全 文 ：第 , 卷第 2期
19 9 2 年 12 月
长 沙 水 电 师 院 学 报
JO U R N A L O F C H A N G S H A N O R M A L U N I V E R S I T Y
O F W A T E R R E S O U R C E S A N D E L E C T R I C PO W E R
V o l刀 N o , 2
D e C
.
19 9 2
从白刀豆籽中提取 ’ P H A 的研究
林作华 任炳炎
(湖 南 医 专 )
摘 要
本文以鸡仔豆 、 雪山豆作对照 ,从长沙产的白刀豆籽中提取植物血球凝集素(P H A )用于人体外周血
的培养实验 , 结果表明 : 当提取 P H A 液的方法一致时 , 在每 10 m L R P M I 1 6 40 培养液中所加鸡仔
豆 、 雪山豆 、 白刀豆籽制取的 P H A 量分别取 0 .2 m L , 0 . 3 m L 和 .0 4 m L , 在相同的培养条件下 , 用
于人体外周血的体外培养实验中 , 其分裂指数相近似且效价高 .这为研究人类遗传病 、 做人体外周血的
体外培养实验 , 提供了龋怒方便 、 效果显著的植物血球凝集素 .
主题词 : 植物血球凝集素 ; 刀 豆球蛋 白 ; 种子 / 白 刀 豆籽 ; 效价 ; 分裂指数
中图法分类号 : Q 94 6
众所周知 , 植物血球凝集素 (P H A )可促使人或哺乳动物的细胞进行分裂 , 是由于白血球细胞
膜发生了改变 , 随后使培养液中的某些物质穿透进人细胞 , 并刺激细胞进行有丝分裂 . 而 P H A
的促分裂作用是由于淋 巴细胞的复原 v( ej vu en a it o n) . 在人体外周血的体外培养实验中 , 加人适
量的 P H A 液 , 可以凝集人体外周血中的红细胞 , 促使成熟的淋 巴细胞转变成具有分裂能力的淋
巴母细胞 . 通过一定的药物处理后 , 可获得大量的中期分裂相 (染色体 ) , 以供分析和研究 .
P H A 是从豆科植物中提取的一种糖蛋 白物质【’ 】, 市面上有串售 . 但是国内外尚未有统一的规
格 , 而且制成 的粉剂有效期短 , 价格也较高 . 受各方面条件的限制 , 采购来 的粉剂往往因过期失
效 , 导致实验效果不理想甚至失败 . 为了便于科学研究和教学工作的正常开展 , 我们从长沙产的
豆科植物中选用一种 P H A 含量高的种子来提取 P H A , 结果表明切实可行 .
1 材料和方法
L l 实验材料
a
. 白刀豆 ( C a n a v al ia en is fo mr is) 豆科 , 亦称 “ 洋刀豆 ” , 一年生草本 . 矮生或半蔓生 . 脐长
为种子长度的一半 , 性喜温暖不耐寒 , 春播秋收 , 长沙地区到处都有栽培 .
收稿日期 : 19 2刁-6 26
」
第 7卷第 2 期 林作华 . 任炳炎 : 从白刀豆籽中提取 PH A 的研究 · 2 0 7·
b
. 已经配制好的不含 PH A 液的美 国产 R PM I 1 640 培养液 , 无菌分装成小瓶 , 每瓶装
P R M I 1 64 0 培养液 1 0 m L (培养瓶的容量为 2 0 m L ) .
L Z P H A 的提取方法
据文献 [21 , 考虑到湖南长沙地区气候多潮湿 , P H A 液的提取过程中易受空气中的霉菌和其
它细菌污染 , 从而影响 P H A 的效价 , 以及我们实验室的条件 , 在提取 P H A 液的方法上作了进
一步改进 , 其方法是 :
取经过严格挑选无发霉变质和虫蛀的豆子适量 , 用 75 %酒精棉球擦干净种皮 (不要剥掉种
皮 ) , 然后用灭菌生理盐水 冲洗种子 . 主要去除种子外表皮止的细菌 、 农药等有害物质 , 而后置
于 4 0 ℃ 一 60 ℃温箱中烘干 , 用洁净研钵或专用小型粉碎机制成豆粉备用 .
1
.
2
.
