全 文 ：收稿日期:2004-02-19
基金项目:甘肃省中青年自然科学基金项目(YS-011-A25-003);甘肃省中医管理局基金项目(2003-G2K-17)
作者简介:马兴铭(1969-),硕士 ,副教授 , Email:mingxm@163.com , Tel:0931-3438431;＊通讯作者。
西藏砂生槐生物碱抑菌及杀虫活性的测定
马兴铭1 , 李红玉1＊ , 王 波2 , 尹少甫1
(1.兰州大学生命科学学院 , 兰州 730000;2.甘肃省康复中心)
摘要:用MTT比色法 、抑菌圈法对西藏高原植物砂生槐生物碱进行了室内离体抑菌活性测定 。
结果表明 ,其对水稻白叶枯病菌KS-6-6 、JXO Ⅲ、PXO99 ,以及水稻条斑病菌 RS105 、丁香假单胞
菌PPB2038 、马铃薯软腐病菌 E 的最低抑菌浓度分别达 10.53 、7.20 、15.79 、15.79 、5.30 、
30.77mg/ml;对核果假尾孢 、茄匍柄霉 、褐孢霉的 EC50值分别为 12.90 、15.79 、12.55mg/ml。采
用小叶碟添加法测定了对菜青虫的毒杀作用 ,其 LD50值为 326.59mg/L。
关 键 词:砂生槐;生物碱;抑菌作用;菜青虫
中图分类号:S482.292 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2005)03-0183-04
The Determination of Bacteriostasis and Insecticidal Activity of Alkaloids from
Sophora moorcroftiana Seeds
MA Xing-ming , LI Hong-yu , WANG Bo , YIN Shao-fu
(Life Sciences College of Lanzhou University , Lanzhou 730000 , China)
Abstract:The bacteriostasis activity of alkaloids from seeds of Sophora moorcroftiana growing in Tibet
altiplano , were tested with MTT assay and bacteriostasis circle method in vitro.Results showed that mini-
mum inhibitory concentration(MIC)of alkaloids on Xanthomonas oryzae pv.oryzae KS-6-6 , JXO Ⅲ ,
PXO99 , and X .oryzae pv.oryzicola RS105 , Pseudomonas syringae pv.syringae PPB2038 and
Erwinia carotovora pv.carotovora E were 10.53 , 7.20 , 15.79 , 15.79 , 5.30 and 30.77mg/ml , re-
spectively , and the EC50 value on Pseudocercospora circumscissa , Stemphylium solani and Fulvia fulva
were 12.90 , 15.79 and 12.55mg/ml , respectively.Insecticidal activity of alkaloids to Pieris rapae was
observed by antifeeding and LD50was 326.59mg/L.
Key words:Sophora moorcroftiana;alkaloid;bacteriostasis;Pieris rapae
砂生槐 [ Sophora moorcroftiana(Well.)Berth.ex Baker]又名“西藏狼牙刺” 、“刺柴”[ 1] ,分布
于西藏波密 、林芝 ,米林 ,拉萨 ,山南及日喀则诸县 ,为西藏高原一特有植物种 。砂生槐主要以
种子入药 ,具有清热利湿 ,驱风杀虫作用 。为充分开发其药物利用价值 ,作者首次从砂生槐种
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21(3)183-186 中国生物防治 Chinese Journal of Biological Control 2005 年 8月
DOI :10.16409/j.cnki.2095-039x.2005.03.012
子中提取了亲脂性总生物碱[ 2] ,初步测试了其抑菌与杀虫活性。现将测试结果报道如下 。
1 材料与方法
1.1 药物与菌株
砂生槐种子生物碱(纯度大于 90%)用二甲亚砜(DMSO)配成 800mg/ml原液 。DMSO 终浓
度小于 0.1%,灭菌-4℃冰箱保存 , 0.1%DMSO溶液为对照组。供试植物病原细菌水稻白叶
枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)中国系统KS-6-6 、日本系统 JXOⅢ 、菲律宾系统PXO99 、
水稻条斑病菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)RS105 、丁香假单胞菌丁香致病型
(Pseudomonas syringae pv.syringae)PPB2038 、马铃薯软腐病菌 (Erwinia carotovora pv.
