全 文 ：　[ 收稿日期] 2001-03-07　　[ 修回日期] 2001-05-22
＊[ 基金项目] 国家自然科学基金资助项目(No.A39970325)
　现地址:广州呼吸疾病研究所 , 广州 510120
[ 文章编号] 　1000-4718(2002)07-0741-04
肿瘤坏死因子-α、刀豆素A及机械损伤刺激人支气管
上皮细胞系 H292表达基质金属蛋白酶-9＊
韩照升 , 　钟南山
(北京大学第一医院呼吸科 , 北京 100043)
　　[ 摘　要] 　目的:探讨人支气管上皮细胞在受到肿瘤坏死因子(TNF-α)、 刀豆素 A(ConA)及机械损伤刺激时
基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达情况。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和金属蛋白酶功能测定法
(gelatin zymograhpy),观察肿瘤坏死因子(TNF-α)、 刀豆素 A(ConA)及机械损伤刺激人支气管上皮细胞系 H292 后 4
个时点(2、 6 、 12 h及 24 h)MMP-9 表达和分泌的动态变化。结果:TNF-α、ConA及机械损伤刺激均可诱导人支气管
上皮细胞系 H292 表达和分泌MMP-9 , 无刺激时则不表达;单纯机械刺激后 2 h ,MMP-9 mRNA开始表达 , 12 h 达高
峰 , 24 h 仍有表达 ,但有所降低;ConA 与机械损伤联合刺激时 ,MMP-9 表达量明显高于其它各组。同时显示 , 仅在刺
激后 24 h表达MMP-9 活性 ,且以 ConA与机械损伤联合刺激组 MMP-9活性为最高。 结论:人支气管上皮细胞在
受到 TNF-α、ConA 及机械损伤刺激时 ,可表达分泌 MMP-9。
　　[ 关键词] 　支气管;上皮细胞;肿瘤坏死因子;刀豆球蛋白A;机械损伤;明胶酶 B
　　[ 中图分类号] 　562.2+5　　　[ 文献标识码] 　A
　　基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases ,MMPs)
是一类在其催化亚单位含锌离子 、结构高度同源 、主
要作用部位为基质的蛋白水解酶的总称 。由于它们
的主要作用是分解细胞外基质(包括胶原纤维 、弹力
纤维 、各种糖蛋白及蛋白多糖),故在炎症 、伤口愈
合 、组织重塑 、细胞迁移 、血管生成等各种病理 、生理
过程中发挥重要作用 。MMPs 可分为 4个亚型:胶原
酶 、明胶酶 、基质溶解素和膜型金属蛋白酶 。其中
MMP-9/ 明胶酶 B在炎症过程中发挥重要作用。近
年来研究表明[ 1-4] MMP-9 在支气管哮喘慢性气道
炎症中发挥非常重要的作用 ,已成为支气管哮喘研
究的一个热点。
已知多种细胞(单核/巨噬细胞 、嗜酸性粒细胞 、
中性粒细胞 、成纤维细胞 、血管内皮细胞及肿瘤细
胞等)均可产生 MMP -9。在支气管哮喘发病过程
中 ,支气管粘膜下大量嗜酸性粒细胞浸润与细胞高
表达 MMP -9有关[ 3] 。已知 MMP -9 可分解 Ⅲ型 、
Ⅳ型 、 Ⅴ型胶原纤维 ,从而降解基底膜 ,促使嗜酸性
粒细胞等炎症细胞气道内浸润。目前已认识到:作
为一线生理屏障的支气管粘膜上皮细胞 ,在哮喘气
道炎症中亦起着十分重要的作用。是否支气管上皮
细胞在炎症损伤环境中表达分泌 MMP -9 ,从而进
一步促进炎症的发生发展 ,是本文拟研究的主要问
题。
材　料　和　方　法
1　细胞培养
人支气管粘膜上皮细胞系 H292 为英国南安普
顿大学哮喘研究中心惠赠。H292 在含有 10%胎牛
血清的 RPMI1640 培养基中培养 ,然后接种至 12 孔
板中。当细胞 80%汇合成片时 ,换用无血清培养基 ,
12 h后进行各种刺激 ,取 4个时点(刺激后 2 h 、 6 h 、
12 h 、24 h)提取细胞总 RNA ,同时收集 1 mL上清待
检。共分 6组:①无刺激组(对照组);②TNF-α(106
U/L)(美国 RδD 公司)组;③ConA(5 mg/L)(美国
Sigma公司)组;④TNF -α(106 U/L)+机械刺激组
(机械划痕);⑤ConA(5 mg/L)+机械刺激组(机械划
痕);⑥机械刺激组(机械划痕)。
2　RT-PCR
采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总 RNA ,立即
进行逆转录 。MMP-9引物由广州华运公司合成:上
游引物:5-CACTGTCCACCCCTCAGAGC-3,下游引
物:5-GCCACTTGTCGGCGATAAGG -3。PCR反应
条件:94 ℃30 s , 58 ℃ 30 s , 72 ℃ 60 s ,35循环 ,72
℃延伸 10 min。扩增片段长度 243 bp。同时做 β -
