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中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
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DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2016． 09． 053
望江南蒽醌类成分的提取及抗肝癌活性研究
曾斐1，李晓飞1，黄玉珊2，周青2，梁生林2，宋晓琴2，肖游章2
(1．吉安市中心人民医院，江西 吉安 343000;2．井冈山大学附属医院，江西 吉安 343000)
摘 要:目的:研究望江南蒽醌类成分的提取工艺及抗肝癌活性。方法:以植物望江南为研究对象，设计了望
江南蒽醌类成分的提取工艺，并采用 CCK － 8 法观察了望江南蒽醌类各化合物体外对肝癌细胞(HepG2)的可能
作用。Hoechst 33258 染色实验观察了胡萝卜苷、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸对 HepG2 细胞凋亡的影响。结果:
本文的提取工艺对望江南种子进行提取，结果分离并鉴定了 7 个化合物，分别为:β －谷甾醇(1)、胡萝卜苷(2)、
大黄素甲醚吡喃葡糖苷(3)、大黄素甲醚(4)、芦荟大黄素 (5)、大黄酚(6)、大黄酸(7)。其中，化合物 1、2、3、5、7
为首次从望江南中分离得到。胡萝卜苷、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸等望江南中蒽醌类化合物均对
肝癌 HepG2 的具有抑制作用。不同望江南蒽醌类化合物对 HepG2 细胞的抑制率是不同的。大黄酸药物干预组
HepG2 细胞凋亡比较明显，部分细胞核浓染呈亮蓝色，出现凋亡小体。结论:望江南可能具有良好的体外抗肝癌
作用，作为天然抗肿瘤植物，具有很好的发展前景和开发利用价值。
关键词:望江南;蒽醌类;化合物;提取工艺;肝癌;CCK － 8 法;Hoechst 33258 染色
中图分类号:Ｒ273;Ｒ284． 2 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2016)09-2231-06
Extraction of Anthraquinones in Cassia occidentalisL． and Its Intervention Activity of Liver Cancer
ZENG Fei1，LI Xiaofei1，HUANG Yushan2，ZHOU Qing2，LIANG Shenglin2，SONG Xiaoqin2，XIAO Youzhang2
收稿日期:2016 － 04 － 29
基金项目:江西省科技支撑计划项目(20133BBG70086) ;江西省自然科学基金项目(20122BAB205077)
作者简介:曾斐(1987 －) ，女，江西赣州人，医师，学士，研究方向:磁共振。
通讯作者:肖游章(1967 －) ，男，江西吉水人，教授，硕士，研究方向:肿瘤学。E-mail:xiaoyz@ jgsu． edu． cn。
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(1． Ji＇an People＇s Hospital，Ji＇an 343000，Jiangxi，China;
2． The Affiliated Hospital of Jinggangshan University，Ji＇an 343000，Jiangxi，China)
Abstract:Objective:To study of extraction of anthraquinones in Cassia occidentalis L． and its intervention activity of
liver cancer． Methods:The Cassia occidentalis L． Was as the object of study． We designed the extraction process of ex-
tracting anthraquinone components in Cassia occidentalis L． We observed Cassia occidentalis L． anthraquinone com-
pounds in vitro activity in hepatoma cells (HepG2)by the method of CCK － 8． Hoechst 33258 staining experiments were
made to observe the effects of carrot，aloe emodin，rhubarb and rhubarb on the apoptosis of HepG2 cells． Ｒesults:The ex-
