全 文 ：第 33卷第 3期
2009年 5月 　　　　　　　　　　
水　产　学　报
JOURNALOFFISHERIESOFCHINA　　　　　　　　　　　　
Vol.33, No.3　
May, 2009　
文章编号:1000-0615(2009)03-0396-07
收稿日期:2008-04-27　　　修回日期:2009-01-10
资助项目:国家 “八六三 ”高技术研究发展计划(2006AA10A402, 2006AA10A413);国家自然科学基金项目(30700621);教育部新
世纪人才支持计划(NCET-06-0596);教育部科学研究重点项目 (107070);国家自然科技资源共享平台项目
(2006DKA30470-016);山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(2008BS06002)
通讯作者:茅云翔 , E-mail:yxmao@ouc.edu.cn
条斑紫菜基因组 Fosmid文库构建
茅云翔 , 　崔菁菁 , 　孔凡娜
(中国海洋大学海洋生物遗传学与基因资源利用教育部重点实验室 ,山东 青岛　266003)
摘要:高分子量基因组文库是开展条斑紫菜基因组学研究的必备工具 。构建了由 23 040个
Fosmid克隆组成的条斑紫菜孢子体无偏倚基因组文库 。检测分析表明:文库克隆重组率为
100%;插入 DNA片段长度为 28 ～ 40kb,平均长度为 35kb,文库覆盖率约为条斑紫菜基因组
的 2.78倍;从超级池中筛查条斑紫菜 18SrRNA、atpA、h2A、rbcL基因 ,至少能得到一个阳性克
隆 ,印证了计算所推测的文库覆盖率;随机选取 6个 Fosmid克隆经 100代传代后插入 DNA片
段未发生丢失或长度变化 ,表明克隆传代的稳定性 。该文库的构建为开展条斑紫菜基因组特
性分析和基因克隆奠定了基础。
关键词:条斑紫菜;Fosmid文库;基因克隆;基因组学
中图分类号:Q785;S917　　　　　　　文献标识码:A
　　条斑紫菜(PorphyrayezoensisUeda)是世界上
最重要的人工栽培海藻之一 ,营养丰富 、质优味
美 ,具有极高的经济价值。我国是世界最大的条
斑紫菜栽培生产国 ,栽培面积超过 1.5×104 hm2 ,
标准制成品年产量超过 30亿张 ,产值超过 20亿
元 。由于条斑紫菜重要的经济价值 ,多年来在其
生活史 、养殖生态 、生理学和生物化学等方面开展
了大量的研究[ 1] 。
条斑紫菜不仅具有很高的经济价值 ,而且具
有特别的科学研究价值[ 2] 。条斑紫菜是潮间带
海藻的典型代表 ,能够适应渗透压 、光强 、温度等
环境理化因子的急剧变化 ,具有很强的抗逆能力。
其主要特性表现在:1)耐干性强 , 干燥至含水
20%,复水后仍能恢复活力;2)光饱和点高 、光补
偿点低;3)适应低温能力强 ,在一定含水量下 ,冻
存数月仍能恢复活力;4)盐度适应范围广。条斑
紫菜染色体数目少 ,配子体仅 3条染色体;基因组
小 ,碱基数目约为(2.8 ～ 2.9)×108 bp,与模式植
物拟南芥 (Arabidopsisthaliana)和水稻 (Oryza
sativa)属于同一数量级 。条斑紫菜易于培养 ,能
在实验室条件下完成生活史 ,世代周期短 。
近年来 ,条斑紫菜分子生物学研究进展迅速。
锰超氧化物歧化酶(Mnsuperoxidasedismutase,
SOD)、海 藻 糖 合 成酶 (trehalose-6-phosphate
synthase, TPS)等数百个重要基因被克隆 [ 5 -6] ;由
191 952 bp组成的质体基因组全序列已被测定;
开展了大规模表达序列标签分析[ 7-10] ;基因芯片
被开发并应用于基因表达谱分析 [ 11-12] ;遗传转化
系统研究亦取得了初步的进展 [ 13 -15] 。因此 ,条斑
紫菜已成为海藻抗逆分子生理和基因组学研究的
理想模式物种。
高分子量基因组文库是开展基因组学研究的
必备工具。 Fosmid载体是含有大肠杆菌 F-因子