actin PCR作为内参照 ,反应条件:94 ℃1 min , 54 ℃
·741·中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysiology　2002 , 18(7):741-744
1 min , 72 ℃2 min ,28循环 ,72 ℃延伸 10 min 。扩增
片段长度 838 bp。
3　金属蛋白酶功能测定(gelatin zymography)
制备 8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(含 1 g/L 明胶
作为酶的底物)作为分离胶 , 4%SDS-聚丙烯酰胺凝
胶作为浓缩胶 ,上样 20μL(细胞培养上清)后进行电
泳(电压 145V)。凝胶用洗液(50 mmol/L Tris pH7.5 ,
5 mmol/L CaCl2 , 25 g Triton X-100)洗 30 min ,孵育
过夜 ,考马斯亮蓝 G250染色 ,脱色(明胶被染成蓝
色 ,若其被酶分解则在蓝色背景上出现无色条带),
照相 。
结　　果
1　各种刺激因子诱导人支气管上皮细胞系 H292后 4
个时点MMP-9 mRNA表达量比较(见图1A-1D)
　　在 4个时点(2 h 、 6 h 、12 h 、 24 h),均未发现对
照组细胞表达MMP-9 ,TNF-α(106 U/L)、ConA(5
mg/L)、TNF-α106 U/L+机械损伤 、ConA 5 mg/L+
机械损伤及单纯机械损伤均诱导 H292 细胞表达
MMP-9;单纯机械损伤 2 h后即出现 MMP -9表达 ,
12 h达高峰 ,24 h仍有表达 ,但有所下降。ConA+机
械损伤组MMP-9表达量明显高于其它刺激组 。
Fig 1　Agarose gel eletrophoresis of MMP-9 RT-PCR after H292 stimulated.
1A:2 h after stimulation;1 B:6 h after stimulation;1C:12 h after stimulation;1D:24 h after stimulation.
M:Marker(243 bp);1:negative control;2:group without stimulation;3:TNF-α106U/ L group;4:ConA 5mg/ L group;5:TNF
-α106 U/ L+mechanical injury group;6:ConA 5 mg/ L+mechanical injury group;7:mechanical injury group.
图 1　刺激 H292后各个时点 MMP-9 RT-PCR凝胶电泳图
2　金属蛋白酶功能测定(见图 2A-2D)
各种刺激因子刺激H292细胞后2 、6 、 12 h均未
见MMP-9活性 ,刺激后 24 h始见MMP-9活性 ,且
ConA +机械刺激组MMP-9 活性明显高于其它刺激
组;对照组未见MMP-9 活性 。
讨　　论
近年来研究显示[ 1-4] :MMP-9 在支气管哮喘
患者的诱发痰液 、支气管肺泡灌洗液 、经支纤镜粘
膜活检组织及体外培养的巨噬细胞中均大量表达 ,
且MMP-9的表达量与嗜酸性粒细胞的数量呈显著
正相关 ,与 Ⅲ型 、 Ⅴ型胶原纤维及 tenascin 的量呈显
著正相关 ,与气道高反应性呈显著正相关 ,而与气流
受限的程度呈显著负相关 。可见 ,MMP-9 在支气管
哮喘慢性气道炎症及气道重塑中发挥重要作用。
　　MMP -9来源于多种细胞(炎症细胞和结构细
胞),本研究证明 ,支气管粘膜上皮细胞在不受到刺
激时不表达MMP-9 ,而在受到炎症因子(TNF -α)、
过敏刺激因子(ConA)及机械损伤刺激时均表达分泌
MMP -9。已知支气管上皮损伤脱落是哮喘气道炎
·742·
Fig 2　Assay of cell supernatant Zymography after H292 stimulated.
2A:2 h after stimulation;2B:6 h after stimulation;2C:12 h after stimulation;2D:24 h after stimulation.
M:Marker(243 bp);1:negative control;2:group without stimulation;3:TNF-α106U/ L group;4:ConA 5mg/ L group;5:TNF
-α(106 U/ L)+mechanical injury group;6:ConA 5 mg/ L+mechanical injury group;7:mechanical injury group.
