全 文 ：　第30卷 第3期　　　　　　　　　　　　　　　　　农 业 科 学 研 究 2009年9月
　Vol.30 No.3　　　　　　　　　　　　　Journal o f Agricultural Sciences Sep.2009
文章编号:1673-0747(2009)03-0024-04
胡卢巴 RAPD反应体系优化及应用
王掌军 , 　刘　萍
(宁夏大学 农学院 ,宁夏 银川　750021)
摘　要:以胡卢巴 DNA 为模板 , 采用随机引物 ,优化胡卢巴的 RAPD 反应体系和反应条件.结果表明 , 在 20 μL 反
应体系中 , 5 种主要因素 Taq DNA 聚合酶 、引物 、dN TPs 、模板 DNA 的最适浓度和退火温度分别是1μmol/ min , 15
μmo l/ L , 0.30 mmol/ L , 20 ng 和 34 ℃.在优化的 RAPD 反应体系条件下 , 构建 22 个胡卢巴种质的 RAPD 指纹图
谱 ,为胡卢巴遗传多样性检测和其他方面的应用提供分子标记手段.
关键词:胡卢巴;RAPD;体系优化;指纹图谱
中图分类号:S33　　　　文献标志码:A
　　胡卢巴(Trigonel la foenum-graecum)又名芸
香草 、香苜蓿 , 系豆科蝶形花亚科 1 年生草本植
物[ 1] .胡卢巴以种子入药 ,国内外不少地区均有栽培
或野生资源分布.近年来 ,对胡卢巴的化学成分 、应
用 、引种及栽培管理方面的研究不断深入 ,但还未见
分子标记在胡卢巴上应用的报道.
随机扩增多态性 DNA(random amplified po ly-
morphic DNA , RAPD)分子标记技术采用 10 个碱
基的随机引物 ,以未知序列的基因组 DNA 为模板
进行 PCR扩增 ,得到多态 DNA 片段[ 2-3] .RAPD技
术已在种质纯度鉴定[ 4] 、起源进化研究 、遗传多样性
检测[ 5-6] 、遗传连锁图谱构建[ 7] 、基因定位[ 8] 、外源
导入基因追踪[ 9] 等方面得到广泛应用.本实验以胡
卢巴为材料 ,对 RAPD 分子标记中 PCR 扩增的各
影响因子的条件进行探索 ,希望建立适合胡卢巴的
反应体系 ,利用优化的反应体系构建胡卢巴 DNA
指纹图谱.旨在开发高效 、广谱的胡卢巴种质资源遗
传多样性分析的分子标记 ,为 RAPD标记在胡卢巴
分子生物学研究领域的应用奠定基础.
1　实验
1.1　材料
供试的 22份种质均由本实验室收集 ,其材料编
号及来源如表 1所示.其中国外种质 6份;国内种质
16份 ,国内种质中宁夏当地种质 8份.
表 1　供试胡卢巴种质
编号 来源 编号 来源
1 宁夏银川 12 河南陕县
2 宁夏彭阳 13 云南昆明
3 宁夏隆德 14 内蒙古鄂托克前旗
4 宁夏同心 15 青海西宁
5 宁夏青铜峡 16 甘肃玉门
6 宁夏西吉 17 埃及
7 宁夏平罗 18 埃及
8 宁夏固原 19 中东某国
9 青海海西 20 以色列
10 河北丰宁 21 利比亚
11 内蒙古巴彦淖尔 22 尼泊尔
1.2　主要试剂与仪器设备
随机引物由北京奥科生物技术有限责任公司合
成;Taq 酶和 dN TPs 购自 TIANGEN 生化科技公
司.基因扩增仪为北京博思拜生物技术有限公司生
产的WD9402;离心机为美国 TG L-16G;紫外反射
透射仪为 UV-Ⅵ A 型;电泳仪和电泳槽购于北京六
一仪器厂;微量移液器产于德国吉尔森.
