01%磷酸水线性梯度洗脱时,
色谱峰分离效果不理想;而采用乙腈-0.05%磷酸水
线性梯度洗脱时,各色谱峰分离度和峰形都较好,且
分离峰数多,分离效果好。
3.3 检测波长的考察 本研究采用二极管阵列检
测器对190~400nm扫描的各波长下的色谱图进
行分析比较,结果显示280nm波长下的色谱图色
谱峰形和分离度较好,色谱信息较丰富,因此选择
280nm为检测波长。
3.4 流速的考察 本研究分别比较流速在0.8、
1.0、1.2mL/min的色谱图,结果流速为0.8、1.0
mL/min时图谱分离度较好,但0.8mL/min图谱分
析时间较长,1.2mL/min图谱分离度不佳。结果
表明,流速在1.0mL/min时分离效果较好。
4 结语
本实验建立大血藤药材的高效液相色谱指纹图
谱,并对红景天苷和绿原酸进行含量测定。结果表
明,产地不同的大血藤高效液相色谱指纹图谱各共
有峰相似度很高,但各成分含量差别很大,以S8安
徽产大血藤药材的红景天苷与绿原酸含量最高。该
方法具有很好的稳定性、重复性和可行性,为大血藤
药材的质量评价及质量控制提供了科学依据,对保
证大血藤药材及其制剂的临床疗效具有重要意义。
本课题组前期研究[9-10]建立了大血藤中红景天
苷的含量测定方法,并采用正交试验优选了大血藤的
最佳提取工艺,后期研究表明大血藤水提部位和正丁
醇萃取部位对盆腔炎有一定的治疗作用。据文
献[11-12]报道,大血藤中大黄素、β-谷甾醇和绿原酸等
均具有较强的抗菌活性。绿原酸是一种重要的生物
活性物质,具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、保肝利胆
和兴奋中枢神经系统等作用[13]。本研究标定了大血
藤指纹图谱中6号峰为红景天苷,7号峰为绿原酸,
并对其进行含量测定,14个共有峰中绿原酸含量最
高。因此,绿原酸极有可能是大血藤主要抗炎活性物
质之一。深入明确大血藤抗炎活性化合物或化合物
群,指认图谱中各指纹峰的归属并对其进行含量测
定,有针对性地对指纹图谱的研究方法进行优化,是
今后有待解决的问题。
参考文献:
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[2]田瑛,张慧娟,屠爱萍,等.中药大血藤的酚性化合物
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(收稿日期:2014-6-20)
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安徽中医药大学学报 第33卷 第6期 2014年12月 J ANHUI UNIV CHINESE MED Vol.33 No.6 Dec.2014
·综  述·
益气活血法防治脑缺血实验研究进展
伍梅梅,胡建鹏,王 键
(安徽中医药大学省部共建新安医学教育部重点实验室,安徽 合肥 230038)
[关键词]益气活血法;脑缺血;实验研究
[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.026
  脑血管疾病是中老年人的常见病,因其高发病
率、高复发率、高致残率、高病死率的特点,成为目前
疾病三大死亡原因之一。本病以脑卒中为主,尤以
缺血性脑卒中最为多见,且近年来呈上升趋势。缺
血性脑卒中,以突然昏仆、不省人事、半身不遂、口眼
歪斜、语言不利为主症,属于中医学“中风”范畴。气
虚血瘀是缺血性中风主要病机特点,治宜益气活血
法。益气以改善气虚状态,活血以畅通气血渗灌。
近年来,随着对缺血性中风实验与临床研究的不断
深入,中医药治疗缺血性中风的临床疗效不断提高。
现将近年来益气活血法防治缺血性中风实验研究相
关文献综述如下。
基金项目:国家科技支撑计划项目(2012BAI26B01);国家自然
科学基金项目(30973692);安徽省科技专项资金(13Z04013)
作者简介:伍梅梅(1984-),女,硕士研究生
通信作者:王键,wangjian6301@163.com
1 改善局部脑血流量、缺血脑组织含水量及能量代谢
脑是人体重要的生命器官,需血液循环源源不
断地供应血液,一旦血液供应发生障碍,就会引起
脑形态、代谢和功能异常。王键等[1]研究发现,具有
益气活血功效的脑络欣通(药物组成为黄芪、川芎、当
归、蜈蚣等)能缩短脑缺血再灌注大鼠各时间点逃避
潜伏期,增加120s内通过原平台次数(P<0.01),增
加再灌注第7天和第14天局部脑血流量(P<0.01),
认为脑络欣通能通过增加模型大鼠局部脑血流量,提
高学习记忆能力。卢永康等[2]研究发现,补阳还五
汤(药物组成为黄芪、川芎、地龙等)能升高中风
后遗症气虚血瘀大鼠血糖、肌酸激酶,降低乳酸、
乳酸脱氢酶,认为补阳还五汤能有效纠正中风后遗
症气虚血瘀大鼠能量代谢障碍。高红莉等[3]观察发
现黄芪注射液配伍丹参注射液能降低神经缺损功能
评分,减小脑梗死范围,同时能增加脑组织血管内皮
细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,
Study on Fingerprint of Sargentodoxa cuneata from Different Habitats and De-
termination of Salidroside and Chlorogenic Acid as Two Components
LI Wan-rong1,GUI Shuang-ying1,2,3,WANG Ju-tao1,TAO Yao-tian1,SHI Ling-li1
(1.School of Pharmacy,Anhui University of Chinese Medicine,Anhui Hefei 230012,China;2.Anhui En-
gineering Research Center for Chinese Medicine Preparation,Anhui Hefei 230012,China;3.Anhui115
Xinan Traditional Chinese Medicine Research &Development Innovation Team,Anhui Hefei 230012,China)
[Abstract]Objective To establish the high-performance liquid chromatography(HPLC)fingerprint of Sargentodoxa
cuneatafrom diferent habitats and to determine the content of salidroside and chlorogenic acid as two components in
Sargentodoxa cuneata.Methods HPLC was performed on a Phenomenex-C18column(250mm×4.6mm,5μm)
with a mobile phase of acetonitrile-0.05%phosphoric acid for gradient elution at a detection wavelength of 280nm,a
flow rate of 1.0mL/min,a sample size of 15μL,and a column temperature of 30℃.Results Sargentodoxa cuneata
from 10habitats had a fingerprint similarity above 0.9;there were 14common peaks,and the peaks of salidroside and
chlorogenic acid were identified.The content of salidroside and chlorogenic acid varied significantly between Sargento-
doxa cuneatafrom diferent habitats,highest in Sargentodoxa cuneatafrom Anhui Province.Conclusion The estab-
lished HPLC fingerprint is accurate,reliable,and reproducible and can be used as a basis for the identification and in-
herent quality evaluation of Sargentodoxa cuneata.
[Key words]Sargentodoxa cuneata;fingerprint;salidroside;chlorogenic acid;high-performance liquid
chromatography
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