carotovora)E ,由南京农业大学植保系提供 ,菌液浓度为104 ～ 105cfu/ml;植物病原真菌核果假
尾孢(Pseudocercospora circumscissa)、茄匍柄霉(Stemphylium solani)、褐孢霉(Fulvia fulva)、茄
链格孢(Alternaria solani)分离自植物病株 ,经甘肃农业大学植保系鉴定。
1.2 抑制细菌试验方法
1.2.1 NCCLS 方法测定最小抑制浓度 参考文献[ 3 ～ 5]设阴性对照组(不加药物 ,加 0.1%DM-
SO 5μl)、药物组(分别加入 5μl不同浓度的生物碱),每组 3复孔 。置 37℃的培养箱中培养 16
～ 18h ,根据NCCLS的标准判断最小抑制浓度(MIC)。
1.2.2 MTT 比色法测定最小抑制浓度 参考文献[ 3～ 5] 方法 ,设阴性对照组(不加药物 ,加
0.1%DMSO 5μl)、药物组(分别加入 5μl不同浓度的生物碱)和调零孔(加 0.1%DMSO 5μl和药
物5μl ,不加细菌悬液),每组 3复孔。酶联免疫检测仪于 570nm 波长处测定各孔的OD值 ,重
复3次 。计算MTT 形成 formazan的转化百分率。
1.3 抑制真菌试验方法
采用抑菌圈法 ,按常规方法制备生物碱浓度为 26.67 、13.34 、6.67 、3.33 、1.67mg/ml的 PDA
药物琼脂平板 ,以不加生物碱的 PDA 琼脂平板为对照 。在每块平板中央粘贴一片菌饼(直径
6.5mm), 28℃的培养箱中培养 5d ,测量菌饼生长的直径 ,计算供试样品对真菌的相对抑制率
和 EC50值 。
1.4 对菜青虫的活性试验方法
1.4.1 试虫 田间采回菜青虫(Pieris rapae)幼虫 ,用甘蓝叶室内饲养 ,挑选发育正常的 5龄
幼虫供试 。
1.4.2 拒食作用 采用小叶碟添加法[ 6]测定总生物碱对菜青虫的生物活性 。设 50 、100 、200 、
400 、800mg/L 五个浓度药物组和 0.1%DMSO溶液对照组 。每组 10头试虫 ,每处理重复 3次 ,
计算 48h的死亡率 。
1.4.3 熏蒸作用 按文献[ 6] 的方法进行 ,设 4000 、2000 、1000 、500 、250mg/L 药物组和 0.1%
DMSO溶液对照组。每瓶(500ml)中接入 10头幼虫 ,每处理重复 3次 。检查 48h 死亡数 ,计算
死亡率。
1.4.4 触杀作用 按文献[ 6]的方法进行 ,设 4000 、2000 、1000 、500 、250mg/L 五个浓度的药物处
理组和0.1%DMSO溶液对照组。幼虫平均体重为 216.04mg ,用微量加样器吸取 1.25μl的药液
均匀涂抹于幼虫前胸背板 。每个浓度处理10头幼虫 ,每处理重复 3次。48h观察死亡数 ,计算
死亡率。
184
中 国 生 物 防 治 第 21 卷
1.5 统计分析
用SPSS软件(8.0)的 One-Way ANOVA(LDS)和 Regression-Linear进行统计处理。
2 结果
2.1 砂生槐种子生物碱抑菌结果
砂生槐种子生物碱能抑制植物致病性细菌的生长繁殖(表 1),MIC 为 5.30 ～ 40.57mg/ml。
由于细菌菌株的不同 ,生物碱对其生长的抑制能力亦不同 ,对丁香假单胞菌生长抑制能力最强
(MIC=5.3mg/ml),对马铃薯软腐病菌 E生长抑制能力最弱(30.77mg/ml),对水稻白叶枯病菌
KS-6-6 、JXOⅢ 、PXO99也有一定的抑制作用 。对病原真菌的生长繁殖亦显示出抑制作用(表
2),对核果假尾孢 、茄匍柄霉 、褐孢霉的生长有明显的抑制作用(P <0.001),药物浓度越大 ,其
抑制作用越强;但对茄链格孢的生长抑制作用不明显(P >0.05)。
表 1 砂生槐种子生物碱抑制细菌生长的最低药物浓度(MIC , mg/ml)
试验方法 KS-6-6 JXOⅢ PXO99 RS105 PPB2038 马铃薯软腐病菌 E
CCLS方法
MTT比色法
15.79
10.53
7.20
7.20
15.79
15.79
15.79
15.79
10.52
5.30
40.57
30.77
表 2 不同浓度砂生槐生物碱对 4种病原真菌的抑制作用
生物碱浓度 核果假尾孢 茄匍柄霉 褐孢霉 茄链格孢
(mg/ml) 菌落直径(mm)
抑制率
(%)
菌落直径
(mm)
抑制率
(%)
菌落直径
(mm)
抑制率
(%)
菌落直径
(mm)
抑制率
(%)
26.67 12.87±0.52■ 66.89 24.75±2.75＊ 68.40 12.25±1.37◎ 82.44 13.75±1.11 34.09
