全 文 ：第 24 期
收稿日期:2015 － 11 － 06
基金项目:云南省教育厅科学研究基金项目(编号:2014Y438);曲靖师范学院重点资助项目(编号:2011ZDZC1) ;曲靖师
范学院校级精品课程项目(编号:JPKC2013003，JPKC2014004)
作者简介:通讯作者，史俊友(1981 －) ，男，曲靖师范学院副教授，博士。
小叶三点金黄酮含量及其抗氧化活性测定
刘艳娥，刘迎梅，史俊友*
(曲靖师范学院，云南 曲靖 655011)
摘要:以小叶三点金为研究对象，采用 Al(NO3)3 － NaNO2 － NaOH 显色法对其总黄酮含量进行了测定，然后采用 DPPH 自由基清
除法对其抗氧化能力进行了研究。结果表明，小叶三点金中黄酮含量为 0． 31%。另外，小叶三点金总黄酮的抗氧化能力较强，
EC50 = 18． 62μg /mL。
关键词:黄酮;抗氧化;DPPH法
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1008 － 021X(2015)24 － 0059 － 02
小叶三点金［Desmodiummicrophyllum(Thunb．)DC］，又
名哮灵草、斑鸠窝、辫子草等名［1］，为豆科三蚂蝗属多年生草
本植物。在我国，其分布区域为江南、华南、西南各省份。医
药典籍和现代药理研究表明［2］，小叶三点金性凉、味甘，不仅
具有消炎、利尿，解毒，通经等功效，还具有止咳平喘、镇痛、
消炎、抗氧化、保护血管等作用［3 － 6］。成分预实验表明［7］，小
叶三点金含有萜类、香豆素、苯丙素、生物碱、黄酮、萜类等成
分，目前已经进行分离研究的为黄酮类成分，包括异荭草苷、
荭草苷、木犀草素、异日本獐牙菜素等九种物质［8］。旨在进
一步阐明小叶三点金中黄酮成分的情况，促进其开发利用，
本文首先采用 Al(NO3)3 － NaNO2 － NaOH 比色法对黄酮含
量进行测定，后采用 DPPH法对其抗氧化活性进行研究。
1 试剂与仪器
小叶三点金，采自云南省红河州金平县;芦丁，购自上海
顺博生物科技有限公司;乙醇，分析纯(天津市风船化学试剂
科技有限公司);Al(NO3)3，分析纯(淮南市化学试剂厂);
NaNO2，分析纯(淮南市化学试剂厂) ;NaOH，分析纯(天津市
风船化学试剂科技有限公司)、等。TU － 1810 紫外可见分光
光度计(北京普析通用仪器有限公司)、DLSB － 5L /25 低温冷
却液循环泵、分析天平(上梅特勒 －托利多仪器有限公司)、
XMTD －60000 型电热恒温水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)、
FW177 型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。
2 研究方法
2． 1 小叶三点金中总黄酮的制备［9］
将已阴干小叶三点金地上部分粉碎，分别称取 10 g 置于
250 mL圆底烧瓶中，加入 250 mL 75%乙醇溶液，于 85℃水
浴回流 2． 5h，趁热过滤，将滤渣继续提取两次，最后合并三次
提取液。用旋转蒸发仪旋干提取液，温度设置在 80℃，使其
能够去除提取液中的水和乙醇。然后用 60%乙醇溶解烧瓶
中的黄酮，再转移置 100 mL容量中，将残渣洗涤 2 ～ 3 次，洗
涤液转移至容量瓶中，加 60%乙醇定容。此溶液为样品待测
液，储藏于 － 4℃冰箱中备用。
2． 2 标准曲线的建立及样品中黄酮含量测定［10］
准确称取芦丁标准品 12． 5 mg，用 75%乙醇溶解定容至
50 mL容量瓶，得到 0． 25 mg /mL 的芦丁标准液。分别吸取 1
，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 ，8 ，9 mL的芦丁标准液定容至 10 mL 容量
瓶中，得一系列浓度为 0． 025，0． 050，0． 075，0． 100，0． 125，0．
