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榼藤不同用药部位的药理活性及化学成分的对比研究



全 文 :收稿日期:2015-09-21; 修订日期:2016-02-20
基金项目:国家自然科学基金(No. 81073150);
湖北省自然科学基金创新群体项目(No. 2013CFA013)
作者简介:张胜男(1989-),女(汉族),河南登封人,中南民族大学药学院
在读硕士研究生,主要从事中药民族药药理研究工作.
* 通讯作者简介:梅之南(1970-),男(汉族),湖北麻城人,中南民族大学
药学院教授,博士学位,主要从事民族药物药效物质基础研究工作.
榼藤不同用药部位的
药理活性及化学成分的对比研究
张胜男,秦 思,万 青,熊 慧,梅之南*
(中南民族大学药学院,湖北 武汉 430074)
摘要:目的 对榼藤不同用药部位药理活性及化学成分进行比较分析。方法 采用角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型比较抗
炎作用;采用小肠炭末推进法比较其对胃肠动力的影响;结合 HPLC,UV,1HNMR 法对两者主要化学成分进行分析。结
果 :种仁和藤茎均可显著抑制角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀;种仁可显著改善模型小鼠的胃肠动力障碍,而藤茎无此作
用;两个用药部位化学成分差异较大。结论 榼藤藤茎及种仁均有抗炎作用。种仁还具有促进胃肠动力的作用。两者化
学成分差异较大,药效物质基础不尽相同。
关键词:榼藤; 抗炎活性; 胃肠动力; 化学成分
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2016. 06. 017
中图分类号:R29 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)06-1327-03
The comparative research on the pharmacological activities and chemical compositions of
different parts of Entada phaseoloides (Linn.)Merr.
ZHANG Sheng-nan,QIN Si,WAN Qing,XIONG Hui ,MEI Zhi-nan*
(College of Pharmacy,South Central University for Nationlities,Wuhan Hubei 430074,China)
Abstract:Objective To study the differences of the pharmacological activities and chemical compositions between the kernels
and stems of Entada phaseoloides (Linn.)Merr. Methods The anti - inflammatory and gastrointestinal motility activities were e-
valuated by the rat paw edema model induced by carrageenan and gastrointestinal motility disorder model caused by atropine,re-
spectively;the chemical compositions of the two parts were analyzed by HPLC,UV and 1HNMR. Results The two parts had
parallel effects on improving the carrageenan glue toes swelling. Otherwise,the kernels could also improve gastric emptying rate
and small intestinal propulsion in mice,while the stems had no such effects;the two parts were quite different in the chemical
compositions. Conclusion Both of them show anti - inflammatory effects,only the kernels have gastrointestinal motility function,
the pharmacological active substances may be different.
Key words:Entada phaseoloides (Linn.)Merr. ; Anti - inflammatory effect; Gastrointestinal motility; Chemical con-
stituents
豆科植物榼藤 Entada phaseoloides (Linn.)Merr.在傣族和壮
族有着广泛的应用历史。傣医主要是以种仁入药,具有补气补
血、健胃消食、除风止痛、强筋硬骨之功效[1],而壮医则主要以藤
茎入药,又名过岗龙,主要用于治疗弊病、跌打损伤等[2]。为了
阐明榼藤不同部位在不同民族地区临床应用的差异,为指导临床
合理用药提供理论依据。本研究对榼藤不同部位药理活性及化
学成分进行了比较分析。现报道如下。
1 材料与仪器
1. 1 动物 SPF 级昆明小鼠,雌雄各半,体重(20 ± 2 )g 。SD
大鼠,雄性,体重(170 ± 10 )g,合格证号:SCXK(鄂)2008 -
0005。均购于湖北省实验动物研究中心。
1. 2 仪器与试剂 DIONEX Ultimate 高效液相色谱仪(DAD 检测
器,Chromeleon 色谱工作站);KQ - 500E 超声波清洗器(昆山市
超声仪器有限公司);Bruke Drx - 500 MHz 核磁共振仪(氘代试
剂:氘代甲醇);乙腈为色谱纯(美国 Tedia公司),水为超纯水,其
他试剂均为分析纯。
1. 3 药材与对照品 榼藤子由西双版纳州民族药物研究所提供,
藤茎由广西壮族自治区壮医院提供,经中南民族大学药学院刘新
桥副教授鉴定为豆科榼藤属植物榼藤 Entada phaseoloides (L.)