的粘粒(cosmid)[ 16] ,既具有粘粒载体增殖与包装
效率高的优点 ,又具有大肠杆菌 F-因子单拷贝 、
稳定性高的特性。与细菌人工染色体(bacterial
artificialchromosome, BAC)相比 , Fosmid载体可
诱导增殖 ,更便于操作。本文以条斑紫菜孢子体
为材料 ,成功构建了首个覆盖率比较高 、序列无偏
倚的基因组 Fosmid文库 ,为开展条斑紫菜基因克
隆 ,内含子与基因上下游调控序列分析 ,基因组物
理图谱构建 ,基因组特征分析 ,乃至全基因组序列
测定奠定了基础 。
1　材料与方法
1.1　藻株与试剂
条斑紫菜孢子体由江苏省海洋水产研究所国
家紫菜种质库提供 ,实验室长期保种 。培养条件:
光照强度 30 ～ 35 μE/(m2· s),光照周期(L∶D)
14 h∶10 h, 培养温度 (20 ±1)℃, 培养基为
Provasoli加富海水培养基(PES)。
文 库 构 建 使 用 Epicentre 公 司 的
CopyControlTM FosmidLibraryProductionKit。宿
主菌为 EPI300TM-T1R PhageT1-resistantE.coli
PlatingStrain;载体为 CopyControlpCC1FOSTM;
包 装 蛋 白 为 MaxPlaxTM Lambda Packaging
Extracts。限 制 性 内 切 酶 NotⅠ 购 自 日 本
TOYOBO公司 。其它试剂均为进口试剂或国产
分析纯 。
1.2　文库构建
材料收集　　用 200目筛绢收集条斑紫菜孢
子体 ,无菌蒸馏水冲洗 3次以去除藻丝表面附着
的杂质 ,吸水纸尽量吸干水分 ,称取 1.2 g藻丝 ,
液氮冻存。
高分子量 DNA制备　　DNA制备参照节旋
藻的 DNA制备方法 [ 17] 。冻存藻丝加入 0.12 g
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂 ,液氮中迅
速研磨破碎 ,分装于 1.5 mL离心管;管中加入
0.5mL溶液 Ⅰ (30 mmol/LTris-ClpH 8.0 , 10
mmol/LEDTApH8.0, 100mmol/LNaCl, 2% β-
巯基乙醇),涡旋振荡 1 min;13 000 ×g离心 1
min,弃上清;重复一次。用 0.54 mL溶液 Ⅱ(100
mmol/LNaCl, 200 mmol/L蔗糖 , 10 mmol/L
EDTApH8.0)悬浮沉淀 ,加入 0.18 mL裂解缓
冲液 (500 mmol/LTris-Cl, 25 mmol/LEDTA,
2.5%SDSpH8.0),振荡 1min;加入 RNaseA至
终浓度 50 μg/mL, 55 ℃水浴 1 h。冷却至室温
后 ,用等体积 Tris饱和酚和等体积氯仿 /异戊醇
抽提 2次 ,离心(13 000×g, 10min)收集上清;加
入 1/10体积的 3mol/LNaAc(pH5.2)和 0.8倍
体积的异丙醇轻柔混匀 , -20 ℃过夜后 13 000×
g离心 15 min;沉淀用 70%乙醇洗涤两次除盐 ,
100μLTE溶解沉淀并定量。 -20 ℃保存备用。
随机片段制备与末端修饰　　25 μg高分子
量 DNA在 60μL体系中用 21号注射器随机剪切
制备适合于文库构建的 DNA片段 。倒转电场凝
胶电泳 (field-inversedgelelectrophoresis, FIGE)
检测分子量 ,正向电压 180V,反向电压 120V,脉
冲转换时间 0.1 ～ 2.0s, 0.8%琼脂糖凝胶电泳 12
h,电泳结束后 EB染色。
末端修饰按照试剂盒流程操作　　随机剪切
的 DNA片段用 0.8%低熔点胶 (low melting
piont, LMP)电泳 ,切取含有 40 ～ 50 kbDNA片段
的凝胶 , 42 ℃琼脂糖酶消化 10 h, 70 ℃灭活后冰
置 5 min;13 000×g离心 20 min,上清加入 l/10