traction process of Cassia occidentalis L． seeds were extracted，separated and 7 compounds were identified，respectively:
β － sitosterol (1) ，daucosterol (2) ，physcion glucopyranoside (3) ，emodin(4) ，aloe emodin(5) ，chrysophanol (6) ，
Ｒhein (7)． Among them，compounds 1，2，3，5 and 7 were first obtained from Cassia occidentalis L． Daucosterol，emod-
in，aloe emodin，chrysophanol and rhein from Cassia occidentalis L． have inhibitory effect on liver cancer HepG2． The in-
hibiting rate of different Cassia occidentalis L． anthraquinone compounds is different when intervening HepG2 cells． The
apoptosis of HepG2 cells in the intervention group was more obvious and some cell nucleus were bright blue and the apop-
totic bodies were found． Conclusion:Cassia occidentalis L． may have good in vitro anti － tumor effect and as a natural anti
－ tumor plant it has a very good prospects for development and utilization value．
Key words:Cassia occidentalis L．;anthraquinone;compounds;extraction technology;hepatocellular carcinoma;CCK
－ 8 method
豆科决明属植物望江南 Cassia occidentalis L．，别名羊
角豆、山绿豆、假决明、狗屎豆、假槐花，以种子和茎、叶入
药，收录于《全国中草药汇编》。10 月左右采收成熟果实，
脱粒除去杂质，晒干。茎、叶鲜用或夏季采收，晒干。其性
凉味甘苦［1］，归肺、肝、胃经［2］，具有清热解毒、润肠通便、
清肝明目、败毒抗癌的功效。其中，利用蒽醌类物质开发肝
癌等恶性肿瘤的治疗药物是目前国内外十分关注的问题。
但是，至今尚无适宜的生产工艺从植物望江南中提取高含
量蒽醌类化合物的研究报道，也未见望江南蒽醌类化合物
治疗肝癌的系统研究报道。本实验以植物望江南为主要研
究对象，设计优化出了望江南蒽醌类成分的最佳提取工艺，
并采用 CCK － 8 法观察了望江南蒽醌类各化合物体外对肝
癌细胞(HepG2)的可能作用。研究结果以期为植物望江南
的充分利用提供参考依据。
1 材料
大孔吸附树脂 DM － 301 型购自天津海光化工有限公
司(批号:130603) ;大孔吸附树脂 DM － 130 型购自天津海
光化工有限公司(批号:100428) ;大孔吸附树脂 S － 8 型购
自天津海光化工有限公司(批号:120401) ;大孔吸附树脂
DM －101 型购自天津海光化工有限公司(批号:120520) ;
甲醇(分析纯 AＲ)购自成都市科龙化工试剂公司(批号:
20130607) ;氨水(分析纯 AＲ)购自成都市科龙化工试剂公
司(批号:20130619) ;氢氧化钠(分析纯 AＲ)购自杭州萧山
化工试剂公司(批号:20130714) ;乙酸镁，四水(分析纯
AＲ)购自国药集团化学试剂有限公司(批号:20130829) ;乙
醚(分析纯 AＲ)购自杭州化学试剂有限公司(批号:
20120425) ;1． 8 －二羟基蒽醌购自中国药品生物制品检定
所(批号:0829 － 9702) ;双光束紫外可见光分光光度计 TU
－ 1900 型购自北京普析通用仪器有限责任公司;旋转蒸发
仪 EV311 型购自 LabTech;电子分析天平 XS205DU 型购自
梅特勒 －托利多公司;数显恒温水浴锅 HH －4 型购自常州
普天仪器有限公司。
2 实验方法与操作步骤
2． 1 提取工艺
望江南种子 1 kg 粉碎后，先用石油醚提取脱脂，再用
95%乙醇提取 3 次，回收乙醇至无味，上 D101 大孔树脂
(天津欧瑞生物科技有限公司) ，先用水冲洗至无色，再用
95%乙醇进行洗脱，回收乙醇，浓缩干燥制得到总蒽醌