150，0． 175，0． 200，0． 225mg /mL的芦丁标准液。分别取 2 mL
上述标准液至 10 mL 容量瓶中，然后向每个容量瓶中各加
5% NaNO2溶液 0． 6 mL，充分振荡后静置 6 min，再向每个容
量瓶中各加入 10% Al(NO3)3 溶液 0． 6 mL，充分振荡后静置
6 min，向每个容量瓶中各加入 10% NaOH溶液 3 mL，然后再
加入 75%乙醇溶液定容，充分振荡后静置 15 min，在检测波
长 510 nm 处测吸光度值 A。以芦丁浓度 C(μg /mL)对吸光
度值 A作图，得标准曲线方程。
用 2 mL吸量管吸取黄酮粗提液 2 mL 于 10 mL 比色管
中，采用与标准曲线绘制相同的方法显色，然后用 60%的乙
醇溶液稀释并定容。用紫外分光光度计在 507 nm波长处测
定小叶三点金中总黄酮含量，平行测定样品 3 次。
2． 3 DPPH 法测定抗氧化能力
此处实验方法主要参照杨怀霞等［11］的报道:准确秤取 7
mg DPPH，用乙醇定容至 100 mL，置于黑暗处。分别移取总
黄酮样液 0． 20、0． 30、0． 50、0． 70、1． 00、1． 20、1． 50、2． 00 mL
于 5 mL容量瓶中，加入配制好的 DPPH溶液 1mL混匀，然后
用乙醇定容，(实验样液质量浓度为:12． 39，18． 59，30． 98，
43． 37，73． 34，92． 93，144． 00 μg /mL) ，于室温暗处放置反应
30 min，在 517 nm下测得的吸光值为 A;以 1 mL 乙醇代替
DPPH溶液测得的吸光值为 A0;以乙醇代替样液所测得的吸
光度值为 A1;实验结果见图 2。试样对 DPPH的清除率为:
·95·刘艳娥，等:小叶三点金黄酮含量及其抗氧化活性测定
山 东 化 工
总黄酮浓度 /μg /mL
图 1 芦丁标准曲线
总黄酮浓度 /μg /mL
图 2 总黄酮对 DPPH自由基的清除作用
3 实验结果
3． 1 黄酮含量的测定
采用 Al(NO3)3 － NaNO2 － NaOH比色法，以芦丁为标样
建立标准曲线，在有良好的线性关系 0． 00 μg /mL － 56． 64
ug /mL 的范围内，芦丁质量浓度与吸光度得标准曲线回归方
程 Y = 0． 0099X + 0． 0067，R2 = 0． 9985。依据此标准曲线，
利用外标法得小叶三点金总黄酮含量为 0． 31% ．
3． 2 小叶三点金中粗黄酮对 DPPH的清除
1，1 －二苯基 － 2 －三硝基苯肼(DPPH)是一种具有三个
苯环结构的人工合成的稳定自由基，易溶于乙醇溶液并在其
中呈紫红色，于 515 nm 处有最大吸收。当与自由基清除剂
共存时，DPPH 的颜色会减退，其褪色程度与自由基清除剂
的清除能力及数量存在定量关系。由于 DPPH 法稳定性好，
操作方便，目前其已广泛用于体外抗氧化性评价。由图 2 可
知，在 10 ～ 90μg /mL 浓度范围内，随着粗黄酮含量的逐渐增
加，该提取物对 DPPH 的清除率逐渐增加;当粗黄酮质量浓
度≥92． 93μg /mL 时，对 DPPH 的清除率趋于平缓。实验质
量浓度范围最大清除率为 89%，EC50 = 18． 62?g /mL。所以，
小叶三点金对 DPPH自由基有很强的的清除能力。
4 结论
旨在进一步明确小叶三点金中黄酮含量，本实验首先采
用 Al(NO3)3 － NaNO2 － NaOH 比色法进行了测定，然后采用
DPPH自由基清除法对其抗氧化能力进行了研究。结果表
明，小叶三点金中黄酮含量为 0． 31%。另外，小叶三点金总
黄酮的抗氧化能力较强，EC50 = 18． 62μg /mL。
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(本文文献格式:刘艳娥，刘迎梅，史俊友．小叶三点金黄酮含量
及其抗氧化活性测定［J］．山东化工，2015，44(24):59 －60．)
·06· SHANDONG CHEMICAL INDUSTRY 2015 年第 44 卷