体积的 3 mol/LNaAc(pH7.0)和 2倍体积的无
水乙醇轻柔混匀 ,室温静置 30 min, 13 000×g离
心 20min;沉淀用 70%乙醇洗涤 2次 ,室温放置
使乙醇挥发 ,溶于 30μLTE溶液 , -20℃保存备
用 。电泳检测回收片段大小并定量 。
连接转染　　按试剂盒流程操作:载体与外
源片段按摩尔比 10∶1连接 4 h, 用 MaxPlaxTM
LambdaPackagingExtracts体外包装后 转染
EPI300TM-T1R菌株。涂布在含有 12.5 μg/mL氯
霉素的 LB平板上 , 37 ℃培养 20 h。
文库保存及 PCR超级池构建　　挑取单克
隆分别培养于含 12.5 μg/mL氯霉素的 500 μL
LB液体培养基中 , 37 ℃培养 30 h后 ,加入 25%
无菌甘油混匀。按两步 PCR筛选系统设超级池 ,
每个一级超级池由 12个 96孔板构成 ,共含有
1 152个克隆;每个二级池分别由 12个板池 、8个
行池和 12个列池构成 。文库与超级池均用 96孔
细菌培养板各保存两份 ,并用密封膜封板 , -80
℃保存 。
1.3　文库质量鉴定
克隆片段长度和文库覆盖率鉴定　　随机挑
取 20个克隆 ,碱裂解法提取质粒 DNA,经 NotⅠ
酶切后进行脉冲场凝胶电泳 ,检测克隆片段大小
并计算重组率。电泳条件:1%琼脂糖凝胶 , 0.5×
TBE,温度 14 ℃,起始脉冲时间 5 s,终止脉冲时
间 15 s,电泳 11 h,电场强度 6 V/cm,电场夹角
120°,泵速 90 r/s。
为检测文库覆盖率 ,以条斑紫菜 18SrRNA,
atpA, h2A, rbcL基因为模板设计 PCR引物进行文
库基因筛查(表 1),并对 PCR产物进行 DNA序
列测定 。
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表 1　从文库中筛查基因所用 PCR引物
Tab.1　PCRprimersforgenescreeningfromthefosmidlibrary
GenBank登录号 基因 引物(5′※ 3′)
GI:75755632 18SrRNA TGGAGGGCAAGTCTGGTGAACG22bpTCCCACTGGCAACAAGGCAAAA22bp
GI:90994377 atpA CTGTCATACTACCTCCACCTA 21bpCAAGTAATGGAACAAGGCTAA 21 bp
GI:156186230 h2A GCGTACCCATCACTGTCTCCTCG 23 bpCCCTTCTTTCCCTTGACCTTCG 22bp
GI:90994377 rbcL ACTGGGATGCTGACTATGTGA 21bpCCTAAGAAAGGTCTACCGAAC21bp
　　Fosmid克隆稳定性鉴定 　　随机挑选 6个
Fosmid克隆 ,分别接种于 300 mL含有 12.5 μg/
mL氯霉素的 LB培养基 , 37 ℃过夜培养 ,培养物
稀释 106倍接种后按同样条件继续培养 ,连续继
代培养 5 d。培养结束后 ,分别提取第 1天(第 0
代)和第 5天(约第 100代)FosmidDNA, NotⅠ酶
切后 ,脉冲场凝胶电泳检测 Fosmid克隆在继代培
养中是否发生变化。
2　结果
2.1　大分子量 DNA的制备
足量的高质量基因组 DNA是构建 Fosmid文
库的关键。检测结果显示 ,本研究方法制备 DNA
得率高 、纯度好 、分子量较大。制备 DNA片段的
起始材料为 50 mg条斑紫菜孢子体(每个 EP管
中的藻体量),最后得到的 DNA为 70 μg,得率
高;紫外分光光度计检测 DNA质量 A260 /A230 =
1.9、A260 /A280 =1.85,纯度好;电泳结果显示 DNA
片段的分子量大于 100 kb(图 1),能够满足构建
Fosmid文库对大分子量 DNA的要求。
注射器随机剪切能有效破碎大分子量 DNA。
