全 文 ：第 20卷 第 6期 中　　国　　兽　　医　　学　　报 Vol. 20, No. 6
2 0 0 0年 11月 Chinese　 Journal　 of　 Veterinary　 Science 　　　 Nov. 2 0 0 0
早期妊娠、发情周期及假孕小鼠子宫与荆豆素-Ⅰ的结合特性及激素调节
白玉妍 ,徐立滨 ,杨增明　 (东北农业大学 生命科学学院 ,黑龙江 哈尔滨 150030)
摘要: 应用免疫荧光技术以生物素化的荆豆素 -Ⅰ ( UEA-Ⅰ )为探针 ,检测其结合位点α-L-岩藻糖在小鼠妊
娠 1～ 8 d、假孕 1～ 6 d及发情周期子宫中的表达情况 ,并以摘除卵巢的小鼠为模型观察雌激素、孕酮对小鼠
子宫α-L-岩藻糖表达的影响。结果 , U EA-Ⅰ 的结合位点主要位于妊娠 1～ 4 d的子宫腔上皮及腺上皮中。在
假孕小鼠 , UEA-Ⅰ 的结合位点主要位于假孕 1～ 2 d的子宫腔上皮及腺上皮中 ,假孕 3～ 4 d时在这些部位的
结合逐渐减少或消失。 另外 ,在发情周期各期的子宫腔上皮和腺上皮中也发现很多 UEA-Ⅰ 的结合部位 ,在
发情期明显增多 ,当用雌激素处理时在这些部位的结合明显增加。 这些表明 , UE A-Ⅰ 在子宫腔上皮和腺上
皮上的结合位点可能与胚胎的存在与否无关 ,而是受母体雌激素的调节。但胚胎着床后 UEA-Ⅰ 的结合位点
消失 ,以后又在初级蜕膜中出现 ,表明 UEA-Ⅰ 的结合位点可能与胚胎着床后的蜕膜化反应有关。
关键词: U EA-Ⅰ ;子宫 ;发情周期 ;早期妊娠 ;假孕
中图分类号: S814. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1005-4545( 2000) 06-0601-04
　　收稿日期: 1999-09-30
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39700051)
　　作者简介:白玉妍 ( 1976～ ) ,女 ,硕士。
　　凝集素能特异性识别细胞膜结构中糖脂及糖
蛋白中的特异糖基 ,因而被用作探针来研究细胞
表面糖复合物结构中的糖结构及该结构在细胞中
的分布和组织定位。糖复合物中的糖成分已证实
在精卵识别和结合、精子在输卵管中的粘附及胚
胎着床等过程中起着很重要的调节作用 [1 ]。 Lee
等 [2 ]比较了妊娠与非妊娠小鼠输卵管和子宫中凝
集素的变化。 Peel等 [3 ]研究了 17种生物素在妊娠
10、 12、 15 d大鼠子宫中的分布。凝集素的结合位
点还被作为新生仔猪子宫发育的标志 [4 ]。荆豆素-
Ⅰ ( U EA-Ⅰ )在猪发情周期中子宫内膜和输卵管
内的分布已有报道 [5 ]。 但关于 UEA-Ⅰ 在小鼠子
宫早期妊娠、发情周期、假孕以及激素调节时的变
化等迄今未见详细报道。本试验应用生物素化的
U EA-Ⅰ 为探针 ,采用免疫荧光的方法研究了在
早期妊娠、发情周期、假孕小鼠子宫 U EA-Ⅰ的结
合位点及类固醇激素对其的影响 ,并对这些变化
与雌性小鼠生殖过程的关系进行了讨论。
1　材料与方法
1. 1　材料　昆明小鼠 ,在控光环境下饲养。将性
成熟的雌鼠与雄鼠合笼后 ,次日 8: 00～ 9: 00检查
雌鼠有无阴道栓 ,以见栓当日记为妊娠 1 d。分别
于妊娠 1～ 8 d处死小鼠 ,取出子宫进行固定。 为
了判断小鼠是否妊娠 ,见栓 1～ 4 d的小鼠 ,分别
用生理盐水冲输卵管及子宫检查是否有胚胎 ;见
栓 5、 6 d小鼠经尾静脉注射 1%台盼蓝溶液 0. 1
m L, 5 min后处死 ,子宫上着蓝色的部位即为着
床点。用阴道涂片法判断小鼠的发情周期 ,分别取
发情前期、发情期、发情后期及发情间期的子宫进
行固定。用雌鼠与输精管结扎的雄鼠交配分别获
取假孕 1～ 6 d子宫。激素处理组的雌鼠在麻醉条
件下切除双侧卵巢 ,恢复 2周后皮下注射激素。
17β-雌二醇及孕酮均溶解于芝麻油中 ,每只小鼠
注射 0. 1 m L。 试验共分 4组 ,每组 3只小鼠。
( 1)对照组 ,注射芝麻油 ; ( 2) E2组 , 100μg 17β -雌
二醇 ; ( 3) P4组 , 1 mg孕酮 ; ( 4) E2+ P4组 , 100μg