59. 2 g。将经过 D101 树脂处理的样品，分别用硅胶(200 ～
300目)柱层析(氯仿 －甲醇梯度洗脱系统)和 Sephadex LH
－ 20 柱层析(Pharmacia Biotech) (氯仿 －甲醇 1 ∶ 1 )分离
得化合物 1(43 mg) ，2(15 mg) ，3(21 mg) ，4(17 mg) ，5
(35 mg) ，6(26 mg) ，7(32 mg) ，分离流程见图 1。
图 1 望江南种子化学成分分离流程图
2． 2 溶液的配制
2． 2． 1 NaOH － NH4OH 混碱溶液的配制 配方:配置 2%
NH4OH ∶氨水 8． 73 mL，蒸馏水 91． 27 mL，置于 100 mL 容
量瓶中混匀。配置 5% NaOH:称取 NaOH 5 g倒入烧杯中，
先加入少许蒸馏水溶解，搅拌，再加入蒸馏水到 100 mL。
将两种溶液混匀，备用。
2． 2． 2 0． 5%醋酸镁甲醇溶液的配制 称取醋酸镁 0． 5 g，
先加入甲醇少许，搅拌，使溶解，再加入甲醇定容到 100
mL，即得 0． 5%醋酸镁甲醇溶液，备用。
2． 2． 3 1，8 －二羟基蒽醌标准品溶液的配制 精密称取标
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准品 1，8 －二羟基蒽醌 3 mg于 25 mL容量瓶中，用乙醚溶
解并定容至刻度线，即得浓度为 0． 12 mg /mL的 1，8 －二羟
基蒽醌标准品溶液。
2． 3 最大吸收波长测定
精取移取 0、1 mL标准品溶液于 10 mL容量瓶，挥尽乙
醚。分别采用混碱溶液和醋酸镁甲醇溶液定容至刻度，摇
匀，10 min后在 200 ～ 600 nm进行光谱扫描，测定最大吸收
波长(以第一瓶为空白溶液)。
2． 4 标准曲线的制作
分别精密移取 1，8 －二羟基蒽醌标准品溶液 0． 0、0． 4、
0． 6、0． 8、1． 0、1． 2 mL 共两份，分别置于 10 mL 容量瓶中，
挥尽乙醚。分别采用混碱溶液和醋酸镁甲醇溶液定容至刻
度，配制成浓度分别为 0． 0、0． 004 8、0． 007 2、0． 009 6、
0. 012、0． 014 4 mg /mL 的两组 1，8 －二羟基蒽醌标准品溶
液。在最大吸收波长处测定吸光度，以 1，8 －二羟基蒽醌
标准品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回
归，绘制标准曲线。
2． 5 望江南中总蒽醌供试品溶液的制备
称取望江南粉末 30 g，倒入 500 mL的圆底烧瓶中，加入
300 mL 70%乙醇，混匀，置于恒温水浴锅中冷凝回流 1 h，倒
出上层液，抽滤。将抽滤剩下的滤渣倒入圆底烧瓶中，倒入
150 mL 70%的乙醇进行第 2 次回流，1 h 后将上层液倒出，
抽滤。第 3次回流过程同第 2次回流。合并 3 次抽滤液，旋
转蒸发仪回收乙醇至无醇味，溶液均分 4份，供树脂吸附用。
2． 6 大孔吸附树脂分离纯化
树脂预处理:用电子天平称取型号为 D101、S － 8、DM
－301、DM －130 的大孔树脂各 50 g，分别倒入 4 个烧杯中，
加入 95%的乙醇浸泡一段时间。将上述 4 种树脂湿法上
柱(敲打严实，确保没有气泡) ，继续以 95%乙醇洗至洗涤
液中加入 3 倍量水后无白色混浊出现，再用蒸馏水洗至无
醇味，备用。
上样吸附:将 2． 4 中的供试品溶液分别在以上 4 种型
号的树脂上进行上样吸附，控制吸附流速约为 2． 5 mL /
min，穿透吸附 3 次，待树脂饱和吸附后，静置 30 min，用蒸
馏水淋洗树脂床层，直至淋洗液澄清、透明。然后用 8 倍柱
体积(约 500 mL)70%的乙醇洗脱至无色，收集乙醇洗脱
液，旋蒸至 10 mL 左右，倒入事先称重且做好标记的平板
中，放置干燥箱中 55℃干燥至恒重，称重，备用。
2． 7 样品中总蒽醌含量测定
2． 7． 1 以混碱溶液作为显色剂 分别精密称取经 D101，S
－ 8，DM －301，DM －130 型号洗脱烘干后的样品 0． 5 mg于
10 mL容量瓶中，分别加入混碱溶液 6 mL，静置 20 min，待
充分溶解，加混碱溶液定容至刻度线，混匀，备用。以混碱
溶液作为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度，根据标
准曲线计算总蒽醌含量。
2． 7． 2 以醋酸镁甲醇溶液作为显色剂 分别精密称取经
D101，S － 8，DM － 301，DM － 130 型号洗脱烘干后的样品
0. 5 mg 于 25 mL 容量瓶中，分别加入醋酸镁甲醇溶液 6
mL，静置 20 min，待充分溶解，加醋酸镁甲醇溶液定容至刻
度线，混匀，备用。以醋酸镁甲醇溶液作为空白对照，在
最大吸收波长处测定吸光度，根据标准曲线计算总蒽醌
含量。
2． 8 细胞培养
复苏 HepG2 细胞(购于南京凯基生物科技发展有限公
