全 文 ：9 9 1 2年 第四卷 第 2期
化 学 研 究
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与 应 用
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4 No
.
9 1 29 2
尿素刀豆生物传感器的研制
刘思华
(西南师范大学化学系 , 重庆 63 07 15 )
李素群 郭鼎力
(甘肃农业大学基础部 兰州 7 30 070) (成都科技大学化学系 、 成都 6 100 65 )
摘 要
本文报告了尿素刀豆生物传感器的制备和性能 。 针率 4 6 . 0一钧 . 7m v . d ec 一 , 、 线性范围 2
X 1 0
一 月一 5 X 1 0 - 、 怕 l . L一 1 ,检浏下限 2 . 5 X 1 0一 ` mo l . L一 1。
该传感器用 于血液中尿氮含贵的浏定 ,此浏定结果与分光光度法浏定结果无 明显差异 。
关键词 : 刀豆粉 , 尿素 , 生物传感器。
前 一」一. . . . .. . 目口 .七1
血液中尿素的测定多采用分光光度法 。随着酶电极的发展 ,将脉酶固定在微孔气透膜上
制成脉酶复合氨电极 lj[ , 已应用于血液中尿素的测定中。 由于酶价格 昂贵 , 电极寿命短且必
须在低温下保存 ,实用上受到限制 。近年来用动植物新鲜组织材料作催化层制备生物组织传
感器 ,是化学传感器发展的一个新分支 。 刀豆是含脉酶最多的植物组织 , 每毫克刀豆粉含脉
酶约 2 . 1 . u图 . A o ol d 等人用刀豆与氨电极匹配 1 9 8 4 年首次制成了尿素的组织电极图 。 国
内这方面的研究基本未见报道 。 我们用国产刀豆与氨气敏电极结合制得了尿素刀豆组织电
极 ,对其性能进行了测试并初步应用它测定了血液中尿素含量 ,效果较好 。 此种电极与脉酶
电极相比 ,制作材料便宜 ,常温下易保存 ,且寿命较长 。
实 验 部 分
一 主要仪器 ,材料及试剂
1
. 仪器 P xJ 一 2 型离子计 (江苏金坛电子仪器厂 ) ; 5 01 氨气敏电极 (江苏电分析仪器
厂 ) ; cs 5 01 型超级恒温器 (重庆试验设备厂 ) ; 磁力搅拌器 (上海电光器件厂 ) 。
2
. 材料 : 刀豆
3
. 试剂 : 尿素 ( A . R ) ,三轻 甲基氨基 甲烷 ( A . R ) ,戊二醛等
本文于 19 91年 9 月 3 日收倒
一 4 9 一
( 1)缓冲溶液 : 含0 . l ml o.L 一 ` N a a的离子强度调节剂和0 . 1~ f o
.
L 一 ’ E DA T为络合剂 .
PH为 8 .0 7的0 .Z ml o.L 一 Ir T访一 H a溶液 。
(2 )标准尿素溶液 : 称取0 .0 30 3克经浓硫酸干燥后的 A.R 尿素 ,用上述缓 冲溶液配成
C (尿素 ) 二 5 . O0 X 10一加 ol . L一 ` 的标准溶液 。
( 3 ) 电极内充液 : 含 c ( N H `c l ) ~ 0 . 0 1m o l . L一 ` 和 c ( N a c 一) ~ 0一 m o z . L 一 ` 的溶液 。
二 尿素刀豆组织电极的响应原理
刀豆中脉酶催化尿素的水解反应是
N H ZC O N H Z+ ZH , o + [H
+ 〕= ZN H ; + + HC o 『
在一定的酸度下 N H才转变成 N H , ,它扩散通过气透膜进人含 N l王4cl 的 内充液中 ,使溶液酸
度发生变化 ,在平板玻璃内电极上产生响应 ,引起电位变化 . 此电位与测试液中底物尿素的
浓度符合 N er sn t 关系 E 二 E 。十 lS 。犷 脉 。
三 电极的制作
将刀豆研细 . 用 20 。 目的尼龙 网过筛 , 称取过筛后的粉末 l om g ,放于 N H , 气敏 电极的
气透膜表面上 ,用 1加 1的微量注射器注入 7 . 1川 缓冲溶液湿粉末成膏状物 ,并使此膏状物覆
盖电极头 ,再加人 25 写 7 . 1川戊二醛交联剂 ,迅速搅 动混匀悬浊液 ,在室温下放置 3 0 分钟 ,
然后置于水中浸泡 15 分钟以清洗过多的未交联好的粉末 , 在 0 . l m ol . L一 , p H ~ 8 . 70 的甘氨
酸溶液中浸泡 15 分钟 , 除去残留的戊二醛 。 将电极内装入 Zml 电极内充液后放入缓冲溶液
中储存于室温下备用 。
四 刀豆组织电极的响应曲线
将自制电极置于 10 · o oml 一系列标准尿素溶液中 ,其浓度从 1 x 1 0一 `一 5 x 1 0一加 01 .