图 2 　刺激 H292 后 4 个时点细胞上清 Zymography 测定
症的一个重要特征 ,我们的研究表明 ,气道上皮细胞
受机械损伤即可表达 MMP-9 ,且在与过敏刺激因子
共同作用下 ,此种表达进一步增强;同时 zymography
显示 ,上皮细胞在受到上述因子刺激后 24 h可表达
MMP-9活性 ,提示 ,气道收缩 、机械性牵拉及免疫炎
症导致损伤的支气管上皮细胞生成 MMP -9 ,上皮细
胞表达MMP-9活性对于进一步促进炎症细胞在局
部的浸润 、聚集 ,强化并延长局部炎症反应可能具有
重要地位 。
　　那么 ,TNF-α、ConA 及机械损伤刺激诱导支气
管上皮细胞表达分泌 MMP-9 的机制是什么呢 ?已
有研究证实 , TNF -α与其受体结合 , 诱导胞浆内
PGE2-cAMP 的产生 ,蛋白激酶 C(PKC)因之激活 ,信
号逐级传递至胞核内 ,从而启动MMP-9基因转录。
MMP-9的转录调控很复杂 ,其基因的启动子包含一
个与转录起始位点相邻近的转录调控元件(transcrip-
tional regulation element ,TRE),它是受到 TNF-α刺激
后基因转录的必需元件 。MMP -9 基因上游调节元
件中 ,尚含有核因子-κB(nuclear factor-κB , NF -
κB)、激活蛋白 -1(activation protein-1 , AP -1)、
SV40 virus promoter-1(SP-1)蛋白的结合位点 ,它们
与TRE 协同作用 ,从而启动MMP-9基因转录[ 5] 。
ConA诱导 MMP-9 的产生依赖于 PGE2-Camp
途径。机械损伤之所以诱导 MMP-9 的产生 ,可能
是由于损伤破裂的细胞释放出某些细胞因子 ,通过
上述机制诱导MMP-9的表达分泌。
研究发现 ,其它炎症因子(如 IL-1β 、 IL -6 、 IL
-8 、 IL-12 、IL-17 、GM-CSF)及生长因子(PDGF 、
EGF 、 bFGF 、 TGF -β1 等)均可诱导多种细胞产生
MMP-9[ 6-9] 。
总之 ,支气管粘膜上皮细胞在受到各种炎症因
子及机械损伤刺激时 ,可表达分泌 MMP-9 ,通过降
解基底膜 ,从而促使炎症细胞气道内浸润 。所以可
通过保护粘摸上皮细胞和(或)抑制 MMP -9 的转
录 、翻译及激活(如基因敲除技术 、反义 cDNA 技术 、
蛋白合成抑制剂及金属蛋白酶特异抑制剂 TIMP)等
途径 ,以达到阻滞嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润的
目的 ,从而为支气管哮喘的治疗开辟一条新的道路 。
[ 参　考　文　献]
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TNFα, ConA and mechanical injury stimulate matrix metalloproteinase-9
expression in human bronchial epithelial cell line h292
HAN Zhao-sheng , ZHONG Nan-shan
(Department of Respiratory Medicine , the First Affiliated hospital of Beijing University , Beijing 100043 , China)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:To study the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)in human bronchial
epithelial cell treated with TNF-α, ConA and mechanical injury.METHODS:RT-PCR and gelatin zymography were
performed to observe the dynamic expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in human bronchial epithelial cell
line H292 at different timepoint(2 h , 6 h ,12 h , 24 h)after stimulation with TNF -α, ConA and mechanical injury.
RESULTS:Human bronchial epithelial cell H292 expressed and secreted matrix metalloproteinase-9 in the presence of
TNF-α, ConA and mechanical injury.On stimulation with mechanical injury alone , MMP-9 was initially expressed at
2 h , peaked at 12 h , and decreased at 24 h.Furthermore , on stimulation with combination of ConA and mechanical in-
jury , theMMP-9 mRNA expression was the highest among in all the groups.Zymography show that the MMP-9 activi-
ty appeared just at 24 h timepoint , and was highest at the group of combination of ConA and mechanical injury.CON-
CLUTION:Human bronchial epithelial cell expressed and secretedMMP-9 when treated with TNF-α, ConA andme-
chanical injury.
[ KEYWORDS] 　Bronchi;Epithelial cells;Tumor necrosis factor;Concanavalin A;Mechanical injuries;Gelati-
nase B
·744·