17β-雌二醇及 1 mg孕酮。 注射激素后 24 h分别
取材固定。
1. 2　试剂　生物素化的 UEA-Ⅰ ,北京中山生物
技术有限公司产品 ;抗生物素蛋白标记的异硫氰
荧光素 ( Av idin-FITC)、胎牛血清白蛋白 ( BSA) ,
均为美国 Sigma公司产品 ;其他试剂均为国产分
析纯试剂。
1. 3　方法　将上述各期的小鼠子宫用 4%甲醛 /
DOI : 10. 16303 /j . cnki . 1005 -4545. 2000. 06. 023
PBS固定 4～ 6 h,然后脱水并用石蜡包埋。所切 8
μm厚的切片贴于 APES处理过的载片上 ,经脱
蜡 , PBS洗 2次 ,在 1% BSA /Hepes-NaCL-Ca液
中孵育 30 min以封闭非特异性结合 ,用生物素化
的 U EA-Ⅰ ( 5μg /mL)孵育 2 h,洗去未结合的凝
集素后 ,加入 Av idin-FITC( 1∶ 100)孵育 1 h,再
洗去未结合的 Av idin-FITC,经碘化乙啶 ( 1 ng /
m L)复染 5 min,冲洗后用含 DABCO的荧光封片
剂封片 ,在荧光显微镜下观察。 在紫外光激发下 ,
U EA-Ⅰ 结合部位发绿色荧光 ,而切片上所有细
胞核的部位发红色荧光。按荧光显微镜下绿色荧
光强弱分阴性 (- )、弱 (+ )、中度 (+ + )、强 (+ +
+ )、很强 (+ + + + )。
2　结果
　　试验中 ,妊娠 4 d子宫及发情期子宫与
U EA-Ⅰ 呈强阳性结合 ,但当省去生物素化的
U EA-Ⅰ 时 ,在子宫腔上皮及腺上皮上都未见到
阳性反应 ,这说明本试验所用的免疫荧光染色方
法为特异性的。
2. 1　早期妊娠子宫与 UEA-Ⅰ 的结合　妊娠 1～
8 d小鼠子宫与 UEA-Ⅰ结合的情况见表 1。妊娠
1、 2 d时 , UEA-Ⅰ 与子宫内膜的腔上皮结合呈强
阳性反应 ,第 3天时子宫腔上皮的结合明显减弱 ,
至第 4天则阳性反应完全消失。然而在妊娠 1～ 4
d时 , UEA-Ⅰ 与子宫的腺上皮一直呈强阳性反应
(图 1A、 B、 C)。在妊娠 5 d子宫的各部位均未见到
U EA-Ⅰ 的结合部位。 在妊娠 6～ 8 d的子宫腔上
皮及腺上皮上均未发现 U EA-Ⅰ 的结合位点 ,但
第 6天子宫中胚胎周围的初级蜕膜与 UEA-Ⅰ 的
结合呈弱阳性反应 ,第 7、 8天着床点一侧的初级
蜕膜与 UEA-Ⅰ 的结合特性转为强阳性反应 (图
1D)。
表 1　早期妊娠时期小鼠子宫与 U EA-Ⅰ 结合特
性
子宫 早期妊娠时间
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d
腔上皮 + + + + + + + - - - - -
腺上皮 + + + + + + + + + + + + - - - -
基质 (蜕膜 ) - - - - - + + + + + +
肌膜 - - - - - - - -
图 1　 A. 妊娠 1 d小鼠子宫腔上皮、腺上皮均呈强阳性反应 , 200× ; B. 妊娠 2 d小鼠子宫腔上皮呈阳性反应 ,腺上皮
呈强阳性反应 , 200× ; C. 妊娠 4 d小鼠子宫腔上皮呈阴性反应 ,腺上皮呈强阳性反应 , 200× ; D. 妊娠 7 d小鼠
子宫 ,着床点一侧初级蜕膜呈强阳性反应 , 200× ; E. 假孕 2 d小鼠子宫腔上皮、腺上皮均呈强阳性反应 , 640× ;
F. 发情期子宫腔上皮 、腺上皮呈很强阳性反应 , 200×
2. 2　假孕子宫与 UEA-Ⅰ的结合　假孕小鼠子
宫与 U EA-Ⅰ 的结合情况见表 2。假孕 1、 2 d子宫
中 , U EA-Ⅰ 与子宫腔上皮及腺上皮均呈强阳性
结合 (图 1E)。 在假孕 3、 4 d的子宫中 ,仅在子宫
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腔上皮上见到很少的结合位点。 在妊娠 5、 6 d的
子宫未见到任何 U EA-Ⅰ 的结合位点。
表 2　假孕小鼠子宫与 U EA-Ⅰ的结合特性
子宫 假孕时间
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d