L 一 , ,控制溶液温度为 25 . 0℃ , 在搅拌下测定平衡电位值 (表 1) 作 log C 服 一 E 的响应曲线如
图 l 。
表 1 电极响应与尿素含 ! 的关系
浓度 1. 0 0 2 . 00 5 . 00 1 . 0 0 2 . 0 0 5 . 00 ! . 0 0 X 2 . 00 5 . 00 1. 00 5 . 00
( m ol
.
L 一 ` ) 义 1 0一 ` 义 1 0一 ` X 1 0一 ` X 1 0一 X 1 0 一毛 X 10一 咭 1 0 一 , X 1 0一 X 10一 , X 1 0一 2 X 1 0一 2
电位流 (m V ) 一 6 . 00 一 1 . 8 0 十 7 . 0 0 + 1 6 . 0 十 30 . 0 十 49 . 0 + 6 6 . 0 + 7 3 . 0 十 9 0 . 0 十 1 0 2 . 乏+ 1 1 1 . 芝
根据对数回归方程
E ~ E O 十 习 lo 8 C
在线性范围 1 . 0 0 火 2 0一 `一 1 . o 0 x 1 0一 3 内求解得 E 。 = 2 ] 4 . 0 ,斜率 s = 4 9 . 7 m v . dec 一 , ,相关系
数 r = 0 . 9 9 9 。
结 果 与 讨 论
一最佳 p H 的选择
1
. 州 对尿素稳定性的影响
5 0 一
分别取 0 1. 0 0 mx州 为 9. 00, 8 , 7 0 , 5 . 4 0 , 8 . 1 0 , 7 . 8 0 , 7 . 5 0 的 0 . Zm o l . L一 ` T r ` 一 H C I缓冲
液 , 按标准增 量法的方式加入 1户 , 9川 , 0 . 09 0 n 、 l ,和 0 . 90 时 , 0 . 1 0 0 0mo l . L 一 , 的尿素溶液 ,相
应的浓度为 1 . 0 0 X 1 0一喻 o l . L 一 , , 1 . 0 0 X 1 0一 ha o l . L一 1 , 1 . 0 0 X 1 0一ha o l . L 一 ` 和 1 . 0 0 X
1 0一 ha of
.
L一 , ,用氨电极测定在响应时间为 7 分钟时的电位 . 得图 2 曲线 .
山图可知 , 当 PH 低于 8 . 柏 时 ,其电位值不随尿素浓度的增加而 升高 , 相反略有减少 ,
表 明在 p H 低于 8 . 相 时 ,尿素并未分解 。 p H ~ 8 . 40 时 ,电位值随尿素浓度的增加基本上保
持恒 定 。 p H ~ 8 . 70 时 ,在尿素浓度不超过 l 只 1 0一 3m ol . L一 , 时 , 电位也是恒定的 , 高于 I X
1 0一毓 ol . L 一 , 时 , 电极 有几毫伏的响应。 如果 p H 值达到 9 , 0 , 尿 素浓度只要 高出 1 只
1 0一俪 ol . L 一 , ,氨电极就有响应 ,表明 PH 二 9 . 0 时 ,尿素就可以自身分解产生氨 . 为了消除尿
素自身分解对组织电极测定的影响 ,组织电极的 PH 值选取 a . 40 一 8 . 70 为宜 。
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一 1 ,。 任t尿宋1
图 1 刀 豆组织 电机对尿素的响应 曲线
尿素浓度(m ol · -L 协
图 2 不 同 声 条件下用 氮电桩
侧定尿素浓度与电位的关 木
2
.