13.34 17.50±0.87■ 45.68 46.25±2.25＊ 31.17 31.00±1.00◎ 25.19 19.50±2.90 0
6.67 19.50±1.04■ 34.94 45.75±2.17＊ 32.03 29.25±0.48◎ 30.53 21.25±1.43 0
3.33 21.88±0.72■ 24.05 61.00±4.12 5.62 37.25±1.11 6.11 17.00±2.85 4.54
1.67 22.75±1.11 19.75 64.25±2.08 0.00 39.00±1.49 0.76 16.75±1.25 2.81
对照 26.75±3.12 64.25±1.55 39.25±2.86 17.50±1.89
回归方程 y = 0.451+1.306 x y =0.490+1.410 x y = 0.077+2.091 x
EC50(mg/ml) 12.90 15.79 12.55
注:表中为 LDS检验:＊P < 0.001;◎P < 0.01 , ■ P < 0.05。
2.2 对杀菜青虫生物活性结果
2.2.1 拒食作用 从表 3可见砂生槐总生物碱对菜青虫有很强的拒食作用。药物浓度越大 ,
拒食率和死亡率越高 。砂生槐生物碱药物浓度对数为自变量(y), 分别以拒食率和死亡率为
因变量(x)作直线回归 ,计算拒食中浓度 LD50为 481.39mg/L。
2.2.2 熏蒸和触杀作用 试虫放置于三角瓶内后 ,很快寻找到食物 ,不受悬挂的含药滤纸的
影响 , 48h观察无死亡现象 。说明砂生槐总生物碱对菜青虫无熏蒸毒杀作用。砂生槐生物碱
药液均匀涂摸于幼虫胸部背板 ,饲喂 48h后 ,结果发现药物 4000mg/L处理的幼虫最高死亡率
仅为 10.0%,表明大剂量的砂生槐总生物碱才对菜青虫有一定的触杀作用 ,小剂量的砂生槐
总生物碱对菜青虫无明显触杀作用 。
表 3 生物碱对菜青虫的拒食率和死亡率(48h)
项 目 800mg/L 400mg/ L 200mg/ L 100mg/ L 50mg/ L 回归方程 LD50(mg/L)
平均拒食率(%)
校正死亡率(%)
56.96
64.56
43.75
54.88
29.17
45.22
37.50
25.88
25.00
6.63
y = 1.028+0.033x
y = 1.444+0.021x
481.39
326.59
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第 3期 马兴铭等:西藏砂生槐生物碱抑菌及杀虫活性的测定
3 分析与讨论
3.1 砂生槐种子生物碱的杀虫作用研究
砂生槐种子生物碱 0.75 ～ 6.00mg/ml体外具有杀死细粒棘球绦虫原头蚴的活性 ,对小鼠
的半数致死量为 207.81±20.82mg/kg ,对小鼠具有中等强度的毒性[ 7] 。本试验研究表明砂生
槐种子生物碱对菜青虫有较强的拒食作用 ,无熏蒸和触杀作用。拒食率和死亡率较接近 ,表明
砂生槐种子生物碱胃毒杀虫活性可能是主要的作用方式之一。苦参碱类生物碱杀虫的机理主
要是作用于 Ca2+通道[ 8] 、抑制乙酰胆碱受体和胆碱酯酶[ 9]而产生对昆虫的毒性作用 ,砂生槐
种子至少含有 4种生物碱:1.64%氧化苦参缄 、0.5%氧化槐果缄 、0.172%苦参缄 、0.005%槐
果缄[ 1] 。砂生槐种子生物碱杀虫是否与该植物中存在苦参碱类生物碱有关 ,哪些是主效成分 ,
各成分之间在发挥作用有无协同 、拮抗以及杀虫的机理等都有待将总生物碱分离纯化 ,进一步
研究其有效成分及作用机制。
3.2 砂生槐种子生物碱的抑菌研究
文献报道[ 2 ,3]砂生槐生物碱具有抑制金黄色葡萄球菌 、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌生长
繁殖的功效 , 尤其对金黄色葡萄球菌的抑制作用更显著。本试验显示了砂生槐种子生物碱能
抑制植物致病细菌和真菌的生长繁殖。由于菌株的不同 ,生物碱对其生长的抑制能力亦不同 ,
这种抗菌活性的差异性可能与病菌的细胞结构 、致病性 、生理特性等有关 。周叶方等[ 10]报道
病菌繁殖产生的胞外产物与致病性相关 ,除去或灭活胞外产物 ,能降低病菌的致病能力 ,砂生
槐种子生物碱能抑制致病菌的生长繁殖 ,是通过作用于胞外产物使其失活而达到抑菌 ,还是通
过影响病菌代谢中的其他环节达到抑菌 ,抑菌效应与砂生槐生物碱中的哪些成分有关 ,哪些是
主效成分 ,有待将总生物碱分离纯化 ,进一步研究其有效成分及作用机制。
参 考 文 献
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