随机剪切 30次左右 , DNA片段的长度从 100 kb
以上下降到 50kb左右;再经过末端修饰等步骤 ,
最终得到的 DNA片段的长度大约集中在 35 ～ 40
kb,适合与 Fosmid载体进行重组连接。
2.2　文库覆盖率
条斑紫菜 Fosmid文库来自于同一 DNA样本
的两次连接 ,克隆总数为 23 040个。随机选取 20
个文库克隆提取质粒 ,用限制性内切酶 NotⅠ酶
切后电泳检测 (图 2), 可看出每个泳道大约在
8 kb处均有一载体 DNA片段的电泳带 ,除此之外
每个泳道还有其它的电泳条带 ,表明文库克隆的
重组效率约为 100%。
统计显示 ,除载体片段外的电泳带共计有 57
条;将每个泳道片段合并后分析 ,重组克隆的插入
片段分子量在 28 ～ 40 kb之间 ,平均约为 35 kb。
以条斑紫菜基因组大小为 290 Mb计 ,所构建基
因组文库覆盖率约为 2.78倍。
图 1　大分子量基因组 DNA制备
1.制备的总 DNA;2.随机剪切 30次后的 DNA;3.经末端修饰
并 回 收的 DNA, M1.λDNA +copycontrolDNA, M2.
copycontrolDNA
Fig.1　PreparationofhighmoleculargenomicDNA
1.TotalDNAprepared;2.randomlyshearedDNAforthirty
times; 3.recoveryDNA ofendmodified;M1.λDNA+
CopycontrolDNA, M2.CopycontrolDNA
　　以包含全部克隆的 20个一级池的 DNA为
模板 ,从文库中筛查条斑紫菜 18SrRNA, atpA,
h2A, rbcL基因。 PCR筛查结果显示 , 18SrRNA
基因在所有一级池中均能筛查到 ,其它 3个基因
至少能筛查到一个克隆(表 2),经测序均为目标
基因。实验印证了由计算所推测的文库覆盖率 。
2.3　文库稳定性检验
为了评估 Fosmid克隆的插入片段在大肠杆
菌中的稳定性 ,我们随机挑选了 6个克隆连续培
养 100代 ,比较 0代和第 100代 Fosmid克隆插入
片段的酶切图谱 ,结果显示没有发生重组或插入 /
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缺失等变化 ,表明 Fosmid克隆至少能稳定传代
100代(图 3),说明低拷贝的 Fosmid克隆在不加
诱导剂下传代稳定。
图 2　文库克隆酶切片段电泳图
1～ 20.为随机检测的克隆;M1.lambdamonocutmix;M2.λDNA/HindⅢ +EcoRⅠ
Fig.2　ElectrophoresisofrestrictedfragmentsofrecombinantFosmidclones
1-20.Randomlyselectedclones;M1.lambdamonocutmix;M2.λDNA/HindⅢ +EcoRⅠ
表 2　超级池筛选结果
Tab.2　Specificgenescreeningfrom
thesuperpoolofFosmidclones
基因 1, 2, 3, 4…………………………………18, 19, 20
18S ++++++++++++++++++++
atpA --------+-----------
h2A ---------------+--+-
rbcL ----------+-----+---
3　讨论
3.1　高分子量基因组 DNA制备
Fosmid文库构建的关键步骤之一就是制备
高纯度的高分子量基因组 DNA。藻类的多糖和
多酚含量普遍较高 ,是 DNA纯度的主要干扰物
质 。紫菜配子体含有大量硫酸基多糖和羧基多糖
等酸性胞外多糖 ,这些多糖比陆生植物的中性多
糖更易溶于水 ,会与 DNA产生共沉淀 ,从而影响
限制性内切酶的消化和 PCR扩增等后续实验。
另外 ,有研究表明紫菜配子体细胞 DNA含量较
少 , DNA酶含量却很高 ,会导致紫菜 DNA提取得
