全 文 ：芒柄花黄素通过调节Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２蛋白表达诱导ＳＫＯＶ３细胞凋亡
顾万１　赵新阁２　张幸２△
（１．佛山市顺德区中医院妇科，广东 佛山　５２８３３３；２．桂林医学院基础医学院，广西 桂林　５４１００１）
　　摘　要　目的：研究芒柄花黄素诱导癌细胞凋亡的机制。方法：采用 ＭＴＴ法观察浓度分别为２５、５０和１００Ｕ·ｍｌ－１的芒柄
花黄素对ＳＫＯＶ３细胞的凋亡作用。采用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色法观察浓度为１００Ｕ·ｍｌ－１芒柄花黄素对细胞形态的影响。用免疫印
迹试验（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）检测浓度分别为２５、５０和１００Ｕ·ｍｌ－１芒柄花黄素作用后ＳＫＯＶ３细胞中Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２蛋白的表达情况。
结果：ＭＴＴ结果显示，芒柄花黄素对ＳＫＯＶ３细胞的增殖具有抑制作用（Ｐ＜０．０５）。经浓度为１００Ｕ·ｍｌ－１芒柄花黄素作用，Ｈｏ－
ｅｃｈｓｔ３３３４２染色，ＳＫＯＶ３细胞呈凋亡状态。免疫印迹试验结果显示，经芒柄花黄素作用，ＳＫＯＶ３细胞中Ｂｃｌ－２蛋白的表达降低
（Ｐ＜０．０５），而Ｂａｘ蛋白的表达则增加（Ｐ＜０．０５）。结论：芒柄花黄素通过调节细胞内Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２蛋白的表达诱导ＳＫＯＶ３细胞的
凋亡，并呈剂量依赖性。
关键词：芒柄花黄素；Ｂａｘ；Ｂｃｌ－２；凋亡
作者简介：顾万，女，主治医师，主要从事妇科肿瘤的研究，Ｅｍａｉｌ：
６３９４５１５２＠ｑｑ．ｃｏｍ。
△通讯作者：张幸，男，实验师，主要从事肿瘤药理的研究，Ｅｍａｉｌ：
５４９１４６０７＠ｑｑ．ｃｏｍ。
　　卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，也是引起妇
科恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一。其恶性程度高，极易在
发病早期进行多途径、多部位癌细胞转移，严重威胁患者的生
命与健康。而常规的化疗药物并没有显著提高卵巢癌患者的５
年生存率，且化疗药物耐药性令人担忧。近年来有研究表明某
些中药成分对卵巢癌细胞的增殖具有抑制作用且能诱导其凋
亡［１］。
黄芪，又名绵芪，其药用价值迄今已有２０００多年的历史，
有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广
泛的抗菌作用。本课题针对中药黄芪中的有效成分芒柄花黄
素对卵巢癌细胞凋亡作用的影响进行了体外实验，旨在研究其
对肿瘤细胞的抑制作用以及其促细胞凋亡的可能机制。
１　材料与方法
１．１　材料与试剂
芒柄花黄素（纯度＞９８％），溶解于二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），保
存于４℃环境以维持稳定性。人卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞株。ＲＰ－
ＭＩ－１６４０培养基。
１．２　细胞培养
人卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞在含１０％胎牛血清，１００Ｕ·ｍｌ－１
青霉素，１００Ｕ·ｍｌ－１链霉素的 ＲＰＭＩ－１６４０培养基中，３７℃，
５％ＣＯ２条件下培养。实验前４ｄ换用无酚红ＲＰＭＩ－１６４０培养
基（内含１０％胎牛血清ＦＢＳ溶液）继续培养。
１．３　ＭＴＴ试验
取经无酚红ＲＰＭＩ－１６４０（内含１０％胎牛血清ＦＢＳ溶液）培
养的对数生长期ＳＫＯＶ３细胞于９６孔培养板内，每孔１００Ｕ
（约含５０００个细胞），置于３７℃，５％ＣＯ２温箱中培养。次日，给