1.3　方法
1.3.1　基因组DNA的提取　采用随机区组实验 ,材
料播种于宁夏大学实验农场.苗期随机取样 30株 ,每
株取等量叶片混合 ,采用 CTAB 方法提取基因组
DNA[ 10] .
1.3.2 　RA PD 反应体系的优化 　以 08K17417
(CAGCACCCAC)为随机引物 ,胡卢巴DNA为模板 ,
收稿日期:2009-02-25
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660017)
作者简介:王掌军(1978-), 男 ,甘肃天水人 , 讲师 ,主要从事植物分子遗传育种研究.
优化 RAPD反应体系.反应体系保持其他因素一
致 ,变化单一因子 ,每选出 1个参数 ,以选出的优化
用量代替基础用量 ,从而筛选最优参数.基础反应体
系为20μL :扩增缓冲液 10×buffer , TaqDNA 聚合
酶为 1 μmol/min , 引物浓度为 20 μmol/ L , dNTPs
浓度为 0.15 mmol/ L ,模板 DNA 为 25 ng ,最后用
重蒸水补充到 20μL.
1.3.3　胡卢巴 RAPD指纹图谱的构建　利用优化
的 RAPD体系 , 用随机引物扩增胡卢巴模板 DNA ,
构建 22份胡卢巴种质的 RAPD指纹图谱.
1.3.4　RAPD扩增条件与电泳　RAPD基础扩增
条件:94 ℃120 s;94 ℃20 s ,40 ℃30 s ,72 ℃60 s ,
40个循环;72 ℃10m in;最后保存在 4 ℃中备用.扩
增条件中对退火温度设有梯度 ,选出条带清晰并在
不同模板上特异性强的对应温度.扩增产物在 1×
TBE ,电压 4 ～ 5 V/cm , 1.0%琼脂糖凝胶(含
50μg/mL溴化乙锭)中电泳 50 min ,在紫外反射投
射仪下观察并用数码照相机拍照.
2　结果与分析
2.1　RAPD反应体系的优化
2.1.1　Taq DNA聚合酶对胡卢巴 RAPD扩增反应的
影响　Taq DNA聚合酶浓度梯度设定为 0.5 ,0.75 ,1 ,
1.25和 1.5μmol/min ,结果见图 1a.20μL反应体系中 ,
Taq DNA聚合酶用量为 1和 1.25μmol/min时 ,不但扩
增产物量适中 ,主带亮度强 ,次带也非常清晰;当 Taq
DNA聚合酶用量为0.5和0.75μmol/min时 ,主 、次带与
前2个浓度相比 ,清晰度略差;当 Taq DNA 聚合酶用量
为1.5μmol/min时 ,虽然扩增产物量较足 ,主带清晰 ,但
次带不够清晰 ,并且出现弥散现象.Taq 聚合酶是 RAPD
扩增反应中非常关键的因素 ,考虑到实验效果和用量 ,最
终确定 Taq DNA聚合酶的用量为1μmol/min.
2.1.2 　引物浓度对胡卢巴 RAPD 扩增反应的影
响　在20μL反应体系中 ,引物对 RAPD扩增反应的影
响见图1 b.引物浓度为20μmol/ L时 ,没有扩增出条带
数;当引物浓度分别为 25 ,30 ,35μmol/ L 时 ,扩增条带
少且亮度很淡 ,并且暗淡的带出现了弥散现象;当引物
浓度为 15 μmol/L 时 ,扩增产物清晰 ,效果最优.故
20μL反应体系中引物浓度确定为 15μmol/ L.
2.1.3　dNTPs对胡卢巴 RAPD扩增反应的影响　由
图 1c可知 ,在设定的 dNTPs浓度范围内 ,主带亮度随
着 dNTPs浓度的增加而增强 ,当 dNTPs浓度为 0.15 ,
0.20 , 0.25 mmol/ L 时 ,扩增的条带普遍暗淡 ,次带模
糊;dNTPs浓度为 0.30 ,0.35 mmol/L 时 ,条带亮度加
强 ,次带也比较清晰.综合实验效果与试剂用量 ,最终
确定 dNTPs浓度为0.30 mmol/ L.
