全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)05 － 2129 － 07 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 05． 053
收稿日期:2014 － 10 － 05
基金项目:国家自然科学基金(31360432，31160024，31260424) ;
公益性行业(农业)科研专项(201103018)
作者简介:张怀军(1987 －) ，男，安徽阜阳人，在读硕士生，研究
方向为植物病原线虫，E-mail:13322055907@ 163． com。* 为通
讯作者。
杀象耳豆根结线虫 Pro-21fa6 克隆子产活性蛋白酶研究
张怀军1，2，赵志祥2，陈绵才1，2*
(1．海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 571101;2．海南省农业科学院植物保护研究所，海南省病虫害防控重点实验室，海南 海口 571100)
摘 要:本文提取土壤样品总 DNA，以 Fosmid为载体，构建宏基因组文库。以脱脂奶为底物，象耳豆根结线虫为靶标，筛选杀象耳
豆根结线虫的产蛋白酶基因克隆子。以克隆子 Pro-21fa6 为研究对象，从酶活、蛋白含量变化、pH变化对发酵过程进行了研究。结
果表明，构建 31 104 个克隆子，库容 1． 067 Gb，获得产蛋白酶阳性克隆子 111 株，其中 9 株对象耳豆根结线虫具有毒杀作用，Pro-
21fa6 克隆子毒杀效果最好。培养条件温度 35 ℃、转数 200 r /min、以及脱脂奶与诱导剂共同作用可以使酶活提高，是基础培养基
的 1． 33 倍。Pro-21fa6 蛋白酶克隆子初步研究，为蛋白酶基因基因片段亚克隆、测序、活性蛋白酶分离纯化奠定了基础。
关键词:基因组文库;Fosmid文库;克隆子;活性蛋白酶;象耳豆根结线虫
中图分类号:S432． 45 文献标识码:A
Study on Pro-21fa6 Clone Producing Active
Protease to Kill Meloidogyne enterolobii
ZHANG Huai-jun1，2，ZHAO Zhi-xiang2，CHEN Mian-cai1，2*
(1． Environment and Plant Protection College，Hainan University，Hainan Haikou 571101，China;2． Institute of Plant Protection，Hainan
Academy of Agricultural Sciences，Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests，Hainan Haikou 571100，China)
Abstract:Total DNA were extracted from soil samples，taken Fosmid as a carrier to construct metagenomic library． Skim milk was used as a
substrate and Meloidogyne enterolobii as a target，and screening kill Meloidogyne enterolobii production protease gene was cloned． Then the
pro-21fa6 clone was used as tested object，its fermentation process was studied under the changes of protease activity，protein content and
pH． The result showed that building 31104 clones，the capacity of 1． 067 Gb，get positive clones produced protease 111，of which nine had
a toxic effect on Meloidogyne enterolobii，and pro-21fa6 clone poison worked the best． Under the conditions of the temperature of 35 ℃ and