药组分别加入浓度为２５、５０、１００Ｕ·ｍｌ－１的芒柄花黄素
１００Ｕ，同时进行溶剂对照处理（０Ｕ的芒柄花黄素），每组设３
个平行孔。置于３７℃，５％ＣＯ２温箱中孵育，４８ｈ后每孔中分别
加入１０ＵＭＴＴ溶液（５ｍｇ·ｍｌ－１，即０．５％ＭＴＴ，由未加血清
的无酚红ＲＰＭＩ－１６４０培养基配制），同等条件继续培养４ｈ（结
晶可充分形成）。弃去上清液，保留Ｆｏｒｍａｚａｎ结晶，分别于每
孔中加入１５０ＵＤＭＳＯ，摇床低速震荡１０ｍｉｎ，使结晶充分溶
解。用酶标仪在检测波长４９０ｎｍ条件下测定各孔光密度值
ＯＤ，以溶剂对照处理的细胞作为对照组，用下面公式计算药物
对细胞的抑制率，并计算ＰＲ／ＩＣ５０：抑制率＝（对照组平均 ＯＤ
值－给药组平均ＯＤ值）／（对照组平均ＯＤ值）×１００％。
１．４　荧光染色法观察ＳＫＯＶ３细胞凋亡形态
收集对数期ＳＫＯＶ３细胞植入６孔培养板，分别加入等量
２０％ＦＢＳ　ＲＰＭＩ－１６４０ 培 养 基，加 药 组 加 入 高 浓 度
（１００Ｕ·ｍｌ－１）芒柄花黄素，对照组加入等量 ＰＢＳ，３７℃、
５％ＣＯ２温箱培养４８ｈ后，加入４％多聚甲醛在４℃条件下固定
细胞１０～２０ｍｉｎ。吸去固定液，加入ＰＢＳ液置于摇床上洗涤２
遍，每次３ｍｉｎ，吸尽液体后加入 Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色液（终浓度
为１０ｋｇ·Ｌ－１），３７℃染色１０ｍｉｎ。用ＰＢＳ液洗涤２遍（摇床上
进行），每次３ｍｉｎ，超净台中避光风干，以３４０ｎｍ紫外光激发
Ｈｏｅｃｈｓｔ，在荧光倒置显微镜下观察细胞核的变化并拍照。
１．５　蛋白印迹试验（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）
向实 验 组 ＳＫＯＶ３ 细 胞 中 分 别 加 入 等 体 积 ２５、５０、
１００Ｕ·ｍｌ－１浓度的芒柄花黄素２４ｈ后，收集细胞冰浴中摇动
３０ｍｉｎ进行裂解。将裂解液置于预冷的离心机中以１２０００ｒｐｍ
离心１０ｍｉｎ，上清液即为总蛋白。ＢＣＡ法测定总蛋白浓度。取
等量蛋白上样行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，并将蛋白转印到硝酸纤维膜
上，丽春红Ｓ染色１０ｍｉｎ以观察各电泳带蛋白量是否一致。用
５％（５０ｇ·Ｌ－１）脱脂牛奶ＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）缓冲液室温封
闭２ｈ，分别加入一抗β－ａｃｔｉｎ（１∶１０００）、Ｂａｘ（１∶１０００）和Ｂｃｌ－２
（１∶５００），４℃过夜。ＰＢＳ洗涤３次，每次１０ｍｉｎ。之后与二抗
于室温下孵育１ｈ，ＴＢＳ洗涤３次，每次１０ｍｉｎ。采用增强化学
发光法（ＥＣＬ）显影，并与目的蛋白条带进行比较。
１．６　统计学分析
所有实验均重复３次，实验数据均用ＳＰＳＳ１７．０软件进行
处理及统计学分析，计量资料以均数±标准差（Ｘ±ＳＤ ）表示，
在正态分布且方差齐的情况下对其行单因素方差分析，并以
Ｐ＜０．０５为有显著意义的检测标准。
２　结果
２．１　芒柄花黄素对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞抑制率的影响
ＭＴＴ结果显示，高浓度芒柄花黄素明显抑制ＳＫＯＶ３细胞
的增殖，并且ＳＫＯＶ３细胞的抑制率随芒柄花黄素浓度的增加
０６ 四川生理科学杂志２０１４；３６（２）
而增加，高、中、低浓度芒柄花黄素之间比较具有统计学意义
（Ｐ＜０．０５）。以上说明芒柄花黄素具有促进ＳＫＯＶ３细胞凋亡
的作用，并呈剂量依赖性，见图１。
Control 25 μM 50 μM 100 μM
80
70
60
50
40
30
20
10
0
抑
制
百
分
比
/%
0
*
*
*
剂量
图１　ＭＴＴ法计算所得芒柄花黄素（４８ｈ）对ＳＫＯＶ３细胞的抑制率
注：与对照组相比，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，ｎ＝５
