全 文 ：治疗白血病方面有其独特的优势。既往研究证实中
草药不仅能够缓解化疗药物的副作用 ,而且还可直
接杀伤白血病细胞 、诱导肿瘤细胞凋亡和向成熟细
胞分化 、逆转多药耐药性等 [ 9 ～ 12] 。本研究发现 YB-
SX能显著抑制 HL-60细胞的增殖和细胞内 DNA、
蛋白质的合成;同时还能诱导 HL-60向成熟方向分
化为粒细胞或单核 /巨噬细胞 。 YBSX方中所含补
骨脂素可损伤细胞 DNA,干扰核酸代谢 ,还可促进
淋巴细胞转化 ,逆转肿瘤细胞多药耐药性;蚤休功专
清热解毒 ,蚤休甙可干扰肿瘤细胞核酸合成;羊蹄对
白血病细胞的呼吸链中的脱氢酶有一定的抑制作
用 [ 9、 10、13] 。与传统化疗药不同 , YBSX在抑制白血病
细胞增殖并诱导其分化的同时 ,无骨髓抑制作用;反
而能够改善免疫功能 ,增强被化疗药物抑制的造血
功能 ,提高耐受能力 [ 14] ;具有良好的应用前景。
参考文献:
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(收稿日期:2006-01-13;修回日期:2006-04-05)
(本文编辑　狄亚敏)
文章编号:1008-9926(2006)04-0251-03　　中图分类号:R284.2　　文献标识码:A
利用稻瘟霉模型筛选铁刀木生物活性成分
吕泰省① ,易杨华② ,武晓娟 ,李森浩
(①中国人民解放军第 88医院　药剂科　山东　泰安　271000;②中国人民解放军第二军医大学药学院　海洋药物研究中心
　上海　200433)
摘　要:目的　利用稻瘟霉生物活性筛选模型 , 筛选铁刀木中具有生物活性的化学成分。方法　通过观察样品引起稻瘟霉分
生孢子或菌丝形态生长异常或生长抑制的情况 ,确定铁刀木中具有生物活性的部位以及化学成分。结果　确定了铁刀木树
干乙醇粗提物的生物活性部位为二氯甲烷和乙酸乙酯部位 , 其使稻瘟霉孢子菌丝体最小变形浓度(MMDC)分别为 125、63μg
· ml-1;筛选得到 2个具有生物活性的化合物(CS2、CS7), 其 MMDC分别为 63、31μg· ml-1。 结论　本模型首次用于铁刀木
活性成分的追踪分离 ,应用本方法筛选天然药物活性成分 , 方便 、快捷 、成本低 ,显示了广阔的应用前景。
关键词:稻瘟霉;铁刀木;活性筛选;活性成分
ScreeningofActiveConstituentsfrom CassiaSiameaLam UsingConidiaof
PyriculariaOryzae
LVTai-Sheng① , YIYang-Hua② , WUXiao-Juan, LISen-Hao
(①PharmacyDepartmentofthe88thHospitalofPLA, Taian　271000, Shandong　China)(②CenterofMarineDrugResearch, SchoolofPharmacy, SecondMilitaryMedicalUniversityofPLA, Shanghai　
200433　China)
·251·　解放军药学学报　第 22卷第 4期　　利用稻瘟霉模型筛选铁刀木生物活性成分　　　　　　　　　　吕泰省　　
① 作者简介:吕泰省(1965-),男 ,山东巨野人 ,副主任药师。研究方向:天然药物化学。 Tel:(0538)6209616
ABSTRACT:AimToapplyconidiaofPyriculariaOryzaeforthescreeningofbioactiveconstituentsfromCassiasiameaLam.MethodsBydetectingdeformationofmyceliagerminatedfromconidiaofP.OryzaeP-2b, bioactive
portionsandconstituentsfromCasiasiameaLamwereextractedandfractionated.ResultsTwobioactiveportions
(dichloromethaneandethylacetatefraction), theMMDC(minimummorphologicaldeformationconcentration)ofwhichis125and63μg·ml-1 respectivelyandfourbioactivecompounds(CS2, CS7), towhichMMDCis63, 31μg
· ml-1 respectively, werescreenedfromthisplant.ConclusionThisbioassaymethodwaseficientlyappliedtothe