1 简易制取法 (用灭菌生理盐水浸取法 )
称取豆粉 or g , 盛置 30 m L 烧杯中 , 加人 20 m L 无菌生理盐水 , 置磁力搅拌器上 , 低温
搅拌约 l h , 而后放于 4 ℃冰箱中加盖静置两天以上 , 每夭上午和下午分别进行磁力搅拌约 20
m in
. 两天后 , 将溶液移人离心管内 , 以每分钟 3 0 0 转室温下离心 30 m in , 取上清液倒人 30 0
m L 烧杯中 , 然后加无菌生理盐水至 20 m L , 混匀后 , 用 G S 漏斗抽滤 , 无菌罩 内分装成小
瓶 , 于 0 ℃以下冻存备用 , 有效期为 2 个月左右 .
1
.
.2 2 精取法 (酒精一乙醚抽取干燥法 )
称取豆粉 10 9 放于 50 m L 烧杯中 , 加人 40 m L 灭菌生理盐水 , 置磁力搅拌器上低温搅
拌约 l h , 然后加盖静置 4 ℃ 冰箱中静置两天以上 , 并且每天上午和下午各龋鉴一次用磁力搅拌
约 3 0 m i n . 置冰箱中两天后龋鉴来离心 3 0 m i n , 转速为 3 0 0 0一 3 5 0 0 转 / m i n . 取上清液 , 按每
10 0 m L 上清液加 40 m L 无水酒精的 比例加人无水酒精 , 于 。 ℃一 4 ℃下磁力搅拌约 30 m in . 然
后在 0 ℃一 4 ℃下离心 30 m in , 转速为 3 00 一 3 50 转 / m in . 取上清液 , 加人乙醚一无水酒精 ( 1
:
9)
, 混合液适量 (按 10 0 m L 上清液加人 1 : 9 的乙醚一无水酒精混合液 170 m L 的 比例加人 ) ,
于 4 ℃ 冰箱 中搅拌均匀 , 然后在 O ℃一 4 ℃下离心 30 m in , 转速为 2 0 0 转 / m in , 弃去上清
液 , 留下沉淀物 . 将沉淀物龋鉴后 , 经低温抽气烘干后 , 使其呈粉末状物 , 无菌分成小量包装 ,
置一 20 ℃低温保存 . 一般可保存 1一 2 年 . 使用时 , 将干粉加生理盐水制成 0 . 8%稀释液 (即每毫升
生理盐水 中含 P H A 干粉 8 m g ) . 保存于 4 ℃冰箱中备用 , 有效期亦为 2 个月左右 .
L 3 效价检验
为了验证长沙 白刀豆籽提取 P H A 的效果 , 采取无菌操作抽取人体外周血 5 m L 分别注人 12
小瓶已经 配制好的不含 P H A 的 R PM I 1 640 细胞培养液 中 , 每瓶中加以适量肝素抗凝的全血
.0 4 m (L 培养瓶的容量为 20 m L , 培养液为 10 m )L , 轻轻摇匀 . 将加了抗凝血的 12 小瓶培养基分
作三组 , 每组 4 小瓶 . 第一组加广东产鸡仔豆提取的 P H A 液 , 第二组加 四川产的雪山豆提取的
P H A 液 , 第三组加长沙产白刀豆籽提取的 P H A 液 . (三种豆籽提取 P H A 液的方法都用上述 “简
易制取法 ” ) . P H A 液的使用量分别为 0 . l m L / 瓶 、 .0 2 m L / 瓶 、 O . 3 m L / 瓶 、 .0 4 m L / 瓶 . 在
3 7 oC 隔水式恒温培养箱 中培养 7 2 h . 在培养至 6 8一 7 0 h 加秋水仙素 ( C o l e h i e i n e ) , 每瓶中加 0 . 4
伍L , 终浓度为每 m L 培养液中含秋水仙素 4 拼9 . 继续置恒温培养箱中培养至 72 h 后 , 收获细
胞 , 经滴片 、 烤片后用 G ie m as 染液染色 , 油镜下计数 30 一 50 个细胞 , 求其分裂指数 (中期分
裂相所 占的百分数 ) .
