全 文 ：从而使平衡被打破所引起的，H2O2 氧化损伤作用机
制可能主要是由 SOD和过氧化氢酶的降低所致。
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收稿日期:2013－ 09－ 15 (解学魁编辑 郭薇校对)
* 基金项目:广西高校科学技术研究项目(YB2014270)
作者单位:1．桂林医学院基础医学院人体解剖学教研室，广西 桂林 541004;2．桂林医学院基础医学院研究所;3．桂林医学院基础医学院生
理学教研室;4．桂林医学院基础医学院病理生理学教研室
作者简介:张幸(1979 －)，男，广西桂林人，高级实验师，学士，研究方向:植物雌激素与肿瘤的关系。
通讯作者:辛敏，E-mail:123745733@ qq． com
数字出版日期:2015 － 2 － 15 9:57
数字出版网址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /21． 1234． Ｒ． 20150215． 0957． 003． html
·实验研究·
芒柄花黄素诱导膀胱癌细胞凋亡作用*
张幸1，梁梅花2，黄文君3，郭艳红3，卢慧玲4，辛敏3
摘 要:目的 探讨芒柄花黄素诱导膀胱癌细胞凋亡的作用及机制。方法 采用不同浓度(20、40、80 μmol /L)
芒柄花黄素处理膀胱癌细胞，采用噻唑蓝法观察芒柄花黄素对膀胱癌 T-24和 BIU-87细胞的增殖的抑制作用，使用流
式细胞术及 Hoechst 33258 染色检测 T-24 和 BIU-87 细胞凋亡率，采用 ＲT-PCＲ 检测 T-24 细胞 Bcl-2 mＲNA 表达;
western blot检测 T-24 细胞 p-p38 蛋白激酶、Bcl-2 蛋白含量变化。结果 与对照组比较，40、80 μmol /L芒柄花黄素
组 T-24 和 BIU-87 细胞增殖率下降、细胞凋亡率明显升高，Hoechst33258 染色显示 T-24 细胞呈凋亡状态;40、
80 μmol /L 芒柄花黄素组 T-24 细胞 Bcl-2 mＲNA表达水平［(0. 701 ± 0. 029)、(0. 408 ± 0. 036) ］均低于对照组，差异
均有统计学意义(P ＜ 0. 01) ;与对照组比较，20、40、80 μmol /L 芒柄花黄素组 T-24 细胞 p-p38 蛋白激酶活性水平
［(0. 483 ± 0. 026)、(0. 569 ± 0. 031)、(0. 935 ± 0. 037) ］均升高，Bcl-2 蛋白含量［(0. 998 ± 0. 034)、(0. 591 ± 0. 030)、
(0. 426 ± 0. 027) ］均降低，差异均有统计学意义(P ＜ 0. 01)。结论 芒柄花黄素可诱导膀胱癌 T-24 和 BIU-87 细胞
凋亡、抑制细胞生长，其机制可能与下调 Bcl-2 蛋白表达并活化 p38 蛋白激酶有关。
关键词:芒柄花黄素;膀胱癌细胞;凋亡;p38;Bcl-2
中图分类号:Ｒ 181. 2 + 4 文献标志码:A 文章编号:1001-0580(2015)03-0314-04 DOI:10． 11847/zgggws2015-31-03-18
Formononetin-induced apoptosis in bladder cancer cells and its mecha-
nism
ZHANG Xing* ，LIANG Mei-hua，HUANG Wen-jun，et al(* Department of Human Anatomy，College of Basic Medicine，
Guilin Medical University，Guilin，Guangxi Zhuang Autonomous Ｒegion 541004，China)
Abstract:Objective To explore the underlying mechanism responsible for formononetin-induced apoptosis of blad-
der cancer cells in vitro． Methods Human bladder cancer cells T-24 and BIU-87 were exposed to different doses of
formononetin(20，40，and 80 μmol /L)． Thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)assay was applied to determine the
effect of formononetin on proliferation of T-24 and BIU-87 cells;the apoptosis was assessed with flow cytometry and
Hoechst 33258 staining． Next，the expression level of Bcl-2 mＲNA in T-24 cells was analyzed with real-time reverse tran-
scription polymerase chain reaction(ＲT-PCＲ)． The expressions of p-p38 and Bcl-2 proteins in T-24 cells were deter-