primaryscreeningofbioactiveportionsfromCasiasiameaLamforthefirsttime.Beingconvenient, speedyand
cheap, thescreeningmodelissuitableforbioassayofactiveconstituentsfromnaturalmedicine.KEYWORDS:PyriculariaOryzae;CassiasiameaLam;Activebioassay;Bioactiveconstituents
　　铁刀木 (CasiasiameaLam.)为豆科木本植
物 ,广泛分布于我国的云南 、广东 、海南 、广西等地的
村边 、路旁 ,常做为行道树 。民间主要用于治疗风湿
性关节炎 、肠胃病 、脚扭伤等。国内未见有关铁刀木
化学成分和生物活性方面的报道。国外学者曾从铁
刀木的不同部位分离得到 30多个化合物 ,其中多为
三萜和蒽醌类化合物 [ 1] 。我们在广泛筛选抗肿瘤
植物药的过程中 ,发现铁刀木树干乙醇粗提物具有
显著的抗肿瘤活性 。近年来 ,日本东京大学开发建
立了以观察稻瘟霉的分生孢子或菌丝形态生长异常
或生长抑制为指标的简易微管活性测试体系 ,并成
功地筛选出了多种具有抗有丝分裂 、抗真菌活性的
新化合物 [ 2] 。其中 rhizoxin和 fusaridinA已开发为
抗肿瘤 、抗真菌新药 [ 3、 4] 。目前 ,应用此生物活性筛
选模型的主要有东京大学 、沈阳药科大学和第二军
医大学 3家单位。前者主要用于对微生物次级代谢
产物的筛选上;后 2家单位将其用于传统中药以及
海洋生物的活性筛选方面 ,已从不同植物和海洋生
物中追踪分离到了多个抗肿瘤活性化合物 。我们运
用这一有效的生物活性筛选模型 ,将其用于豆科植
物铁刀木的生物活性成分筛选 ,是对这种生物活性
筛选方法的新尝试。本文介绍铁刀木活性成分的跟
踪筛选 。
1　材料与方法
1.1　材料 　菌种:稻瘟霉(Pyriculariaoryzae)P-2b
菌株(第二军医大学)。培养基(%)土豆培养基
(蔗糖 1.5 ,土豆 20,琼脂 2.0),液体沙氏培养基(蛋
白胨 1.0, NaCl0.5, Glc4.0)。倒置显微镜 ,生化培
养箱 ,超净工作台 。铁刀木(采自云南西双版纳热
带植物园 , 经第二军医大学易杨华教授鉴定为
CassiasiameaLam.)。
1.2　方法
1.2.1　提取分离　铁刀木树干 10kg阴干粉碎 ,用
90%乙醇热提 ,将提取液浓缩 ,得浸膏 920g。将浸
膏混溶于水中 ,依次用二氯甲烷 、乙酸乙酯及正丁醇
萃取 ,分别得到浸膏 ,二氯甲烷部分 53g,乙酸乙酯
部分 38g,正丁醇部分 62g。
二氯甲烷部分浸膏 ,经硅胶柱层析分离 ,分别用
不同溶剂重结晶 , 得到化合物 CS1:β-谷甾醇
(260mg), CS2:白桦酸 (562mg), CS3:正二十八醇
(126mg), CS4:大黄酚 (60mg), CS5:羽扇豆醇
(260mg)。乙酸乙酯部分浸膏 ,经反复硅胶柱层析 ,
再经反相硅胶中压柱层析 ,对未得到完全纯化的部
分经 HPLC分离得到化合物 CS6:大黄酚-1-O-β-D-
吡喃葡萄糖苷(162mg), CS7:3, 3, 4, 5-四羟基二苯
乙烯(96mg)。正丁醇部分浸膏 ,经反复硅胶柱层
析 ,再经过反相硅胶柱层析及反相硅胶中压柱层析 ,
未得到纯化的部分 ,再用 SephadexLH-20分子筛进
行分离 ,得到化合物 CS8:2-甲基-5-丙基 -7, 12-二羟
基色酮 -12-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 (860mg), CS9:大
黄酚 -1-O-β -D-吡喃葡萄糖-(1※6)-O-β -D-吡喃葡萄
糖苷(11mg)。
1.2.2　样品溶液配制　样品 2.0mg超声溶解于 1.0
ml10%MeOH或 6% DMSO水溶液中 。如需要 ,可
将样品溶于 100μlMeOH或 40μlDMSO,再加水稀
释至 2.0mg· ml-1。
1.2.3　霉菌培养　菌种接种在土豆培养基上 , 26 ～
28℃培养 8 ～ 14d, 10d左右传代一次 。
1.2.4　活性筛选　每一菌斜面加蒸馏水 8 ～ 10ml,
刮下孢子 ,振摇片刻 ,用 4层纱布滤过 ,滤液中加入
2% ～ 3%液体沙氏培养基 ,镜检调整至孢子数为 40
000个 /ml。用连续加样枪加入 96孔板中 ,每孔加
孢子液 50μl,再用微量加样枪在第一行孔中加入
50μl样品溶液 ,依次倍半稀释为 1 000、 500、 250、
125、63、31、16、8μg·ml-1浓度 。每板均做阴性对照
(10% MeOH或 6% DMSO水溶液),空白对照(不