率不足 [ 18] 。紫菜的孢子体世代具有和配子体相
同的遗传背景 ,更易于在常温条件下长期保存和
培养 ,使其成为对紫菜进行分子生物学和基因组
学研究的理想材料。因此 ,本研究选用条斑紫菜
孢子体为实验材料。
　　紫菜 DNA的制备方法已有报道[ 18-20] 。
1992年 , Hong等 [ 20]采用 LiCl法提取紫菜 DNA,
LiCl使紫菜组织软化 , DNA从松散的细胞壁和细
胞膜之间释放出来 ,避免了液氮研磨造成的酸性
多糖释放 ,但此法提取的 DNA纯度不高 ,效果也
不稳定 。细胞法是用海螺酶除去紫菜配子体的细
胞壁(含大量多糖),以减少多糖对 DNA质量的
干扰 ,但由于孢子体与配子体细胞壁组分差别很
大 ,用海螺酶不能有效降解孢子体细胞壁 ,因此不
适合于孢子体 DNA制备[ 19] 。 CTAB法是提取植
物 DNA的常用方法 ,可有效去除多糖 、多酚等杂
质 ,制备的 DNA纯度较高 ,但该方法步骤多 ,不
利于获得高分子量 DNA片段。琼脂糖包埋组织
材料 ,原位消化后脉冲场凝胶电泳是构建 BAC文
库常用的高分子量 DNA制备方法 ,但操作繁琐 ,
对仪器和试剂要求高 。
3993期　　　　　　　　　　　　　茅云翔 , 等:条斑紫菜基因组 Fosmid文库构建
本实验针对条斑紫菜的生化特性采取了去除
多糖的措施 ,实验材料研磨后加入溶液Ⅰ ,大量多
糖溶于溶液 Ⅰ而被除去 ,质量检测证明制备的
DNA多糖含量较少 , 质量较高 。同时 , 针对
Fosmid文库对 DNA分子量的要求 ,采取了简化
步骤 、轻柔操作的措施 ,虽然采用的是最常规的酚
抽提法 ,但由于步骤少 ,所制备的 DNA片段分子
量集中在 100 kb左右 ,且 DNA得率较高 ,能够满
足构建 Fosmid文库的要求。
图 3　克隆稳定性鉴定
1～ 6.0代克隆酶切 , ① ～ ⑥.100代克隆酶切 , M1.lambda
monocutmix, M2.λDNA/HindⅢ
Fig.3　Stabilizationofclones
1-6.digestionsof0 generationclone;①-⑥.diyestionsof
100generationclone;M1.lambdamonocutmix;M2.λDNA
HindⅢ
3.2　文库的偏倚性
无偏基因组文库是任意 DNA片段出现概率
均等的文库 ,无偏文库有利于基因组特性分析和
基因克隆。构建方法的不同以及基因组特性的差
异会造成文库的偏倚性。为构建无偏倚的条斑紫
菜 Fosmid基因组文库 , 我们在制备高分子量
DNA后 ,用机械剪切的方法获得断裂位点随机分
布的基因组 DNA片段。
条斑紫菜基因组 GC含量为 65.2%[ 17] ,用限
制性内切酶 NotⅠ分析插入片段分子量 ,该酶识
别位点序列为 GGGGCCCC,若碱基分布均衡 ,那
么条斑紫菜基因组平均每间隔 8 kb左右就会有
一个 NotⅠ的酶切位点 。所构建文库平均插入长
度为 35kb,那么理论上计算平均每个片段应该有
3个酶切位点。分析 20个克隆的插入片段 ,结果
显示 NotⅠ酶切片段共 57条 , (不包括载体片
段),其中最少 2段 ,最多 6段 ,平均约为 3段 ,比
理论值 4段要略少 ,这可能是由于甲基化影响了
酶切效率 ,加上个别酶切后小于 1 kb的片段在脉
冲场电泳中被忽略造成的。对重组 Fosmid克隆
的酶切检验证明了本研究所构建的条斑紫菜基因
组文库是无偏文库。
Deng等[ 6]构建了条斑紫菜孢子体 BAC文
库 ,该文库平均插入片段长度 65kb。用限制性内
切酶 NotⅠ进行酶切 ,从理论上推测除载体外平
均应该有 9个酶切片段 ,但实际的酶切片段只有
1 ～ 2个 , 与理论计算差异很大 。我们注意到
Deng等 [ 6]在构建 BAC文库时选用了限制性内切
酶 HindII制备重组片段 ,该酶的识别位点序列
为 AAGCTT,在基因组 AT丰富区域的酶切位点
多 ,而在 GC丰富区域酶切位点少。因此 ,用于构