mined with Western blot． Ｒesults Compared with the control group，the formononetin at the doses of 40 and 80 μmol /L
significantly suppressed the proliferation of T-24 and BIU-87 cells，while the apoptotic rate increased significantly． The
Hoechst 33258 staining results showed that T-24 cells exhibited typical apoptotic morphology． Compared with the control
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group，formononetin effectively reduced the expression of Bcl-2 mＲNA(0. 701 ± 0. 029 for 40 μmol /L group and 0. 408
± 0. 036 for 80 μmol /L group)in T-24 cells(all P ＜ 0. 01)． Compared with the control group，formononetin effectively
increased the expression of P38 protein(0. 483 ± 0. 026 for 20 μmol /L group and 0. 569 ± 0. 031 for 80 μmol /L group)
in T-24 cells(all P ＜ 0. 01)． Compared with the control group，formononetin effectively reduced expression of Bcl-2
protein(0. 998 ± 0. 034 for 20 μmol /L group，0. 591 ± 0. 030 for 40 μmol /L group，and 0. 426 ± 0. 027 for 80 μmol /L
group)in T-24 cells(all P ＜ 0. 01)． Conclusion Formononetin could inhibit the growth of bladder cancer cells by induc-
tion of apoptosis，which may be related to the inhibition of Bcl-2 expression and activation of P38 protein．
Key words:formononetin;bladder cancer cell;apoptosis;P38;Bcl-2
膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，
好发于 40 ～ 60 岁，发病率男性较女性高 3 倍，患者
死亡率高。与膀胱癌有关的因素可能为吸烟、放射、
化学毒物、药物。同时，生长因子、细胞因子以及激
素等生物活性物质以及这些活性物质介导的信号转
导途径发生异常，可引起某些基因的过度扩增，导致
正常细胞接受了异常的增殖、分化和生长信号，最终
促使细胞发生癌变［1 － 2］。植物来源的芒柄花黄素，
分离自红三叶草，为一种生物活性异黄酮，具有明显
的生物功能和抗肿瘤作用［3］。本研究通过观察不
同浓度芒柄花黄素作用于膀胱癌 T-24 和BIU-87细
胞株后细胞增殖、凋亡变化，T-24 细胞 p38 及 Bcl-2
蛋白表达水平变化，探讨芒柄花黄素对膀胱癌细胞
增殖和凋亡的影响及可能机制，结果报告如下。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂 膀胱癌 T-24 与 BIU-87 细胞株(上
海细胞生物研究所) ，芒柄花黄素(＞ 98. 0%)、荧光
染料 Hoechst 33258 和噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazo-
lium bromide，MTT) (美国 Sigma 公司) ，V-FITC 凋
亡检测试剂盒(上海碧云天研究所) ，1640 培养基、
胎牛血清(美国 HyClone公司)，p-p38 及 Bcl-2 兔抗
人多克隆抗体(美国 SantaCruz 公司)。
1. 2 细胞培养 使用含 10%胎牛血清和 1%青霉
素 /链霉素的 1640 培养基，将膀胱癌 T-24 与BIU-87
细胞在含 5%CO2 的 37 ℃培养箱中常规培养传代。
1. 3 指标与方法
1. 3. 1 T-24 和 BIU-87 细胞增殖活性检测 采用
MTT 法，收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，
按 5 × 103 个 /孔密度接种于 96 孔板中，每孔加入
100 μL 细胞悬液;待细胞贴壁后分别加入含芒柄花
黄素的完全培养基，每孔 100 μL，使芒柄花黄素终
浓度分别为 20、40、80 μmol /L，另设对照组(加入等
体积的完全培养基)，每组设 3 个副孔;分别培养 24、
48、72 h 后弃上清，每孔加入 20 μL MTT 溶液
(5 mg /mL)，37 ℃孵育 4 h，弃培养液，每孔加入