司) ，用 10% FBS(Hyclone 公司) + 1 × P． S． 1640 培养基
(Gibco公司) ，37℃，5% CO2培养箱(3111 型，Thermo 公
司)孵育培养，使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，0． 25% Tryp-
sin + 0． 02% EDTA 消化细胞进行传代培养并调整细胞状
态。其余试剂均为国产分析纯。
2． 9 体外抗肝癌作用研究
CCK － 8 检测取对数生长期细胞，0． 25% Trypsin +
0. 02% EDTA消化离心，计数后，以 5 × 103 /well铺 96 孔板，
37℃，5%CO2 培养箱孵育培养。24 h 后，按药物浓度梯度
分组加药(正常组，200 μg /mL组，100 μg /mL组，30 μg /mL
组，5 μg /mL组，0． 5 μg /mL组) ，培养 48 h后使用 CCK － 8
检测细胞活力。
2． 10 Hoechst 33258 色实验
将 HepG2 细胞悬液调成 1 × 106 cells /L接种于 6 孔培
养板(Fisher Scientific公司提供) ，培养 12 h 后加药。每孔
加入药物后终体积为 2500 μL /well，培养 48h 后消化收集
细胞。将 Hoechst 33258(碧云天生物技术研究所提供)用
PBS(Gibco公司提供)配制成 10 μg /mL 染液，37℃孵育 10
min，吸除染色液，用 PBS洗涤细胞后，即可进行荧光检测。
3 实验结果的统计与分析
3． 1 最大吸收波长测定
在 200 ～ 600 nm 进行光谱扫描，测定最大吸收波长。
结果表明，以混碱作为显色剂的最大吸收波长为 520 nm，
以醋酸镁甲醇溶液作为显色剂的最大吸收波长为 512 nm。
3． 2 标准曲线的制作
3． 2． 1 以混碱溶液作为显色剂的标准曲线 分别在 520 nm
处测定 0． 004 8、0． 007 2、0． 009 6、0． 012 mg/mL，0． 014 4 mg/mL
1，8 －二羟基蒽醌标准品溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光
度为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线如图 2。
图 2 1，8 －二羟基蒽醌标准品溶液的
标准曲线(以混碱溶液作为显色剂)
3． 2． 2 以醋酸镁甲醇溶液作为显色剂的标准曲线 分别在
512 nm处测定 0． 004 8、0． 007 2、0． 009 6、0． 012、0． 014 4 mg /
mL 1，8 －二羟基蒽醌标准品溶液的吸光度，以浓度为横坐
标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线如图 3。
3． 3 样品中总蒽醌含量测定
3． 3． 1 以混碱溶液作为显色剂 经 4 种型号树脂洗脱烘
干后的样品溶液加入混碱溶液后，在 520 nm 处测定吸光
度，根据标准曲线计算总蒽醌含量、纯度和提取率，结果见
表 1。
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图 3 1，8 －二羟基蒽醌标准品溶液的标准曲线
(以醋酸镁甲醇溶液作为显色剂)
表 1 4 种型号树脂洗脱得到总蒽醌含量、
纯度、提取率表(以混碱溶液为显色剂)
树脂型号
提取物重量
(g)
吸光度
(A520nm)
总蒽醌
(mg)
纯度
(%)
提取率
(%)
S － 8 0． 10 0． 434 4 7． 09 14． 2 1． 33
D101 0． 06 0． 511 7 4． 99 16． 6 0． 8
DM －301 0． 11 0． 361 5 6． 53 11． 8 1． 47
DM －130 0． 14 0． 464 6 10． 61 15． 2 1． 87
3． 3． 2 以醋酸镁甲醇溶液作为显色剂 经 4 种型号树脂
洗脱烘干后的样品溶液加入醋酸镁甲醇溶液后，在 512nm
处测定吸光度，根据标准曲线计算总蒽醌含量、纯度和提取
率，结果见表 2。
表 2 4 种型号树脂洗脱得到总蒽醌含量、纯度、
提取率表(以醋酸镁甲醇溶液为显色剂)
树脂型号
提取物重量
(g)
吸光度
(A520nm)
总蒽醌
(mg)
纯度
(%)
提取率
(%)
S － 8 0． 10 0． 281 9 5． 16 10． 4 1． 33
D101 0． 06 0． 349 2 3． 82 12． 8 0． 8
DM －301 0． 11 0． 288 6 5． 81 10． 6 1． 47
DM －130 0． 14 0． 302 3 7． 73 11． 1 1． 87
3． 4 化合物结构式
共分离鉴定了 7 个化合物，其中 2 个为甾醇化合物，5
个为蒽醌类化合物。化合物 1 － 7 结构式见图 4。