建文库的重组 DNA片段可能有 AT偏向性 ,所构
建的 BAC文库 GC含量比条斑紫菜实际 GC含
量偏低 ,不易被 NotⅠ酶切 。
3.3　文库的覆盖率
按照条斑紫菜基因组大小为 290 Mb计 ,本
研究构建的覆盖率约为 2.78倍 。根据方程式Ⅳ
=Ln(1-P)/Ln(1-f)(其中Ⅳ为实际克隆数 , P
为筛选到某一克隆的几率 , f为某一单个克隆在
整个基因组中所占的相对比例),检测到某一稀
有基因的概率约为 93.8%。
以条斑紫菜的 18SrRNA, atpA, h2A, rbcL基
因为模板设计 PCR引物进行筛库。高拷贝的
18SrRNA基因在每个超级池都有克隆 ,其他 3个
基因也得到至少 1 ～ 2个克隆 。这证明了本文构
建的 Fosmid文库检测到基因的概率符合理论值 ,
完全达到构建高质量文库要求 。
综上所述 ,本研究成功构建了条斑紫菜覆盖
率比较高 、序列无偏倚的基因组 Fosmid文库 ,从
而为开展条斑紫菜基因克隆 ,内含子与基因上下
游调控序列分析 ,基因组物理图谱构建 ,基因组特
征分析 ,乃至全基因组序列测定奠定了基础。
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4013期　　　　　　　　　　　　　茅云翔 , 等:条斑紫菜基因组 Fosmid文库构建
ConstructionofgenomicFosmidlibraryofPorphyrayezoensis
MAOYun-xiang, CUIJing-jing, KONGFan-na
(KeyLaboratoryofMarineGeneticsandGeneResourcesUtilization, MinistryofEducation,
OceanUniversityofChina, Qingdao　266003, China)
Abstract:Genomiclibrarywithhigh-molecularweightinsertsisanessentialandpowerfultoolforgenomic
studies.AnunbiasedfosmidlibraryofPorphyrayezoensiswasconstructedandcharacterized.Thelibrary
comprised23 040 cloneswith100% recombinationfrequency.Therangeofinsertsizeofmostbulkof
clonesisfrom28 kbto40kbandtheaveragesizeisabout35kb.Therefore, thelibrarycoverageisabout
2.78 genome-equivalent.Thetheoreticalcoveragewasverifiedbysuccessfulyscreeningout4 randomly
selectedgenes, 18SrRNA, atpA, h2AandrbcL, onceatleastfromthesuperpoolswhichcoveredthewhole
libraryclones.Novariationswereobservedbycomparingtheoriginalcloneswiththoseofthehundredth
generationcultivatedsuccesively, indicatingthegoodfidelityandstabilityofthefosmidlibrary.Thisstudy
laidthefoundationsforgenecloningandgenomicresearchinP.yezoensis.
Keywords:Porphyrayezoensis;genomicFosmidlibrary;genecloning;genomics
402 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　33卷