2.1.4　模板 DNA 对胡卢巴 RA PD扩增反应的影
响　在同一引物浓度下 ,模板 DNA 设定为 10 , 20 ,
30 ,40 , 50 ng .如图 1d所示 ,主带亮度随着模板 DNA
用量的增大而增强 ,但次带出现弥散 ,变得模糊不清.
因此 ,确定20 ng 模板为反应较为适宜的用量.
　　据此建立胡卢巴优化 RAPD反应体系(20μL):
10×buf fe r , Taq DNA 聚合酶 1 μmo l/min , 引物
浓度 15μmol / L ,dNTPs 0.30 mmol/L ,模板 DNA
20 ng.
2.2　RAPD反应条件的优化
胡卢巴 RAPD反应条件中 ,对退火温度设 34 ,
38 ,42 ℃(在以前实验中退火温度低于引物的 Tm
值时 ,未扩增出条带).由图 2a 可知 , 3 个温度下都
扩增出了条带 , 34 ℃下扩增的条带数较多 ,带型清
晰 ,特异性强 ,优于其他 2个温度下的扩增.图 2b的
重复性实验得到了一致的结果 ,实验中随机引物的
Tm 值为 34 ℃.因此 ,在 RAPD 体系中退火温度选
取引物的 Tm 值时 ,扩增效果较好.
a:1至 5分别是 0.5 , 0.75 , 1 , 1.25和 1.5 μm ol/min;b:6至 10分别是 15 , 20 , 25 , 30和 35μmol/ L;
c:11至 15分别是 0.15 , 0.20 , 0.25 , 0.30和 0.35 mm ol/ L;d:16至 20分别是 10 , 20 , 30 , 40和 50 ng;
M 从下至上分别是 100 , 250 , 500 , 750 , 1 000 , 2 000bp
图 1　PCR反应体系中主要因素的影响
25　第 3期　　　　　　　　王掌军等:胡卢巴 RAPD反应体系优化及应用
　　胡卢巴最适 RAPD 反应条件:94 ℃ 2 min;
94 ℃20 s ,34 ℃30 s ,72 ℃1 min ,40个循环;72 ℃
10 min;最后保存在 4℃.
2.3　胡卢巴 RAPD指纹图谱的构建
利用优化的 RAPD 体系 ,对 22 份胡卢巴种质
的 DNA 模板进行扩增 ,在胡卢巴上构建 RAPD 指
纹图谱 ,结果见图 3.利用优化的 RA PD反应体系 ,
对供试材料进行大量扩增 ,在优化各参数条件下 ,供
试材料均能扩增出清晰的条带 ,扩增多态性片段大
小在 250 ～ 1 000 bp 之间.重复实验结果表明 ,
RAPD标记技术具有一定稳定性 ,带型基本上都能
重复扩增出来 ,且扩增产物具有一定的多态性.
1至 3是 34 ℃, 4至 6是 38 ℃, 7至 9是 42 ℃;
M 从下至上分别是 100 , 250 , 500 , 750 , 1000 , 2 000 bp
图 2　退火温度的影响
M 从下至上依次是 100 , 250 , 500 , 750 , 1 000 , 2 000bp
图 3　随机引物 08K17417 构建胡卢巴种质纹图谱
注:1～ 22分别是表 1中各编号所对应的材料.
3　结论与讨论
RAPD 标记具有操作简单 、检测快速 、费用较
低 、灵敏度高等优点 ,但其稳定性差 ,对反应条件极
为敏感[ 11-12] .它是基于 PCR反应的直接反映 DNA
多态性的一种分子标记 ,因此 ,其稳定性在一定程度
上受影响 PCR反应的多种因素如 Taq DNA 聚合
酶 、引物 、dN TPs 、模板 DNA浓度 、退火温度等的影
响.所以建立稳定可靠的反应体系是提高 RAPD 标
记稳定性和可重复性的关键.