加入样品和试剂)和阳性对照 (Rhizoxin)。然后置
于 26 ～ 28℃培养箱中培养 18h,于倒置显微镜下观
察孢子和菌丝形态 ,确定活性结果 。
1.2.5　活性指标　根据菌丝的卷曲 、膨胀 、分枝过
·252· 　解放军药学学报　2006年 8月　第 22卷　第 4期　　　PharmJChinPLA　Vol22　No4　Aug2006　　　　　
多或念珠状等形态生长异常现象 , 可分为 6个等
级 [ 2] ,分别表示为:生长正常(-);生长抑制(×);轻
度变形(+);中度变形(++);高度变形(+++);
形态可疑(±)。根据以上指标 ,判断活性 ,确定最
小活性浓度或称最小变形浓度(minimummorpholog-
icaldeformationconcentration, MMDC)。一般认为 ,
对粗提物来说 MMDC≤500μg· ml-1 ,可以认为有
活性 ,单体化合物的 MMDC<125μg· ml-1即认为
有活性 [ 5] 。目前上市的多数抗肿瘤药物的 MMDC
一般小于 5μg·ml-1 [ 2] 。
2　结果
2.1　稻瘟酶模型筛选结果　对铁刀木 3个极性部
位(二氯甲烷 、乙酸乙酯 、正丁醇)以及从各部位中
分离得到的化合物 ,运用稻瘟酶模型进行生物活性
筛选 ,筛选结果见表 1。
表 1　铁刀木提取物各部位及其化学成分
的稻瘟酶活性筛选结果
Tab1　TheresultsofbioactiveportionsandconstituentsfromCassia
siameaLamscreenedbyconidiaofPyriculariaOryzae
样品 C(μg· ml
-1)
1000 500 250 125 63 31 16
二氯甲烷 × +++ ++ + ± - -
乙酸乙酯 × +++ +++ ++ + ± -
正丁醇 + ± - - - - -
CS1 ++ ± - - - - -
CS2 × +++ +++ ++ + ± -
CS3 ++ ± - - - - -
CS4 ± - - - - - -
CS5 ++ + ± - - - -
CS6 ++ + ± - - - -
CS7 × +++ +++ ++ + + ±
CS8 ++ ± ± - - - -
CS9 ± - - - - - -
　　注:“ -”:生长正常;“ ×”:生长抑制;“ +”:轻度变形;“ ++”:
中度变形;“ +++”:高度变形;“ ±”:形态可疑
2.2　结果分析　从铁刀木树干粗提物中 ,得到了 9
个化合物 , CS8和 CS9为新化合物 ,我们曾对其结构
鉴定进行了报道 [ 3、 4] 。稻瘟酶模型筛选结果显示:
铁刀木的生物活性部位为二氯甲烷和乙酸乙酯萃取
部分 ,其 MMDC分别为 125、63μg· ml-1;具有生物
活性的化合物 CS2(白桦酸)是从二氯甲烷部分离得
到的 ,其 MMDC为 63μg·ml-1 ,化合物 CS7(3, 3, 4,
5-四羟基二苯乙烯)是从乙酸乙酯萃取部分分离
得到的 , MMDC为 31μg·ml-1。
3　讨论
经过稻瘟酶模型筛选出具有生物活性的已知化
合物中 ,据报道 CS2(白桦酸)具有抗肿瘤及抗艾滋
病病毒的活性 [ 1] ;化合物 CS7 (3, 3, 4, 5-四羟基二
苯乙烯)具有抑制酪氨酸蛋白激活酶 p56lck的活
性[ 6] ,酪氨酸蛋白激活酶 p56lck在淋巴细胞增生以
及免疫功能中扮演着重要的角色 ,化合物 CS7可以
通过抑制该酶 p56lck的活性 ,防止肿瘤细胞的扩散
和转移。另外 CS7还具有抗真菌活性 , 其对真菌
Peniciliumcitrinum和 Rhizopusnigricans的 MIC为
25μg· ml-1。稻瘟酶模型筛选结果与文献报道的
生物活性结果基本一致 ,这也进一步验证了用稻瘟
酶模型进行生物活性筛选是可靠的。
本模型机理尚不完全清楚 ,经大量实验初步认
为 ,具有使稻瘟霉变形的化合物一般具有抗有丝分
裂的作用 ,可抑制微管的聚合或解聚 [ 2] 。作者首次
将该模型应用于铁刀木活性成分的跟踪筛选 ,并与
文献报道的结果进行了比较 , 两者结果基本一致。
本方法成本低廉 ,样品用量少 ,相关性好 。本方法阳
性率稍高 ,不易造成漏筛[ 7] 。而且 ,本方法方便快
捷 ,从加样到观察只需 18h,是一理想的初筛模型 ,
在天然药物抗有丝分裂 、抗真菌活性的跟踪筛选方
面 ,无疑有着广阔的应用前景 。
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(本文编辑　梁爱君)
·253·　解放军药学学报　2006年 8月　第 22卷　第 4期　　　PharmJChinPLA　Vol22　No4　Aug2006