revolutions of 200 r /min，the combined effect of skim milk and inducers could increase the activity and was 1． 33 times than that of the basal
medium． It was concluded that the preliminary study on pro-21fa6 protease clone would provide the foundation for protease genes subcloned，
sequenced，the separation and purification of protease activity．
Key words:Genomic library;Fosmid library clones;Active protease;Meloidogyne enterolobii
自 1998 年环境基因组提出后，已运用到各个领
域，包括土壤、海洋、人体口腔等方面，在医药研发、
农药开发、环境修复等方面，受到众多研究者的青
睐［1］。土壤是巨大的微生物资源库，前人利用土壤
宏基因组学技术筛选和克隆了大量功能基因。江夏
薇等人从深海沉积物宏基因组文库中获得 24 个酯
酶阳性克隆，亚克隆或质粒全测序的方法得到 10 个
酯酶基因序列［2］;李亚楠等人从农药厂废水淤泥中
提取环境 DNA，克隆了 TrxＲ 基因，获得了硫氧还蛋
白还原酶基因的部分序列片段［3］;林灵从北京农田
土壤宏基因组文库对格尔德霉素类 PKS 基因进行
了初步研究［4］;路杨等人从氯酚污染土壤微生物宏
基因组文库筛选了一个除草剂降解基因［5］;陈旭玉
等人从海南橡胶林土壤筛选了对稻瘟菌有明显抑制
作用的两个克隆子［6］。唐倩等人从喀斯特土壤宏
基因组 DNA中筛选获得 3 个表达新型 β-葡萄糖苷
酶活性的克隆［7］;Nacke，H 等人从德国草原土壤筛
选了纤维素和半纤维素水解酶基因［8］。近年来，蛋
白酶生物防治研究，是一个新的研究方向。蛋白酶
被认为是毒杀线虫的一种毒力因子［9 ～ 10］。近年来，
9212
2015 年 28 卷 5 期
Vol. 28 No. 5
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
胞外丝氨酸蛋白酶在杀线虫方面的研究成为热点，
王俊伟［11］、梁连明［12］、王瑞［13］各自在丝氨酸蛋白酶
杀线虫研究比较典型。脱脂奶为底物，筛选含蛋白
酶基因克隆菌。
通过采集热带红树林土壤，构建含有大片段的
Fosmid克隆菌土壤宏基因组文库，挖掘含有毒杀象
耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)的蛋白酶基
因。以毒杀活性最强的 Pro-21fa6 克隆菌为研究对
象，为蛋白酶发酵条件进行初步研究。杀象耳豆根
结线虫蛋白酶克隆菌的发现，为象耳豆根结线虫的
防治提供新的途径。Pro-21fa6 克隆菌的初步探究，
为以后蛋白酶分离纯化，酶活性的研究提供了方便，
为象耳豆根结线虫的防治奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 材料、仪器、试剂
土壤样品采自海南省文昌红树林，1 份保存于
－ 70 ℃，1 份保存于 4 ℃ 冰箱提 DNA 建文库。
Meloidogyne enterolobii 采自于海南省农业科学院线
虫苗圃大棚，利用空心菜繁育象耳豆根结线虫种群，
当根系有大量卵块时，轻轻用清水洗涤，用挑针小心
挑取卵块，0． 5 %次氯酸钠中浸泡 3 ～ 5 min，灭菌水
冲洗 3 ～ 5 次，放入少量灭菌水于灭过菌的培养皿
中，28 ℃恒温培养 4 d，然后收集二龄幼虫(J2)，制
成悬浮液备用［14］。
离心机、紫外可见分光光度计、水浴锅、电泳仪、
制冰机、超净工作台等。LB培养基(氯化钠 10 g、胰
化蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、若配制固体培养基
则加入 1． 5 %琼脂粉)、田园脱脂奶(新西兰进口)。
Folin-酚试剂 A:将 1 g Na2CO3 溶于 0． 2 mol /L
NaOH中，再把 0． 5 g CuSO4·5H2O 溶于 100 mL 1