150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，用酶标
仪测定 490 nm处吸光度(A)值，实验独立重复 3次。
1. 3. 2 T-24与 BIU-87凋亡率检测 采用流式细胞
术，收集消化后细胞，调整细胞浓度，以 1 × 106 个 /孔
接种到 6孔板中;待细胞贴壁后，加入含芒柄花黄素
(20、40、80 μmol /L)的完全培养基，对照组(加入同
体积完全培养基)，每组设 3 个副孔，继续培养 48 h
后，收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate
buffered saline，PBS)洗涤 3 次，annexin V-FITC 及碘
化丙啶(50 μg /mL)室温避光染色15 min，用流式细
胞仪检测细胞凋亡率。
1. 3. 3 T-24 细胞凋亡形态学观察 采用 Hoechst
染色法，接种对数生长期细胞至 6 孔板，12 h 贴壁
后，每孔加入不同浓度芒柄花黄素的完全培养基，使
终浓度为 20、40、80 μmol /L，对照组加入完全培养
基，继续孵育 48 h后，吸尽培养液，先后加入固定液
和 Hoechst 33258 染色液;荧光显微镜检测，激发波
长 350 nm，观察细胞核变化。
1. 3. 4 T-24 细胞 Bcl-2 mＲNA 表达检测 采用逆
转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymer-
ase chain reaction，ＲT-PCＲ)，20、40、80 μmol /L 芒
柄花黄素处理 T-24 细胞 48 h，用 trizol提取 T-24 细
胞总 ＲNA，采用紫外分光光度计测总 ＲNA 纯度和
含量，将总 ＲNA 逆转录为 cDNA，加入目的基因引
物进行扩增，扩增产物经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳，凝
胶分析系统记录分析;以 β-actin 为内参照，计算
Bcl-2 相对表达量。
1. 3. 5 T-24 细胞 p38 及 Bcl-2 蛋白表达检测 采
用 Western blot法，20、40、80 μmol /L 芒柄花黄素处
理 T-24 细胞 48 h 后，裂解细胞，提取总蛋白，考马
斯亮兰法检测样品蛋白浓度;以 3:1 体积比与上样
缓冲液混合，取 20 μL 上样;浓缩胶电泳电压为
80 V，分离胶为 130 V，电泳 4 h 后用聚偏二氟乙烯
膜半干转，转膜 1. 5 h，然后聚偏二氟乙烯膜用含
5%脱脂奶粉的 PBS 封闭 1 h，然后加入 p-38 抗体
(抗体稀释度 1:500)或 Bcl-2 抗体(抗体稀释度
1:500)4 ℃过夜，Tris 缓冲盐溶液洗膜 10 min × 3
次，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(稀释度
1:5 000)室温反应 1 h，超敏化学发光法显色，凝胶
分析系统分析记录条带光密度，用图像分析系统分
析，以相应蛋白条带的积分光密度值表示检测蛋白
相对强度。
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1. 4 统计分析 数据以珋x ± s 表示，采用 SPSS 19. 0
软件进行统计分析，各组间比较采用单因素方差分
析与 Dunnet-t检验，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 芒柄花黄素对 T-24 与 BIU-87 细胞增殖能力
影响(表 1) 与对照组比较，芒柄花黄素处理组
(20 ～ 80 μmol /L)T-24 细胞与 BIU-87 细胞数目显
著减少，细胞增殖能力受到明显抑制(P ＜ 0. 05)，其
抑制作用呈剂量依赖性。
表 1 芒柄花黄素对 T-24 与 BIU-87 细胞增殖能力影响(A，珋x ± s，n = 3)
组别(μmol /L)
T-24
24 h 48 h 72 h
BIU-87
24 h 48 h 72 h
对照组 0． 441 ± 0． 023 0． 645 ± 0． 018 0． 852 ± 0． 019 0． 511 ± 0． 024 0． 762 ± 0． 019 0． 903 ± 0． 022
芒柄花黄素组 20 0． 369 ± 0． 025a 0． 474 ± 0． 021a 0． 637 ± 0． 031a 0． 443 ± 0． 021a 0． 573 ± 0． 025a 0． 721 ± 0． 027a
40 0． 354 ± 0． 021a 0． 407 ± 0． 029a 0． 482 ± 0． 033a 0． 382 ± 0． 016a 0． 509 ± 0． 025a 0． 557 ± 0． 023a
80 0． 328 ± 0． 027a 0． 374 ± 0． 021a 0． 362 ± 0． 024a 0． 333 ± 0． 025a 0． 414 ± 0． 021a 0． 486 ± 0． 022a
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 05。
2. 2 芒柄花黄素对 T-24 与 BIU-87 细胞凋亡率影
响(图 1、表 2) 结果显示，对照组 T-24 细胞较少出