p H 对脉酶活性的影响
将制得的组织电极浸泡在 10 . OOml , 25 · 0℃ ,田 为 .9
的 0 . Zm o[ . L一 , rT ` 一 H cl 缓冲溶液中 ,待某一电位后 , 加入
液 , 此时尿素浓度为 x . o o x 1 0一 3 m o l . L一` ,记录电位 E ( m V )
0 0
,
8
.
7 0
,
8
.
4 0
,
8
.
1 0
,
7
.
8 0
,
7
.
5 0
0
.
1 0 0m x
,
0
.
1 0 0 0 m o 一, L 一 , 尿素溶
, 时间 (分 ) 。 得到 25 . 0℃组织 电
极在不同 声 条件下的响应动力学曲线图 3 .
根据酶活力测定方法 .s[ ` , 5〕从动力学 曲线可得到 PH 和酶相对活性关系 . 如图 心. 山图 扭
可知 ,酶的催化反应有一最适宜的 p H 范围 ,随着碑 值增大 ,酶的活性增高 . 当声 为 8
.
70
时 , 已达到 州 为 9 . 0 的相对活性 90 %以上 .
3
. 必 与平衡时间的关系
由图 3 可见
, 随着 PH 的升高 ,组织电极的响应加快
, 即酶催化反应的速度加快 。 当 p H
一 8 . 70 时 , 7 分钟后产生稳定的响应
. 图 5示 出了 PH 和平衡时问的关系 . 综上所述 : 州 为
8
.
70 可以保证酶的活性大 , 电极响应快
该电极使用的最佳 PH 为 .8 70 。
, 又能消除尿素 自身分解对组织电极测定的影响 。 则
二 最佳温度的选择
取 PH 二 8 · 7 0 , 0 · Zm o l·
L 一 , rT is 一 H cl 缓冲液 10 . 0 0而 , 将自制的组织 电极浸泡其中 ,待
某一电位后 ,加入 0 · 1 0 o om o l· L
一 ’ 尿素溶液 0 . 1 0 ml , 在不同温度下测定电位值。 记录不同
5 1 一
时间 ( mn i )的电位值 ( E )。得不同温度下组织电极的响应动力学曲线图 6。 由图 6可求得不同
温度下酶的相对活性如图 7.
以钊俐鱿州2( 311·ǎ欲à划豚令冲盆份pH 一 吕一。
PH 一 B . I O
P月 一 7. 8 0
p月 . . 7 5 0
”匆 7 0孙祠州川词
夕日汀
l -月 3
一 02 4 ` ’ 名 一 012 4 1丝 」生 ( m i血 )
图 32 5. 0℃ 组织电桩在不 同 PH 时的
响应动力学曲钱
。 `节万布丽而拓亩茄不厂图 4 晦的相对活性与 pH 的关来
n。力刀 0吞4 3引刘2份
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` 了 9一 1 1 3 15〔 m in )
图 5p H 一平衡时间关系图 困 6各种温度下 的动 力学曲线
(声 ~ 8 . 7 0, 0 . 2咖l . L 一 1 irT s 一H Q )
(未描成曲线的三个沮度 · 16 , 0℃ , x 28 . 0℃ , △37 . 0℃ )
从图 7 可以看出 ,酶反应速度和温度呈一定的曲线关系 。 随着温度升高 ,酶的活性逐渐
增大 , 当温度升高到 32 一 3 d℃时 , 酶的活性达到最大 , 超过 34 ℃活性又下降 。 在 25 . 0 ℃和
28
.