Merr.的种仁及藤茎,标本存放于中南民族大学民族药物研究院。
对照品 En - 1:2 - β - D - glucopyr - anosylory - 5 - hydroxy -
phenylaceticacid methyl ester,En - 2:榼藤酰胺 - A - β - D -吡喃
葡萄糖苷(entada - A - β - D - glucopyranoside ),En - 3:phase-
oloideside D,En - 4:phaseoloideside E,En - 5:3β - O - β - D -
xylopyranosyl -(1→3)- α - L - arabino - pyranosyl -(1→6)-[β
- D - glucopyranosyl -(1→4) ]- 2 -(acetamido)- 2 - deoxy - β
- D - glucopyranosylentagenic acid 28 - O -[2 - O -(2E,6R)-
2,6 - dimethyl - 6 - hydroxy - 2,7 - octadienoyl]- β - D - glucopy-
ranosyl -(1→4)〗-[β - D - xylopyra - nosyl -(1→2) ]-(6 - O
- acetyl)- β - D - Gluco pyranosyl ester,En - 6:3β - O - β - D
- xylo pyranosyl -(1→3)- α - L - arabinopyranosyl -(1→6)-
[β - D - glucopyranosyl -(1→4) ]- 2 -(acetamido)- 2 - deoxy
- β - D - glucopy - ranosylentagenic acid 28 - O - β - D - apio-
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2016 VOL. 27 NO. 6 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 6 期
furanosyl -(1→3)- β - D - xylopyrano syl -(1→2)-[(3 - O -
(2E,6R)- 2,6 - dimethyl - 6 - hydroxy - 2,7 - octadienoyl)- β -
D - glucopyranosyl -(1→4) ]-(6 - O - acetyl)- β - D - glucopy-
ranosyl ester 均为实验室自制,经 MS、1H - NMR 和13 C - NMR 确
定结构,HPLC峰面积归一化法测定纯度大于 98%。
1. 4 药品 阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司,批号:
BJ10446);角叉菜胶(阿拉丁化学有限公司,批号 14750)。
2 方法
2. 1 榼藤子种仁及藤茎水提液的制备 榼藤种仁及藤茎粗粉各
800 g,用 10 倍量水加热提取 2 次,第 1 次 2 h,第 2 次 1 h,过滤,
合并滤液,浓缩至 200 mL,冰箱冷藏备用。
2. 2 大鼠足趾肿胀实验 将雄性 SD 大鼠 48 只分为 8 组,每组 6
只。分别为模型组、阳性药物地塞米松组(10 mg /kg)、藤茎及种
仁水提液各 3 个剂量组(含生药量 12,6,3 g /kg)。各组灌胃给
药,每天 1 次,连续 7 天。末次给药前先测得各组大鼠右后足的
初始体积,给药后 40 min,各组足下皮下注射 1% 的角叉菜胶
0. 1 ml致炎,分别在其后 0. 5,1,2,4 h 和 6 h 用毛细管放大测量
装置测量足肿胀情况。肿胀度 = 注射后足体积 - 注射前体
积[3]。
2. 3 小鼠胃排空及小肠推进实验 将雄性昆明小鼠 54 只分为 9
组,每组 6 只。分别为正常对照组,模型组,阳性药吗丁啉组(12
mg /kg),藤茎及种仁水提液各 3 组(含生药量 12 ,6 ,3 g /kg)。
各组灌胃给药,每天 1 次,连续 5 天。末次给药前各组小鼠禁食
不禁水 12 h,末次给药 45 min 后除正常对照组外各组小鼠腹腔