%的酒石酸钠溶液，尔后将前者 50 mL与后者 1 mL
混合，现用现配。Folin-酚试剂 B(试剂公司定制)、
酪氨酸、酪蛋白、氯霉素、Fosmid 质粒诱导剂 FAS
(Fosmid Aotoinduction Solution)、0． 4 mol /L Na2CO3
溶液、三氯乙酸(TCA)。
1． 2 土壤宏基因组文库构建
利用密度梯度离心法提取、纯化热带雨林土壤
总 DNA，经过 SphⅠ、Bam HⅠ酶切之后，经平末端、
连接、包装、转染后，构建宏基因组 Fosmid文库。
1． 3 含蛋白酶基因克隆子筛选
以脱脂奶为底物，产生透明圈有无为依据，功能
驱动筛选含蛋白酶基因克隆菌。以 Pro-21fa6 阳性
克隆菌发酵 48 h为例，取发酵液，10 000 r /min，4 ℃
条件下，离心 10 min，最后用新注射器，吸取上清液，
用 0． 22 mm滤膜进行过滤，彻底除去发酵上清液残
留菌体。12 孔板中，分别加入 500 条 /mL 象耳豆根
结线虫 J2 悬液 2 mL，再加入 Pro-21fa6 阳性克隆菌
发酵液上清液 1 mL，以加热煮沸 30 min 的发酵液、
灭菌水、终浓度为 1500 倍 1． 8 %阿维菌素、终浓度
为 3000 倍 1． 8 %阿维菌素、不含蛋白酶基因克隆菌
的发酵液，以原始大肠杆菌菌种发酵液为对照。每
处理重复 3 次，25 ℃恒温培养箱中培养，在 4、8、12、
16、20 h 进行观察计数，利用线虫死亡形态和针触
法判断并记录线虫死亡情况［15］。
1． 4 不同摇床转数和温度对 Pro-21fa6 克隆子活化
培养影响
1． 4． 1 不同摇床转数对 Pro-21fa6 克隆子活化培养
影响 菌种培养温度 35 ℃、基础培养基，摇床转速
设置为 0、50、100、150、200、250 r /min，确定菌种活
化最适摇床转数。取 3 个培养瓶含有 200 mL的 LB
培养液，做平行实验。从 － 70 ℃冰箱取出 Pro-21fa6
原始菌种，接种 2． 5 μl 于培养瓶，分别加入终浓度
为 12． 5 μg /mL 的氯霉素，使活化菌种产生氯霉素
抗性。以光密度吸收值为标准，LB 原培养基为对
照，600 nm测光密度值，分别在 0、1、2、3、4、5、6、8、
10、12、14 h内连续测定发酵液的光密度值，最终光
密度值取各组平行实验相同时间段的平均值，以培
养时间为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制曲线。
1． 4． 2 不同摇床转数对 Pro-21fa6 克隆子活化培养
影响 摇床转速 150 r /min，基础培养基，温度梯度
设置为 20、25、30、35、40 ℃，通过温度改变确定菌种
活化最适温度。方法同 1． 3。
1． 5 环境和诱导条件对 Pro-21fa6 克隆子产蛋白酶
活力的影响
1． 5． 1 酪氨酸标准曲线 利用 Folin-酚试剂法制
作标准曲线和测定发酵上清液酶活，取 21 支试管分
3 组做平行实验，每组试管中分别加入 100 μg /mL
的酪氨酸标准溶液 0、1、2、4、6、8、10 mL，再分别加
入去离子水，使溶液的终体积为 10 mL。再分别取
1． 0 mL于新的一组试管中，在试管中分别加5 ． 0 mL
0． 4 mol /L Na2CO3，福林-酚试剂 1． 00 mL，混匀放入
40 ℃水浴中显色 20 min，以不含酪氨酸的 0 管为空
白，在 680 nm下测光密度值，最终数据为 3 组平行
实验的平均光密度值。以光密度值为纵坐标，酪氨
酸标准浓度为横坐标，绘制酪氨酸标准曲线。当光
密度值等于 1 时的酪氨酸的量(μg)，即吸光度常数
K(95 ～ 100)值。
1． 5． 2 不同培养温度对发酵液酶活的影响 以基
础培养基为营养，摇床转速为 200 r /min，通过改变
温度确定克隆菌菌种合适的生长温度，设置 25、30、
35、40、45 ℃等 5 个梯度下培养，每隔 6 h 测 1 次酶
0312 西 南 农 业 学 报 28 卷
活，测定在 0 ～ 72 h 时间段酶活力，取平均值，绘制
曲线，确定最佳产酶活温度。
1． 5． 3 不同摇床转数对发酵液酶活的影响 以基
础培养基为营养，设置 0、50、100、150、200、250 r /
min几种不同的转速，研究转速对产酶活的影响，每
隔 6 h测 1 次酶活，测定在 0 ～ 72 h 时间段酶活力，