0℃时 ,酶的活性分别己达到最大值的 8峨. 6%和 91 . 4% ,考虑到酶的热不稳定性及实验
操作的方便 ,故组织电极的测定条件选 25 一 28 . C为宜 。
三 电极的选择性
刀豆是脉酶的主要来源 ,脉酶具有绝对专一性 .5[ 们 。 用 自制的刀豆组织电极测定 L 一苏
氨酸 , 甘氨酸 , L 一丙氨酸 , L 一酪 氨酸 , L 一赖氨酸及缩二脉等对尿素测定的干扰作用 ,发现
在 1 . 0 x 1 0一 ha ol . L一 ` 的等浓度条件下 , 除缩二脉引起 3 . Zm v 的变化外 , 其余均无明显的
响应 。 用刀 豆组织电极对缩二脉作响应曲线得图 8 .
由图可知 , 当缩二脉浓度低于 1 x 1 0一 3mo l . L一 ` 时 , 刀豆组织电极对此没有响应 . 尿素和
缩二脉的浓度比例约为 1 : 90 时 , 两者产生相等的电位 . 即只有当缩二脉的浓度远远超过尿
一 5 2 一
素的浓度时 ,它对尿素的测定才有明显的干扰 。
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图 7 温度和酶相对活性的关系曲线 图 8
一 5 科 一 3 一 2 ;
10 9 [尿素 ]
刀豆组 织 电极对尿素和缩二妹 的响应 曲线
(
. 尿素 , X 缩二脉 )
四 传感器的主要性能参数
在选定的实验条件下 , 刀豆组织电极对尿素的线性响应范围为 2 x 1 0一 `一 s x l o一 sm ol .
L 一 ` , 响应斜率为 46 . 0 一 49 . 7m v . dec 一 ` , 检测上 下限分别为 1 . 3 X 1 0一玩of . L 一 ` 与 2 . S X
拍一 ha .ol L 一 ’ , 响应时间 7一 1o m in , 电极寿命 4 天 , 电极的选择性极高 。
五 血液中尿素的测定
用 自制的尿素组织电极直接测定血清中的尿素 。 同时用传统的分光光度法测定 。 两种
方法经 t 检验 : t = 0 . 9 0 < t。 。 5 ( : ` , ; 一〕 ~ 2 . 0 5 ,没有明显差异 。 详见表 2 。
表 2 电极法与光度法测定血中尿氮的统计分析
方法 测定次数 ( )n 平均值 标准偏差 t o . 0 5( i 一, 1 . ) = 2 . 05
( m
·
m ol 尿氮 . L 一 ` )
电极法 l 5 4 ` 1 0 l 。 3 0 t ~ 0 。 90
分光光度法 1 5 4 . 3 1 1 . 2 8 t二 0 。 90
参 考 文 献
〔l〕M N以 SC j沮 田司 G . .G G u jb a ul t , nA al yt j以 。 emsr t汀
,
1 9 7 7
,
4 9 ( 6 ) 7 9 5一 7 9 8
〔2〕从 ^ . 肛 n o记 a闭 s 刀宜t ^ . 0恤cr , 残 o t以山 玩 t t , 198 4 , 6 ( 5 ) , 3 13
〔3〕凡 R d 韶 r 如一闷二 t ive e址tC r od e in A栩目y “国 。 姆 n血 tr y , 1 9 8 0 , 2
〔月 梁之彦 , 生理化学 , 上海科学技术出版社 , 1 985
〔5〕许根俊 , 酶的作用原理 , 科学出版社 , ] 98 3
〔6 j l 、 e~ E E匕r~
,
E吃即犯 H田司加确 , 1 9 6 9 , 2 , 6 4 8
一 5 3 一
T l { EP REP T A A RION O FJ A CB N h K E A IE AL U RB E A 10 S EN S O R
L翻 习动阴
( d e甲 r r mcn t of h C c而t s可 , oS u ht w c 吕t N o r m d U 范v姗 ty , 伪on 脚 n g 6 3 0 7 1 5 )
及 习呻胡
(I无少 r t n 、 c n t of 压飞s lc C o u r鸽 反ic n沈 . G an su A邵 iO Ut ul al U in v cT is ty , 7 3 0 0 7 0 )
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(责任编辑 : 李方 )
一 5 4 一