3． 5 CCK － 8 检测加药 48 h时药物抑制率
各组 6 个重复统计数据，使正常细胞药物抑制率为
0%，用直方图反应组间细胞处理前后细胞存活率变化(以
control组为参照标注组间，P ＜ 0． 05 用* 表示，P ＜ 0． 01 用
＊＊表示)。药物抑制率 =(1 －药物组绝对 OD值 /正常细
胞组绝对 OD值)× 100%。
β －谷甾醇(β － sitosterol)实验结果见图 5。胡萝卜苷
(Daucosterol)实验结果见图 6。大黄素甲醚吡喃葡糖苷
(Emodin methyl ether pyran glucoside)实验结果见图 7。大
黄素甲醚(Physcion)实验结果见图 8。芦荟大黄素(Aloe
emodin)实验结果见图 9。大黄酚(Chrysophanol)实验结果
见图 10。大黄酸(Ｒhein)实验结果见图 11。
3． 6 Hoechst 33258 染色观察 HepG2 细胞形态学变化
HepG2 细胞经胡萝卜苷、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸
作用 48 h后:大黄酸药物干预组 HepG2 细胞凋亡比较明
显，部分细胞核浓染呈亮蓝色，出现凋亡小体。胡萝卜苷干
预组细胞凋亡不明显。芦荟大黄素和大黄酚干预组，药物
本身带荧光。对照组(未加药物干预)细胞胞质及细胞核
图 4 化合物 1 ～ 7 结构式
图 5 β －谷甾醇对 HepG2 的抑制率
图 6 胡萝卜苷对 HepG2 的抑制率
图 7 大黄素甲醚吡喃葡糖苷对 HepG2 的抑制率
呈均质浓染的蓝色，见插页ⅩⅣ图 12。
4 讨论
本文的提取工艺对望江南种子进行提取，从提取物的
氯仿部分分离并鉴定了7个化合物，分别为β － 谷甾醇
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图 8 大黄素甲醚对 HepG2 的抑制率
图 9 芦荟大黄素对 HepG2 的抑制率
图 10 大黄酚对 HepG2 的抑制率
图 11 大黄酸对 HepG2 的抑制率
(1)、胡萝卜苷(2)、大黄素甲醚吡喃葡糖苷(3)、大黄素甲
醚(4)、芦荟大黄素 (5)、大黄酚(6)、大黄酸(7)。其中，化
合物 1、2、3、5、7 为首次从望江南中分离得到。
望江南子为望江南的干燥种子［3］，其蒽醌类成分具有
致泻和通便的作用，对正常机体的胸腺和脾脏淋巴细胞的
增殖也有显著促进作用，可以增强机体免疫功能［4］，同时
其抗肿瘤的药理作用目前也开始受到专家学者的关注。文
献表明［5］，望江南种子含有大黄素、柯桠素及毒蛋白等，对
肿瘤细胞有直接破坏作用。李月玲等［6］利用 MTT 法观察
了望江南总蒽醌苷对肝癌细胞(HepS)、肺癌细胞(A549)、
小鼠肉瘤(S180)腹水型肿瘤细胞等肿瘤细胞和人正常肝
细胞(L － 02)增殖的影响，并采用实体瘤称重法测定望江
南总蒽醌苷对肝癌(HepS)实体瘤的抑制情况，结果显示，
望江南总蒽醌苷对以上肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，而
且对肝癌细胞荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显的抑制作用，并
认为其抗肿瘤作用可能与提高机体免疫力和诱导细胞凋亡
有关。
肝癌属于中医学“积聚”、“癥瘕”、“黄疸”、“臌胀”等
范畴［7］，病机以湿热瘀阻、肝失疏泄、气机郁滞等为主［8］，
恶性程度高，进展快［9］，是我国常见的恶性肿瘤之一［10］。
CCK － 8 法是测定细胞存活率［11］，观察药物对细胞体外增
殖抑制作用［12］的常用技术。本实验采用 CCK － 8 法观察
了望江南蒽醌类各化合物体外对 HepG2 细胞的可能作用。
试验结果表明，胡萝卜苷、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄
酚、大黄酸等望江南中蒽醌类化合物均对肝癌 HepG2 的具
有抑制作用。但是，不同望江南蒽醌类化合物对 HepG2 细
胞的抑制率是不同的。这说明望江南可能具有良好的体外
抗肝癌作用，作为天然抗肿瘤植物，具有很好的发展前景和
开发利用价值。Hoechst 33258 染色是实验室细胞凋亡检
测的常用技术之一［13 － 14］，可用于 HepG2 细胞凋亡形态特
征的分析［15］。本研究用 Hoechst 33258 染色实验观察了胡
萝卜苷、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸对 HepG2 细胞凋亡的
影响。结果显示，大黄酸药物干预组 HepG2 细胞凋亡比较
明显，部分细胞核浓染呈亮蓝色，出现凋亡小体;芦荟大黄
素和大黄酚干预组，药物本身带荧光，难以观察。提示大黄
酸可显著抑制细胞增殖并促使凋亡发生。
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