腔上皮 + + + + + + + + - -
腺上皮 + + + + + + - - - -
基质 (蜕膜 ) - - - - - -
肌膜 - - - - - -
2. 3　发情周期子宫与 UEA-Ⅰ 的结合　处于发
情周期各期的小鼠子宫与 UEA-Ⅰ 的结合特性见
表 3。在整个发情周期中 ,子宫的腔上皮及腺上皮
与 UEA-Ⅰ 的结合都呈阳性反应。在发情期 ,无论
是腔上皮还是腺上皮与 U EA-Ⅰ结合都呈极强的
阳性反应 (图 1F) ,而间情期子宫的腔上皮和腺上
皮与 UEA-Ⅰ 的结合都呈弱阳性反应。 发情前期
及后期子宫腔上皮和腺上皮与 U EA-Ⅰ 的结合均
强于发情间期。
表 3　小鼠发情周期各期子宫与 U EA-Ⅰ 的结合
特性
子宫 发情前期 发情期 发情后期 发情间期
腔上皮 + + + + + + + + + +
腺上皮 + + + + + + + + + +
基质 (蜕膜 ) - - - -
肌膜 - - - -
表 4　类固醇激素对小鼠子宫与 U EA-Ⅰ 结合特
性的影响
子宫 激素处理对照 E2 P4 E2+ P4
腔上皮 - + + + +
腺上皮 - + + - +
基质 (蜕膜 ) - - - -
肌膜 - - - -
2. 4　类固醇激素对小鼠子宫与 UEA-Ⅰ 结合特
性的影响　类固醇激素对切除卵巢的小鼠子宫与
U EA-Ⅰ结合的影响见表 4。对照组仅注射类固醇
激素的溶剂—芝麻油 ,即未受雌、孕激素影响的小
鼠子宫 ,其与 U EA-Ⅰ的结合呈阴性。注射 E2后 ,
子宫腔上皮及腺上皮与 U EA-Ⅰ的结合均呈中度
阳性反应。 注射 P4后 ,子宫中只有腔上皮与
U EA-Ⅰ 的结合呈弱阳性反应。当 E2和 P4共同注
射后 ,子宫腺上皮及腔上皮与 U EA-Ⅰ 的结合均
呈阳性反应 ,但强度较 E2要弱一些。
3　讨论
　　凝集素 U EA-Ⅰ已被广泛用于研究组织和细
胞中的岩藻糖 ( Fucose)残基 ,并且已用于分析雌、
雄小鼠生殖器官在各个不同时期糖或糖蛋白的变
化 [6 ]。 在本试验中 , U EA-Ⅰ的结合位点主要位于
子宫内膜的腔上皮及腺上皮中 ,这与在人子宫内
膜中的 U EA-Ⅰ 结合位点相近 ,主要位于上皮细
胞的顶部 [7 ]。 在发情牛的输卵管中 , U EA-Ⅰ的结
合位点也位于各段输卵管的上皮上 [8 ]。 只有当胚
胎着床后 , U EA-Ⅰ 的结合位点才由上皮上消失 ,
而在初级蜕膜上出现。在兔胚胎着床后 ,在胚胎周
围的初级蜕膜上也可见到 U EA-Ⅰ 的结合位
点 [9 ] ,然而在大鼠的子宫蜕膜中未见到 U EA-Ⅰ
的结合位点 [3 ]。
人的子宫内膜与 UEA-Ⅰ 的结合在月经周期
较弱 ,但妊娠过程中明显增强 [ 7]。在我们的研究
中 , U EA-Ⅰ主要位于妊娠 1～ 4 d的子宫腔上皮
及腺上皮中 ,而在假孕小鼠中 , U EA-Ⅰ的结合位
点主要位于假孕 1～ 2 d的子宫腔上皮及腺上皮
中 ,只是假孕 3～ 4 d时在这些部位的结合逐渐减
少或消失。另外 ,在发情周期各期子宫的腔上皮和
腺上皮中也发现很多 U EA-Ⅰ 的结合部位 ,在发
情期明显增多 ,当用雌激素处理时 ,在这些部位的
结合明显增加。 表明 UEA-Ⅰ 在子宫腔上皮和腺
上皮上的结合位点可能与胚胎的存在与否无关 ,
而是受母体雌激素的调节。 但胚胎着床后 UEA-
Ⅰ 的结合位点消失 ,以后又在初级蜕膜中出现 ,这
表明 UEA-Ⅰ 的结合位点可能与胚胎着床后蜕膜
化反应有关。
小鼠的发情周期主要受性激素的调节。发情
期主要是由于卵泡所分泌的雌激素作用而产生。
我们观察到发情期子宫、雌激素 ( E2 )处理后子宫
及妊娠 1、 2 d子宫与 U EA-Ⅰ 的结合部位无明显
差异 ,只是结合位点的强弱不同。程腊梅等 [9 ]观察
到家兔动情期子宫内膜的凝集素结合特性和雌激
素处理后的结合特性无明显差异 ,而且据其报道
两者的鞘糖脂含量组分也基本一致 ,这可能提示
α-L-岩藻糖的表达情况主要受雌激素调节。发情
前期、发情后期、发情间期与 U EA-Ⅰ的结合也都
呈阳性 ,只是强度降低 ,特别是发情间期呈极弱的
阳性 ,大概是因为雌激素分泌较之发情期减少 ,或