Taq酶浓度是 PCR反应中最重要的因子 , Taq
酶特别依赖于buffer中的 Mg2+.Mg2+是影响扩增特
异性的主要因素之一 ,Mg2+浓度高 ,易产生特异性产
物;浓度过低 ,则会使 Taq 酶失活 ,扩增不到产物或产
物量很少.模板 DNA用量 、dNTPs浓度和引物浓度
决定扩增条带的数目和亮度 , dNTPs浓度和引物浓
度对扩增特异性有很大影响.退火温度的高低对特异
性条带有很大影响.一般情况下 ,退火温度越高 ,条带
数减少 ,而条带的特异性增强.本实验在 20μL 反应
体系中 ,最适 Taq DNA 聚合酶 、引物 、dNTPs 、模板
DNA 和退火温度分别是:1μmol/min , 15 μmol/L ,
0.30 mmol/L ,20 ng和34 ℃.该研究采用优化的反应
体系 ,对相同实验重复 2次 ,均取得同样结果.因此 ,
这是一个较准的体系 ,能够满足胡卢巴 RAPD扩增.
利用建立的优化反应体系构建胡卢巴DNA的指纹图
谱 ,为开发高效 、广谱的胡卢巴种质资源遗传多样性
分析的分子标记 ,以及RAPD标记在胡卢巴分子生物
学研究领域的应用奠定基础.
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Applying and optimization of RAPD reaction system in
Trigonella f oenum-graecum
Wang Zhangj un , 　Liu P ing
(Schoo l o f Ag riculture , Ningxia Univer sity , Yinchuan 750021 , China)
Abstract:DNA from Trigonel la foenum-graecum was template , the optimal react ion of RAPD in
Trigonella f oenum-graecum was studied wi th RAPD prime r.The results show ed that the optimum
concentration o f five impo rtant components i.e.Taq DNA polymerase , primer , dNTPs , template DNA
and annealing temperature in 20 μL reaction sy stem w ere 1μmo l/min , 15 μmol/L , 0.30 mmo l/L , 20 ng
and 34 ℃ respectively .The RAPD finger-printing o f 22 Trigonel la foenum-grdecum germplasms w ere
e stablished by using optimum system , which of fered method of mo lecula r marker to g enetic diver sity
measuring and o ther application in Trigonel la foenum-graecum .
Key words:Trigonella foenum-grdecum;RAPD;sy stem optimiza tion;f ing er-printing
(责任编辑 、校对　魏　乐)
　　　　(上接第 20页)
utilization of so le carbon source , susceptibili ty o f antibiotics and dyestuff resistance and no significant
dif ferences fo r utilizat ion of so le nit rogen source for all the tested st rains.Meanwhile the isolated
rhizobium strains indicated high resistance to saline-alkali and high temperature.Through comparison
analysis of nume rical taxonomy and 16S rDNA PCR-RFLP , the tested st rains had rich phenotypic and
genet ic diversi ties.At simi lari ty level of 80%, the tested strains clustered into tw o phenotypic g roups and
the dif ferentiated features betw een tw o phenotypic g roups w ere dif ferent.In dendrog ram of numerical
tax onomy , the cluste red st rains w ere also clustered toge ther in dendrog ram o f tested rhizobium strains
based on 16S rDNA PCR-RFLP.The results by using tw o methods are basically consistent.
Key words:Ammopiptanthus mongolicus;rhizobia;phenotypic dive rsity ;polymerase chain react ion;
rest riction f ragment leng th po lymo rphism
(责任编辑 、校对　魏　乐)
27　第 3期　　　　　　　　王掌军等:胡卢巴 RAPD反应体系优化及应用