取平均值，确定 Pro-21fa6 克隆菌最适发酵培养的转
速，以产最大酶活为标准，确定最适摇床转速。
1． 5． 4 不同诱导物培养条件产酶活比较 取 4 个
装有 180 mL 培养液的培养瓶，分别加入终浓度为
12． 5 μg /mL 的氯霉素，分别接种 20 mL 经过 10 h
活化的对数期菌种，2、3、4 组分别加入 2 mL 脱脂
奶、2 mL诱导剂 FAS、2 mL 脱脂奶和 2 mL 诱导剂
FAS，以第 1 组作为对照，设置 3 次重复实验。培养
条件为 35 ℃、200 r /min，每隔 3 h，10 000 r /min、4
℃、离心 10 min，取上清液 1 mL 于干燥洁净的试管
中，用去离子水稀释 10 倍。680 nm 下测光密度值，
测定在 0 ～ 78 h时间段酶活力，从 0 h开始，每隔 3 h
测 1 次酶活。以培养时间为横坐标，酶活力为纵坐
标，绘制酶活变化曲线。
1． 6 编号 Pro-21fa6 克隆子不同诱导条件发酵液蛋
白含量变化
1． 6． 1 酪蛋白标准曲线 利用 Folin-酚试剂法测
定发酵上清液蛋白含量，取 21 支试管分成 3 组，分
别加入 0、0． 1、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1 μl 标准酪蛋白
溶液(250 μg /mL)，用灭菌去离子水补足到 1 mL，
加入 5 mL试剂 A，混匀，室温放置 30 min。然后与
500 nm处比色。测定光密度值，取 3 组测定的平均
值，以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘
制标准曲线值为定量的依据。
1． 6． 2 不同培养条件发酵液蛋白含量变化 取 1
mL经过离心的发酵液，用灭菌去离子水稀释 10 倍，
各取 1 mL稀释液加入新试管中。加入 5 mL试剂 A
混匀，室温放置 30 min，再加入 0． 5 mL 试剂 B(即
Folin-酚)，然后于 500 nm处比色，以 1 mL灭菌去离
子水代替样品作空白对照。测得光密度值，在标准
曲线中查出未知样品的浓度。
1． 7 常规发酵和诱导剂作用条件下 pH值变化
在 37 ℃、200 r /min、加入氯霉素抗性条件下，
分 2 组 3 个平行实验。一组按常规加入等量活化之
后的菌液，另一组加入等量的菌液，以及 1 mL 脱脂
奶与 1 mL诱导剂 FAS共同诱导。每隔 9 h测取发酵
液，室温条件下，测 pH值，取平均值，绘制变化曲线。
1． 8 杀线虫蛋白酶粗分离
硫酸铵梯度盐析:硫酸铵使用前磨碎，平铺在烤
箱内 50 ～ 60 ℃烘干 1 h左右，切勿过热。加入经过
脱脂奶、FAS诱导处理的发酵，45 h 后取发酵液，加
入 50 mL 离心管中，10 000 r /min、4 ℃、离心 10
min，取上清液，将上清液收集液 100 mL 放入 200
mL的锥形瓶中。锥形瓶始终放置于冰浴中，加硫酸
铵边搅拌边缓慢加入颗粒，避免产生过多泡沫和局
部硫酸铵浓度过大，造成蛋白酶脱水失活，混匀后，
静置过夜。加入硫酸铵晶体 0、5． 2、11． 4、17． 6、24．
32、31． 32、39、47． 2、55． 2、63． 6、71． 4 g、(对应终浓
度分别为 0、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、
70 %、80 %、90 %、100 %饱和度)，测定上清液的
酶活力，确定蛋白酶盐析的最适盐浓度。3000 r /
min、4 ℃、离心 15 min，每份样品均分别收集上清液
和沉淀，沉淀部分用 50 mL pH = 7． 0，0． 2 mol /mL
Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液溶解。对上清液进行酶
活测定，选择最佳硫酸铵饱和度进行总蛋白的盐析
沉淀提取，离心得沉淀，用 0． 9 % NaCl 溶液反复漂
洗，进行透析除盐，得到蛋白酶粗提液。取粗提液 1
mL作用于象耳豆根结线虫 J2，观察致死时间。
1． 9 结果统计和数据分析方法
线虫死亡率(%)= 死亡线虫数量
供试线虫数量
× 100
校正死亡率(%)=
处理组线虫死亡率 － 对照组线虫死亡率
1 － 对照组死亡率
× 100
A B
图 1 LB平板上含蛋白酶基因的阳性克隆(a、b)