603第 6期 白玉妍等: 早期妊娠、发情周期及假孕小鼠子宫与荆豆素 -Ⅰ 的结合特性及激素调节
是由于有孕酮的存在抑制了雌激素的活性 ,使α-
L-岩藻糖的表达减少。
综上所述 ,小鼠子宫在自然妊娠 1～ 8 d、发情
周期、雌激素、孕酮处理后与 U EA-Ⅰ的结合特性
反映了 U EA-Ⅰ结合位点 α-L-岩藻糖在不同时期
雌性小鼠子宫中的特异性表达。可能说明α-L-岩
藻糖的存在一方面与小鼠的雌、孕激素作用有关 ,
另一方面与胚泡的出现、胎盘的形成及妊娠期多
种体液因素有关。但具体影响α-L-岩藻糖的环节
尚不清楚。
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Ulex Europeus (UEA-Ⅰ ) Binding and Hormonal Regulation in
Mouse Uterus during Early Pregnancy, Estrous Cycle and
Pseudopregnancy
BAI Yu-yan, XU Li-bin, YAN G Zeng-ming　 (College of Li fe Science,
　 Northeast Agricultural University , Harbin 150030,China)
　　Abstract: Ulex Europeus( U EA-Ⅰ ) w as used as a probe to study the expression ofα-L-Fuco se in
mouse uterus during ea rly pregnancy, pseudopregnancy and estrous cycle. Ovariectomized mice w ere
also used for the study on ho rmonal regulation o fα-L-Fuco se expression. The binding sites of U EA-Ⅰ
were detected bo th in luminal and g landular epithelia of mouse uterus on days 1-4 of early pregnancy.
During pseudopregnancy , the lev el o f U EA-Ⅰ binding sites w as high on day s 1 and 2, and low on days
3 and 4. The binding si tes of U EA-Ⅰ were detected in luminal and glandular epi thelia during the
est rous cycle, wi th the highest lev el to be at est rus. U EA-Ⅰ binding sites in luminal and g landula r
epi thelia w ere obviously increased by est ro gen. These results suggest tha t the binding sites of U EA-Ⅰ
in lumina l and glandular epithelia of mouse uterus may be under the control of mater nal hormones and
no t related to the presence of embryo s. The binding sites of UEA-Ⅰ may pla y a ro le in the
decidualization since they w ere detected during decidualization and no t detected following
implanta tion.
　　Key words: UEA-Ⅰ ; uterus; est rous cycle; ea rly pregnancy; pseudopregnancy
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