现细胞核裂解或细胞皱缩，而芒柄花黄素处理的 T-24
细胞中可见细胞核碎裂和细胞皱缩;与对照组比较，
各剂量芒柄花黄素处理的 T-24 与 BIU-87 细胞凋亡
率均明显升高，差异均有统计学意义(P ＜ 0. 01)。
注:A:对照组;B、C、D:20、40、80 μmol /L芒柄花黄素组。
图 1 芒柄花黄素对 T-24 细胞凋亡影响(Hoechst染色，× 200)
表 2 芒柄花黄素对 T-24 与 BIU-87
细胞凋亡率影响(%，珋x ± s，n = 3)
组别(μmol /L) T-24 细胞凋亡率 BIU-87 细胞凋亡率
对照组 1． 85 ± 0． 64 2． 46 ± 1． 42
芒柄花黄素组 20 5． 21 ± 1． 12 2． 99 ± 1． 52a
40 18． 32 ± 1． 87a 15． 75 ± 2． 74a
80 29． 99 ± 2． 56a 20． 47 ± 2． 99a
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 01。
2. 3 芒柄花黄素对 T-24细胞 Bcl-2 mＲNA表达影响
ＲT-PCＲ检测结果表明，经不同浓度芒柄花黄素(0、
20、40、80 μmol /L)处理 T-24细胞 48 小时后，T-24 细
胞 Bcl-2 mＲNA 表达水平分别为(0. 873 ±0. 031)、
(0. 856 ±0. 048)、(0. 701 ± 0. 029)、(0. 408 ±0. 036);
与对照组比较，40、80 μmol /L 芒柄花黄素组 T-24 细
胞 Bcl-2 mＲNA表达水平降低，差异均有统计学意义
(P ＜0. 01)。
2. 4 芒柄花黄素对 T-24 细胞 Bcl-2、p-38 表达影
响(图 2) Western blot 结果表明，对照组、20、40、
80 μmol /L芒柄花黄素组 T-24细胞 Bcl-2与 p-p38蛋白
表达水平分别为(1. 203 ± 0. 023)、(0. 998 ± 0. 034)、
(0. 591 ± 0. 030)、(0. 426 ± 0. 027)和(0. 326 ± 0. 027)、
(0. 483 ±0. 026)、(0. 569 ± 0. 031)、(0. 935 ± 0. 037)，与
对照组比较，各芒柄花黄素组 T-24 细胞 Bcl-2 蛋白表
达水平下降，p-p38 蛋白表达水平升高，差异均有统计
学意义(P ＜0. 01)。
3 讨 论
抗凋亡是肿瘤细胞发生机制的重要环节［4］。
在癌变过程中，癌细胞失控生长会逐渐形成恶性癌，
并进一步侵入附近组织［5］。目前，临床应用的化疗
方法疗效有限，且对体内主要器官可产生毒性［6 － 7］。
近年来，人们致力于寻求抑制肿瘤发生和转移的新
天然药物［8］。芒柄花黄素是中药红三叶草的主要
活性成分。研究表明，芒柄花黄素可以防止血管生
成和癌转移，并在临床中已用于转移性结肠癌的治
疗［9］。MTT 是一种比色分析，可反映细胞增殖能
力［10］，还可用于评估药物的细胞生长抑制效应［11］。
本研究结果显示，芒柄花黄素作用 72 h，明显著抑制
膀胱癌 T-24与 BIU-87 细胞增殖能力，并可促进T-24
细胞凋亡。B 细胞淋巴瘤 2(B cell lymphana 2，
Bcl-2)是最重要的细胞凋亡调节蛋白之一，它具有
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注:1:对照组;2 ～ 4:20、40、80 μmol /L芒柄花黄素组。
图 2 芒柄花黄素对 T-24 细胞 Bcl-2、p-p38 蛋白表达影响
很强的抗凋亡特性［12］。Bcl-2 蛋白与各种癌变，包
括慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、肺癌和前列腺癌
有关［13］。本研究结果表明，经芒柄花黄素处理后，
T-24 细胞 Bcl-2 mＲNA 水平与 Bcl-2 蛋白表达呈剂
量依赖性下降，提示芒柄花黄素可能通过下调 Bcl-2
蛋白表达而诱导 T-24 细胞凋亡。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein
kinase，MAPK)是一组可被多种信号激活的丝 /苏氨
酸激酶，在细胞内经双重磷酸化活化后可调节细胞
的多种生物活性，如促进增殖分化、诱导基因转录、
抑制凋亡、调节周期等。MAPK 信号转导通路非常
保守，在细胞信号转导通路中，MAPK 处于细胞质部
分的终末位置，活化后可以转到核内，调节基因表
达。迄今为止，已发现 p38、EＲK5、EＲK 以及 JNK4
个亚族［14 － 16］。目前认为，p38 激酶通路在炎症反
应、细胞生长、细胞分化和细胞死亡诸多过程中起关
键作用［17 － 18］，p38 蛋白激酶的活化，有助于抑制细
胞增殖和癌变［19］。本研究结果显示，经芒柄花黄素
处理后，T-24 细胞 p38 蛋白激酶表达呈剂量依赖性
增高，提示，诱导 p38 蛋白激酶表达可能是芒柄花黄
素诱导 T-24 细胞凋亡的主要机制之一。
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收稿日期:2014－ 11－ 17 (解学魁编辑 郭薇校对)
·713·中国公共卫生 2015 年 3 月第 31 卷第 3 期 Chin J Public Health，Mar 2015 Vol． 31 No． 3