注射硫酸阿托品 2 mg /kg,然后立即灌胃炭末混悬液(2% CMC -
Na和 5%炭末),30 min 后处死小鼠,计算胃内容物残留率及小
肠推进率[4]。
2. 4 主要化学成分分析
2. 4. 1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品 En - 1、En -
2、En - 3、En - 4、En - 5、En - 6 各 8 mg,置于 10 ml 容量瓶中,甲
醇超声溶解并稀释至刻度,摇匀,作为储备液。精密量取上述储
备液 2. 0 ml,置于 10 ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇
匀,即得对照品溶液。
2. 4. 2 供试品溶液制备 参考本课题前期方法[5],取种仁及藤
茎粗粉,过 40 目筛,精密称定 1. 0 g加 60%甲醇 25 mL 超声提取
40 min,放冷,称定重量,分别补足减失重量,摇匀,离心,取上清
液,用微孔滤膜滤过,取续滤液,备用。
2. 4. 3 色谱条件 色谱柱 Fortis Xi C18柱(250 mm × 4. 6 mm,5
μm);流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0→20 min,A:2%
→5%;20→25 min,A:5%→ 10% ;25→40 min,A:10% →20%;
40→55 min,A:20%→ 30%;55→80 min,A:30%→ 35%);波长
212 nm;流速 1. 0 ml /min;进样量 10 μl。
2. 4. 4 测定方法 分别吸取榼藤种仁、藤茎及其供试品溶液各
10 μl,注入液相色谱仪,按“2. 4. 3 ”项下色谱条件进行测定。
2. 5 数据处理 采用 SPSS软件进行统计学分析,实验数据采用
珋x ± s表示,组间差异采用单因素方差分析,* P < 0. 05 具有显著
性差异,**P < 0. 01 具有极显著性差异。
3 结果
3. 1 对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响 如表 1 所示,与模型
组相比,榼藤子种仁水提液和藤茎水提液均能抑制角叉菜胶致炎
后 4 h和 6 h的足趾肿胀度,其中,种仁高剂量组在 4 h时具有显
著性差异(P < 0. 05)。致炎后 6 h,种仁和藤茎高剂量组和中剂
量组与模型组相比均具有显著性差异(P < 0. 05 ,P < 0. 01)。
3. 2 对小鼠胃肠动力的影响结果 如表 2 所示,与正常组相比,
注射阿托品后小鼠胃残留率显著性增高(P < 0. 01),小肠推进
率显著性降低(P < 0. 01)表明模型成功。与模型组相比,种仁
高、中剂量组均能显著性逆转阿托品所致的胃肠动力障碍(P <
0. 01,P < 0. 05),并且呈剂量依赖性。藤茎高、中剂量组对模型
小鼠胃排空具有显著性抑制作用(P < 0. 05),藤茎各剂量组对
模型小鼠小肠推进没有显著性差异。
表 1 各药物组对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响(珋x ± s) ml
组别 致炎前体积
致炎后体积
0. 5 h 1 h 2 h 4 h 6 h
模型组 0. 79 ± 0. 05 0. 27 ± 0. 12 0. 25 ± 0. 06 0. 42 ± 0. 13 0. 46 ± 0. 08 0. 44 ± 0. 10
地塞米松组 0. 84 ± 0. 04 0. 21 ± 0. 05 0. 16 ± 0. 12 0. 35 ± 0. 17 0. 28 ± 0. 11 0. 27 ± 0. 12**
种仁 H组 0. 87 ± 0. 04 0. 19 ± 0. 08 0. 28 ± 0. 06 0. 41 ± 0. 06 0. 31 ± 0. 09* 0. 31 ± 0. 08**
种仁 M组 0. 80 ± 0. 05 0. 19 ± 0. 09 0. 24 ± 0. 08 0. 44 ± 0. 06 0. 39 ± 0. 07 0. 34 ± 0. 11*
种仁 L组 0. 78 ± 0. 04 0. 19 ± 0. 05 0. 29 ± 0. 10 0. 45 ± 0. 09 0. 40 ± 0. 09 0. 40 ± 0. 08