Fig． 1 Positive clones containing protease gene in LB medium(a，b)
13125 期 张怀军等:杀象耳豆根结线虫 Pro-21fa6 克隆子产活性蛋白酶研究
12 h(全活) 12 h(100 %死亡)
12 h(100 %死亡)
8 h(100 %死亡) 8 h(50 %死亡) 8 h(70 %死亡)
12 h(全活) 12 h(全活)
12 h(全活)
清水对照(a)、1500 倍阿维菌素(b)、大肠杆菌 DH5α 发酵液(c)、Pro-21fa6 克隆子发酵液(d)、Pro-21fa6 克隆子煮沸的发酵液(e)、不含蛋白
酶基因克隆子发酵液(f)、Pro-21fa6 克隆子发酵液(g)、Pro-21fa6 克隆子发酵盐析蛋白酶粗提液(h)、3000 倍阿维菌素(i)
图 2 Pro-21fa6 克隆子对 M． enterolobii的毒杀效果
Fig． 2 Toxic effect of pro-21fa6 clone on M． enterolobii
利用 Excel软件对实验数据统计处理，对 OD吸
收值、酶活、蛋白含量等通过方差分析进行比较，差
异显著性水平位为 α = 0． 05，并作图。
2 结果与分析
2． 1 文库的构建
获得 31 104 个克隆子，空载体率小于 1 %。平
均插入片段为 27 ～ 45 kb 基因片段，平均插入片段
为 36 kb，库容大小约为 1． 067 Gb，适合中等规模功能
基因筛选，为杀线虫蛋白酶基因的挖掘提供了可能。
2． 2 蛋白酶的筛选
通过对文库进行初筛，共筛选到 111 个含蛋白
酶基因的 Fosmid 阳性克隆子(图 1)。其中 9 个含
杀线虫蛋白酶基因，Pro-21fa6 克隆子毒杀象耳豆根
结线虫的活性最强。
2． 3 Pro-21fa6 克隆子的处理 M． enterolobii
不同处理结果均按校正死亡率得出结果如图
2，Pro-21fa6 克隆子发酵液对 M． enterolobii 毒杀效果
较为明显，Pro-21fa6 克隆子发酵液相当于终浓度为
3000 倍阿维菌素毒杀效果，在第 8 小时左右，就能
杀死 70 % 的 M． enterolobii，第 12 小时左右毒杀效
果达到 100 %。8 h 之后，Pro-21fa6 克隆子发酵液
与 Pro-21fa6 克隆菌煮沸的发酵液对比死亡率，说明
极有可能是因为蛋白酶的存在，对 M． enterolobii 有
毒杀活性。
2． 4 Pro-21fa6 克隆子活化受摇床转速和温度的影
响
通过摇床转速、温度对菌种活化的影响，由图 3
2312 西 南 农 业 学 报 28 卷
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
收
值
OD
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
光
密
度
值
OD
0 r/min
50 r/min
100 r/min
150 r/min
200 r/min
250 r/min
20 ℃
25 ℃
30 ℃
35 ℃
40 ℃
0 2 4 6 8 10 12 14 16
时间（h）
0 2 4 6 8 10 12 14 16
时间（h）
a
b
图 3 不同摇床转速(a)和温度(b)对菌株 Pro-21fa6 生长的影响
Fig． 3 Effect of different shaking speed (a)and temperature (b)on the growth of stain Pro-21fa6
可看出，摇床转速和温度对 Pro-21fa6 克隆子菌种的
活化是有影响的。由图 3a 知，在 0 ～ 150 r /min 范
围，随着摇床转速的增加，菌体活化的产量逐渐增
加;在 150 ～ 250 r /min 范围，随着摇床转速的增加，
菌种活化的产量在减少。当摇床转速为 150 r /min
时，菌种活化曲线属于标准的‘S’形曲线，调整期和
对数期期很明显。接种 0 ～ 3． 5 h 为菌种调整期，3．
5 ～ 8 h是菌种对数期，对数期相对比较长。由图 3b
知，在 20 ～ 35 ℃范围，随着温度的升高，活化菌产量
逐渐增加;在 35 ～ 40 ℃范围，随着温度升高，活化菌
产量逐渐减少。可以确定菌种活化最适温度为 35
℃。因此，利用基础培养基 150 r /min、35 ℃条件