２．２　高浓度芒柄花黄素对ＳＫＯＶ３细胞形态的影响
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色结果显示，对照组（正常细胞）细胞核形
状均匀，大小一致，较圆，表面较光滑，经染色后发出弥散均匀
柔和的淡蓝色荧光，见图２Ａ。而经１００μＭ 芒柄花黄素作用
４８ｈ后，可见到典型的细胞凋亡形态：胞核明显固缩，呈浓染的
致密的颗粒状，碎裂成大小不一，形状各异的块状物，荧光染色
后亮度不一，大部分颜色较亮，呈亮蓝色，也有一小部分颜色较
暗淡，可能和胞核溶解有关，见图２Ｂ。以上结果表明，高浓度芒
柄花黄素促进ＳＫＯＶ３细胞凋亡，与 ＭＴＴ结果一致。
A:control B:100 μM
图２　荧光显微镜下观察高浓度芒柄花黄素对ＳＫＯＶ３细胞的作用（×２００）
箭头所示为典型的凋亡细胞
２．３　芒柄花黄素对ＳＫＯＶ３细胞中Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２蛋白的影响
免疫印迹试验结果显示，随芒柄花黄素浓度由０、２５、５０、
１００Ｕ·ｍｌ－１依次增加，Ｂｃｌ－２蛋白的表达进行性降低，分别为
１．２３４、１．０２３、０．７１１和０．４２１。同时，Ｂａｘ蛋白的表达由０．５６３、
０．７３５、１．０２３和１．１７６表现为相应地增加，Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ比值分别
为２．１９２、１．３９２、０．６９５和０．３５８，表现为逐步降低。这些数据
表明芒柄花黄素促进ＳＫＯＶ３细胞凋亡并以剂量依赖的方式进
行，见图３。
50 μM 100 μM25 μMControl
Bcl-2/β-actin
Bc
l-
2,
βa
x/
β-
ac
tin
ra
ito 1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
**
β-actin
Bcl-2
Bax
芒柄花黄素
（μM） 0 25 50 100
26 kDa
26 kDa
42-43 kDa
Bax/β-actin
**
**
***
*
图３　芒柄花黄素对ＳＫＯＶ３细胞Ｂｃｌ－２及Ｂａｘ的影响
注：与对照组相比，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，ｎ＝５
３　讨论
芒柄花黄素（Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ，ＦＮ）又名刺芒柄花素、芒柄花
素，是广泛存在于自然界的一种具有类雌二醇分子结构的化合
物，主要来源于黄芪、红三叶、甘草、葛根等豆科植物，是一种植
物雌激素［２］。已有研究表明芒柄花黄素具有保护心血管［３］，防
治骨质疏松［４］，抗肿瘤［５－６］等植物雌激素作用。
凋亡，又称程序性死亡，是由基因调控细胞衰老、维持机体
正常运行的重要机制，由一系列细胞内外信号通路精密调控。
各种凋亡信号通过信号传导通路传至细胞内，激活靶基因产生
效应，引起凋亡。凋亡通路主要包括两条主要通路：线粒体通
路和内质网通路。现有研究表明线粒体通路是调控细胞凋亡
的主要通路［７］，主要由Ｂｃｌ－２家族成员在接收到细胞内的死亡
信号后激活，之后与另一些Ｂｃｌ－２家族成员发生相互作用，导致
线粒体膜通透性改变，释放细胞色素Ｃ（Ｃｙｔｃ）和相关蛋白，启动
Ｃａｓｐａｓｅ级联反应，最终引起细胞凋亡［８－９］。Ｂｃｌ－２基因是目前
公认的抗凋亡基因，通过抑制多种形式的细胞凋亡过程致细胞
数目增加而非具有促进细胞增殖作用，对肿瘤细胞的增殖起促
进作用。而Ｂａｘ基因虽与Ｂｃｌ－２基因具有２１％的同源性，作用
却相反，其表达产物与Ｂｃｌ－２蛋白结合并抑制其抗凋亡作用，进
而促进细胞的凋亡［１０］。
肿瘤细胞从良性发展为恶性的主要原因是增强了细胞对
生长因子信号的敏感性，并且降低了细胞对凋亡程序调控信号
的敏感性。在我们的实验中，随芒柄花黄素浓度的升高，Ｂａｘ蛋
白的表达明显升高，同时Ｂｃｌ－２蛋白的表达明显下降。由此我