藤茎 H组 0. 88 ± 0. 06 0. 20 ± 0. 09 0. 27 ± 0. 12 0. 38 ± 0. 13 0. 32 ± 0. 06 0. 29 ± 0. 09**
藤茎 M组 0. 86 ± 0. 06 0. 20 ± 0. 05 0. 19 ± 0. 09 0. 44 ± 0. 16 0. 38 ± 0. 06 0. 33 ± 0. 09*
藤茎 L组 0. 77 ± 0. 05 0. 23 ± 0. 10 0. 25 ± 0. 06 0. 46 ± 0. 09 0. 45 ± 0. 11 0. 34 ± 0. 11
与模型组比较,* P < 0. 05,**P < 0. 01;n = 6
3. 3 主要成分差异性分析 以对照品做对照,根据对照品的保留
时间,分析 HPLC的结果并结合相关文献[6 ~ 8]对榼藤种仁及藤茎
中主要色谱峰进行归属。结果显示两个用药部位特征性化学成
分存在较大差异:榼藤种仁中主要含有酚苷类化合物(图 1 中 1
号峰)、酰胺类化合物(图 1 中 2 号峰)、皂苷类(图 1 中 3、4 号
峰)。藤茎中主要为皂苷类成分 (图 2 中 1、2、3 号峰)。虽然种
仁和藤茎中均含有皂苷类成分,但其结构存在较大差异,藤茎中
分离得到的皂苷因苷元 C - 28 糖链上引入 mon - oterpenic acid
(MT)结构单元,其 UV 光谱会出现特征吸收(196、218 nm)(图
3) ,同样在 1H - NMR 上亦会出现 MT 基团的特征信号 (δ:
6. 85、5. 90 和 5. 20 附近)(图 4) ,而种仁中的皂苷则无此吸收。
表 2 各药物组对胃肠动力的影响(珋x ± s)
组别
剂量
/ g·kg -1
胃残留率 小肠推进率
正常组 - 33. 27 ± 8. 67 59. 27 ± 7. 03
模型组 - 58. 46 ± 9. 28## 26. 19 ± 7. 43##
吗丁啉组 0. 12 40. 89 ± 6. 11** 48. 09 ± 5. 45**
种仁 H组 12. 00 44. 80 ± 7. 89** 47. 00 ± 8. 92**
种仁 M组 6. 00 45. 35 ± 6. 66* 43. 28 ± 5. 49**
种仁 L组 3. 00 47. 14 ± 5. 83 39. 65 ± 4. 85
藤茎 H组 12. 00 87. 42 ± 10. 73* 31. 09 ± 8. 15
藤茎 M组 6. 00 61. 55 ± 7. 51* 26. 81 ± 4. 99
藤茎 L组 3. 00 49. 18 ± 17. 59 26. 57 ± 4. 06
与正常对照组比较,##P < 0. 01,与模型组比较,* P < 0. 05,**P < 0. 01
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2016 VOL. 27 NO. 6
图 1 种仁 HPLC图谱
图 2 藤茎 HPLC 图谱
图 3 榼藤子种仁(A)、藤茎(B)中皂苷苷元 UV 图谱
图 4 榼藤子种仁(A)、藤茎(B)中皂苷苷元1H - NMR 图谱
4 讨论
榼藤作为我国传统的民族药,其用药历史悠久。但是在不同
的地区其用药有差异,为了比较了榼藤子和藤茎在傣族及壮族的
临床应用差异,我们对其药理活性进行了比较研究,结果显示榼
藤子具有促进胃肠动力的作用,而藤茎几乎没有此作用,但两者
均具有很好的抗炎活性,这为傣医和壮医科学用药提供了有力的
证据。为进一步阐明二者化学成分的差异,我们又对其特征性化
学成分进行了分析研究,结果显示,两者化学成分差别较大。榼
藤酰胺只存在于种仁中,三萜皂苷在两个部位中的结构亦不同。
综上所述,榼藤两个用药部位在药理活性及化学成分方面存在一
定的差异,种仁具有促进胃肠动力的作用,而藤茎不具有此活性;
种仁和藤茎均具有抗炎活性,但两者药理活性物质基础是否是三
萜皂苷尚有待进一步研究。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2016 VOL. 27 NO. 6 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 6 期