下，将培养 8 ～ 10 h 的活化克隆菌适合菌体发酵产
酶，剩余的活化菌液装入 10 mL离心管中，加入终浓
度为 20 % ～ 30 %的甘油进行保存 － 70 ℃冰箱备
用。
2． 5 不同环境和诱导条件对产酶活的影响
2． 5． 1 不同环境发酵液产酶活影响 由图 4 可看
出，产酶活总体变化趋势是逐渐上升，达到最大值之
后，因为培养液环境的变化，酶活性急剧下降。由图
4a曲线变化可以看出，不同温度产酶活最高点都是
在第 48 小时。在 25 ～ 35 ℃范围，随着温度的升高，
产酶活量不断提高;在 35 ～ 45 ℃范围，随着温度升
高，产酶活量不断降低。因此，当温度为 35 ℃时，是
克隆菌最适产酶活的温度。由图 4b可看出，不同摇
床转速酶活产量不同，但是酶活最高点在 48 h。在
0 ～ 200 r /min范围，随着转速的增加，产酶活量不断
提高;在 200 ～ 250 r /min 范围，随着转速增加，产酶
活量不断降低。因此，摇床转速 200 r /min 是克隆
菌发酵最适产酶活的摇床转速。
2． 5． 2 不同诱导条件发酵液酶活变化 图 5 标准
曲线线性回归方程为 Y = 0． 0102X － 0． 0021，Ｒ2 =
0． 9997，本法在酪氨酸浓度 0 ～ 60 μg /mL 范围内有
良好的线性关系。当 Y = 1 时，求得 K = 98． 25。该
标准曲线同样适用于 3． 4。
实验结果分析，任选 2 种数据进行 F 检验方差
分析，都存在显著性差异。由图 5 也可以看出，不同
发酵条件，产酶活量有很大差异。常规培养与加入
FAS后相比:发酵液酶活变化趋势一样，几乎处于平
行状态。从 0 到 48 h 时间段，蛋白酶酶活缓慢上
升;第 48 小时，两者酶活都达到最大值;第 48 小时
之后，两者发酵液酶活急剧下降，直到丧失酶活，可
能与发酵环境的恶化有关系，如大量的蛋白酶被降
解等。
0 r/min
50 r/min
100 r/min
150 r/min
200 r/min
250 r/min
20 ℃
25 ℃
30 ℃
35 ℃
40 ℃
a b
20
15
10
5
0
相
对
酶
活
（ U
）
20
15
10
5
0
相
对
酶
活
（ U
）
0 10 20 30 40 50 60 70 80
时间（h）
0 10 20 30 40 50 60 70 80
时间（h）
图 4 温度 (a)和摇床转速 (b)对代表菌株 Pro-21fa6 产酶活的影响
Fig． 4 Effect of temperature (a)and different shaking speed (b)on activity of production protease from Pro-21fa6 representative strains
33125 期 张怀军等:杀象耳豆根结线虫 Pro-21fa6 克隆子产活性蛋白酶研究
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1
0 10 20 30 40 50 60
吸
光
值
OD
不同酪氨酸浓度（μg/mL）
40
30
20
10
0
相
对
酶
活
（ U
）
0 20 40 60 80 100
时间（h）
常规培养
脱脂奶
FAS
脱脂奶+FAS
a
b
y=0.0102x-0.0021
R2=0.9997
图 5 不同浓度酪氨酸标准吸光值(a)和不同发酵液中蛋白酶酶活变化(b)
Fig． 5 Tyrosine standard solution absorbance of different concentrations (a)and changes of protease’s relative activity in fermentations(b)
0 50
吸
光
值
OD
不同酪蛋白浓度（μg/mL） 0 10 20 30 40 50 60 70
时间（h）
常规培养
脱脂奶
FAS
脱脂奶+FAS
a b0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
100 150 200 250 300
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
吸
光
值
OD
y=0.0004x+0.0001
R2=0.9998
图 6 不同浓度酪蛋白标准吸光值(a)和不同发酵液中蛋白变化(b)