们得出结论：高浓度芒柄花黄素通过上调Ｂａｘ蛋白的表达及下
调Ｂｃｌ－２蛋白的表达来诱导卵巢癌细胞的凋亡，并呈一定的剂
量依赖性。
综上所述，我们的实验结果表明：高浓度芒柄花黄素促进
乳腺癌ＳＫＯＶ３细胞的凋亡。芒柄花黄素作为植物雌激素体现
出了对女性相关肿瘤的临床治疗价值，值得我们进一步研究。
参考文献
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９　Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ　ＡＢ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　ＲＡ．Ｂｃｌ－２ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒｓ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，
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１０ 于冰，孙志君．凋亡相关基因Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｂａｄ与乳腺癌［Ｊ］．中国普
外基础与临床杂志，２００３，１４（６）：７３９－７４２．
（收稿日期：２０１４－２－２３）
Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＳＫＯＶ３　ｃｅｌｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｘ　ａｎｄ　Ｂｃｌ－２
Ｇｕ　Ｗａｎ１，Ｚｈａｏ　Ｘｉｎ－ｇｅ２，Ｚｈａｎｇ　Ｘｉｎｇ２△
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈｕｎｄｅ　Ｄｉｓｔｒｉｃｔ　ｉｎ　Ｆｏｓｈａｎ　Ｃｉｔｙ，
Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｆｏｓｈａｎ　５２８３３３；２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｌｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｇｕｉｌｉｎ　５４１００４）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｏｎ　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ＭＴＴ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ａｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　２５，５０，
１００Ｕ·ｍｌ－１．Ｔｈｅ　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｏｎ　ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎ－
ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１００Ｕ·ｍｌ－１．Ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂａｘ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ＭＴＴ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１００Ｕ·ｍｌ－１（Ｐ＜０．０５）．Ａｔ
ｔｈｉｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｎｕｃｌｅｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｓ　ｈａｄ　ｂｅｃｏｍｅ　ｄａｒｋ　ａｎｄ　ｐｙｋｎｏｔｉｃ．Ｍｏｒｅｏ－