2 结果与讨论
从此项对 比实验 中 , 可以看到 , 当细胞培养条件相同 , P H A 的提取方法一致时 , PH A 的效
长 沙 水 电 师 院 学 报 19 9 2年 1 2月
价是很不一致的 .不 同的豆科植物中 , P H A 液提取的最佳效价 , 与其使用液量多少密切相关 (附
表 ) .
附表 三种 P H A 液对比实验结果
三种豆子提
取的 PH A 液
P H A 用量
(m L )
血液标本
(例数 )
年 龄
(平均值 )
培养过程中
有无凝血现象
分裂指数 (% )
仅指中期分裂相
无0,J、内,鸡仔 豆液
雪 山豆液
白刀豆籽液
0 I
0
.
1
0
.
1
2 3 14
2 3
`
14
2 3 14
2%
l %
0 5%
%
ù、曰,乙1.1无有鸡仔豆液
雪山豆液
白刀 豆籽液
2 3 14
2 3 14
2 3
.
14
00nU
凡j,、,一2
;
.0
%
,J尸、ú,`0no飞ú,JfJ,、飞曰J,
:
0
ǎ
10鸡仔豆液
雪山豆液
白刀豆籽液
2 3
.
14
2 3
.
14
2 3
.
14
鸡仔豆液 0 .4 ’ 30 23 . 14 有 2%
雪山豆液 0 鸿 3 0 2 3 . 14 有 2%
白刀豆籽液 0 4 3 0 2 3 . 14 无 5%
从上表可以看出 , 当 P H A 液的用量过大时 , 也可以使白细胞凝集 , 在细胞培养过程中 , 产
生凝血现象 , 细胞就生长不好 , 分裂指数低 , 从而影响 P H A 的效价 . P H A 的用量过小 , 则不能
有效地将成熟的淋巴细胞较好地转化成具有分裂能力的淋巴母细胞 , 细胞培养过程中虽然看不到
凝血现象 , 但在显微镜下可以观察到细胞生长不均匀 , 中期分裂相太少 , 分裂指数不高 , 不利于
分析和研究 . 从鸡仔豆 、 雪山豆和 白刀豆籽中制取的 P H A 液的量分别取 0 . 2 m L , 0 . 3 m L 和 0 .4
m L 时 , 细胞生长均匀 、 分裂指数高 , P H A 的效价也高 , 有利于分析和研究 .
3 小 结
用长沙产的白刀豆籽提取的 P H A 液做人体外周血的体外培养实验 , 效果显著 , 可与鸡仔
豆 、 雪山豆提取的 P H A 媲美 , 凡出产 白刀豆的地区均可就地龋腮进行提取 , 解决科研与教学所
需 , 盛产白刀豆地区亦可将 P H A 液作为一项资源进行开发 , 以利于细胞遗传学实验的顺利进行
. 但白刀豆提取的 P H A , 与目前国内外商品化生产的 P H A 一样 , 存在有效期短的问题 , 有待进
一步研究 .
今 考 文 献
.
S e n g u P t a S
,
S e n g u P t a L R
.
P r o t e i n P r o if le a时 s t im u la t io 刀 P o t e n t ia l o f P a r t ia l ly P u ir fl e d l e c t in s fr o m t w o v a r ie it e s o f
p h a s e o lu s v u lg a r i s L
.
I n d ia 、卜J一 xE p一 B i o i , 19 9 1 , 2 9 ( 2) : 11 6一 1 19
2 夏家辉 , 李麓云 . 染色体病 . 北京 : 科学出版社 , 19 89 . 巧一 42
(本文责任编辑 谢松佃 )
第 7卷第 2期 林作华 仟炳炎 : 从 白刀 豆籽中提取 P H A的研究 0 9 2
AB S T R AC T I O N O F P H A F R O MC A N AV A LI A E N S I F O R MI S
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e s e e d s o f t h e C a n a v a l i a e n s i fo r m i s P r o d u e e d i n C h a n g s h a t o b e
u s e d i n e u l t u er
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4 m L P H A s w e r e o b t a i n e d
r e s P e e t iv e l y i n ve e卿 10 m L R P M I 1 6 4 0 m e d i u m a d d e d w i t h t h e s e e d s o f t h r e e P l a n t s ( P h a s e o l u s
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a t e l y e q u a l a n d w i t h h ig h e if e a e y i n i n v i t r o e u l t u r e o f h u m a n
P e r iPh e r a l b l o o d
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