Fig． 6 Casein standard solution absorbance of different concentrations (a)and changes of protein in different fermentations(b)
2． 5． 3 酪蛋白标准曲线和不同发酵液中蛋白变化
求得线性回归方程为 Y = 0． 0004x + 0． 0001，Ｒ2 =
0． 9998 通过光密度值计算，直接代入数据，就能求
出不同培养发酵液中蛋白质的含量变化曲线。由图
6 可以看出，随着发酵的进行，在 0 ～ 60 h内，发酵液
蛋白含量变化总体趋势是先下降，再上升，然后再下
降的规律。加入脱脂奶、诱导剂 FAS 对发酵蛋白的
变化是有影响的，当加入脱脂奶、诱导剂 FAS 双重
作用下，36 h时，发酵液蛋白吸收值达到最大值。
2． 6 最适温度、摇床转数与两种诱导物共同作用下
pH变化
可以通过发酵液的 pH 值变化，初步定性蛋白
酶的类型。通过改变初始发酵液 pH 值，为蛋白酶
的进一步发酵优化提供理论依据。
如图 7 所示，在 0 ～ 48 h 内，随着常规发酵的进
行，常规发酵 48 h时，发酵液的 pH值达到最大值为
7． 56，48 h之后 pH值就显示很不稳定，结合图 3 ～ 4
变化曲线综合分析，可能是因为发酵液蛋白在 48 h
后逐渐降解了，分解成不同种类的氨基酸，导致发酵
液 pH值的不稳定。经过分析可知，该蛋白酶极有
可能是碱性蛋白酶。
2． 7 硫酸铵盐析对发酵上清液蛋白酶分离纯化的
影响
当硫酸铵饱和度为小于 30 %时，上清液酶活力
基本不变，当饱和度大于 30 %时，随着饱和度增加，
沉淀量的增加，上清液的酶活力不断地降低。当饱
和度达到 80 %时，上清液基本没有酶活。根据图 8
曲线，采用 30 %的饱和硫酸铵沉淀除去杂蛋白，然后
将上清液补加硫酸铵至 70 %饱和度沉淀目的蛋白。
20 40 60 80
时间（h）
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
pH
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
0 20 40 60 80
时间（h）
0
a.最适温度转速 b.2 种诱导物共同作用
pH
图 7 不同 Pro-21fa6 克隆子发酵条件对 pH的影响(a、b)
Fig． 7 Effect of different pro-21 fa6 fermentations conditions on pH (a，b)
4312 西 南 农 业 学 报 28 卷
20 40 60 80
硫酸铵浓度（%）
20
15
10
5
0
100 1200
酶
活
力
（ U
）
图 8 硫酸铵梯度盐析发酵上清液酶活变化
Fig． 8 Enzyme activity of supematant by different concentrations of
ammonium sulphate
3 讨 论
基于热带红树林微生物资源的丰富性、独特
性［16 ～ 17］，利用宏基因组技术不仅可以评估红树林微
生物资源的多样性，而且可以大大扩展微生物基因
资源的利用空间。通过土壤微生物大片段宏基因组
文库构建，筛选植物病害有防治作用的克隆子，有很
多成功的案例［18 ～ 21］。
本文针对 Pro-21fa6 克隆子发酵液蛋白酶的类
型进行初步预测。从发酵液蛋白分泌类型来看，该
蛋白酶是一种胞外蛋白酶类型;通过发酵液 pH 值
的变化，可以得出该蛋白酶可能是一种碱性蛋白酶;
蛋白酶通过破坏象耳豆根结线虫表皮角质层毒杀原
理来看，该蛋白酶可能是一种角质蛋白酶。
利用土壤基因组文库筛选蛋白酶功能基因，工
作量大，所用的耗材比较多，耗费时间多，但是实用
性比较强。Pro-21fa6 克隆子的初步研究为蛋白酶
的进一步分离纯化提供基础，包括凝胶过滤层析、超
滤浓缩、疏水柱层析、高效液相等。也为含有蛋白酶
基因片段的亚克隆、测序奠定了基础。
致 谢:感谢海南省农业科学院植物保护所陈绵才
研究员、赵志祥博士的耐心帮助和悉心指导，以及海
南大学环境与植物保护学院郑服丛教授、缪卫国教
授对构建基因组文库的热心建议。
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(责任编辑 陈 虹)
53125 期 张怀军等:杀象耳豆根结线虫 Pro-21fa6 克隆子产活性蛋白酶研究