ｖｅｒ，ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｂｏｄｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ
Ｂｃｌ－２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｂｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　Ｂａｘ　ａｎｄ　Ｂｃｌ－２ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ；Ｂａｘ；Ｂｃｌ－２；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
针刺对ＡＤ模型大鼠海马凋亡相关蛋白Ｃａｓｐａｓｅ－３的影响
张翠翠
（山东中医药高等专科学校，山东 烟台　２６４１００）
　　摘　要　目的：观察针刺对ＡＤ模型大鼠海马凋亡相关蛋白Ｃａｓｐａｓｅ－３的影响。方法：ＳＤ大鼠２０只，连续６ｗ腹腔注射Ｄ－
半乳糖（１２０ｍｇ·ｋｇ－１）和亚硝酸钠（４５ｍｇ·ｋｇ－１）建立ＡＤ模型后随机分成模型组、针刺组（ｎ＝１０），同时设立非模型组（ｎ＝１０）。
造模后第２１ｄ，针刺组大鼠予以针刺百会和肾俞穴治疗，而模型组大鼠不予以治疗。针刺治疗结束后大鼠立即处死，采用免疫组化
法检测非模型组、模型组、针刺组大鼠海马Ｃａｓｐａｓｅ－３表达。结果：免疫组化结果显示模型组大鼠海马Ｃａｓｐａｓｅ－３表达明显增加，与
对照组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）；而针刺组Ｃａｓｐａｓｅ－３的表达明显减少，与模型组比较（Ｐ＜０．０１）。结论：针刺可抑制大鼠海马
Ｃａｓｐａｓｅ－３表达。
关键词：针灸；ＡＤ；Ｃａｓｐａｓｅ－３
作者简 介：张 翠 翠，女，助 教，主 要 从 事 神 经 生 理 学 研 究，Ｅｍａｉｌ：
ｚｈａｎｇｃｃ０８０２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
　　阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种以日常生
活能力丧失和认知功能障碍为要表现的神经系统退行性变性
疾病，于１９０６年由 Ａｌｏｉｓ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ首次报道。针刺防治老年
性痴呆有着明显的优势和确切的临床疗效［１］。本研究通过针
刺对ＡＤ模型大鼠学海马区凋亡相关蛋白Ｃａｓｐａｓｅ－３的影响，
进一步探讨针刺对ＡＤ的早期防治作用及其机制。
１　材料与方法
１．１　材料
Ｃａｓｐａｓｅ－３免疫试剂盒，购自武汉博士德公司。雄性ＳＤ大
鼠３０只（由山东中医药高等专科学校动物中心提供，合格证
号：ＳＣＸＫ鲁２００５００１５），随机分为非模型组、模型组、针刺组，
每组各１０只。模型组和针刺组大鼠采用腹腔注射 Ｄ－半乳糖
（１２０ｍｇ·ｋｇ－１）和亚硝酸钠（４５ｍｇ·ｋｇ－１）建立 ＡＤ大鼠模
型［２］，连续６ｗ。
１．２　方法
针刺组从造模后２１ｄ开始，针刺百会和肾俞穴进行干预治
疗，每次行针３ｍｉｎ，留针１０ｍｉｎ，１０ｄ为一疗程，间歇２ｄ，共３
个疗程（３４ｄ）。大鼠穴位定位和针刺方法参照华兴邦的大鼠穴
位定位和针刺方法［３－４］。
１．３　大鼠海马Ｃａｓｐａｓｅ－３免疫组织化学检测
大鼠麻醉后，以４％多聚甲醛灌注，置于４％多聚甲醛内进
行后固 定。大 脑 半 球 梯 度 蔗 糖 脱 水，连 续 冰 冻 切 片，按
Ｃａｓｐａｓｅ－３免疫试剂盒说明书测定Ｃａｓｐａｓｅ－３的表达。滴加浓
度为１∶１５０一抗（羊抗大鼠 Ｃａｓｐａｓｅ－３）过夜，滴加二抗（兔抗
２６ 四川生理科学杂志２０１４；３６（２）