全 文 ：2011 年 12 月
第 40 卷 第 4 期
山 西 林 业 科 技
SHANXI FORESTRY SCIENCE AND TECHNOLOGY
Dec. 2011
Vol. 40 No. 4
黄心夜合的遗传多样性研究
朱秀志，张 华，侯志平
(赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000)
摘 要:运用随机扩增多态 DNA(RAPD)技术，对黄心夜合［Michelia martinii (Levl．)Levl．］自然分布区的 6 个自然
种群遗传多样性进行了研究。从 100 个随机引物中筛选出能产生清晰、稳定的多态性标记引物 18 个，共检测出
110个位点，其中多态性位点为 96 个，占 87. 27%;在物种水平上，有效等位基因数目(Ne)，Nei’s 基因多样性系数
(He)和 Shannon表型多样性指数(I)分别为 1. 735 2，0. 416 3和 0. 597 1;总的遗传变异量(Ht)为 0. 339 8，其中居群内
遗传变异量(Hs)为 0. 258 7，各居群间的遗传分化系数(Gst)达到 0. 323 1. 应用 UPGMA法对遗传距离进行聚类分析
并构建树系图，结果表明:黄心夜合自然种群具有较高的遗传多样性，其种群间的遗传差异与其地理分布有关。
关键词:黄心夜合;遗传多样性;RAPD;DNA
中图分类号:S792. 99 文献标识码:A 文章编号:1007-726X(2011)04-0013-04
Study on Genetic Diversity of Michelia martini
Zhu Xiuzhi，Zhang Hua，Hou Zhiping
(Basic Medical College，Gannan Medical University，341000 Ganzhou，China)
Abstract:The genetic variations of six natural populations of Michelia martini from different distribution regions were inves-
tigated at the DNA level by employing RAPD． Out of 100 random primers，eighteen random primers were screened，which
could generate highly reproducible and clear RAPD fragments for further population analysis ． With these primers，a total of
110 discernible DNA fragments were obtained and of which 96 (87. 27%)were polymorphic，At species level，the effec-
tive number of allele (Ne)was 1. 735 2． Neis gene diversity (He)was 0. 416 3 and Shannon index (I)was 0. 597 1． To-
tal genetic diversity (Ht)was 0. 339 8，and the genetic diversity within populations (Hs)was 0. 258 7． The coefficient of
gene differentiation (Gst)among populations was 0. 323 1． UPGMA map were made according to the genetic similarity and
distance of the six populations calculated in this article． The result showed that M． martini had a high genetic diversity．
The genetic diversity of M． martini among the six natural populations is primarily related to their geographic distribution．
Key words:Michelia martini;genetic diversity;RAPD;DNA
收稿日期:2011-09-21
作者简介:朱秀志(1973— ) ，男，安徽玉河人，2006 年毕业于西华师范大学，讲师。
遗传多样性是反映种质材料遗传多样性的有效
指标。随机扩增多态 DNA(RAPD)作为一种简便、
快速、易行的分子标记，是探索生物居群的遗传结构
和研究生物遗传多样性及系统进化的重要手段。黄
心夜合［Michelia martinii(Levl．)Levl．］，别名夜合
花，木兰科含笑属乔木树种。因其材质优良，多被采
伐，故现存数量稀少。目前，有关黄心夜合在 DNA
水平上的遗传多样性研究尚未见报道。笔者对黄心
夜合不同种群和种群内遗传多样性做 RAPD 分析，
了解其种群层次上的遗传多样性水平，为进一步合
理保护、利用与开发其遗传资源提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
材料采自四川省沐川县凉风坳森林公园、洪雅
县高庙乡、平武县宽坝林场、峨眉山观心坡、雷波县
凉山和重庆市金佛山黄草坪，共 6 个自然种群。每
个种群采集 4 株 ～ 16 株个体，植株间隔至少 20 m．
采集到的新鲜叶片用活性变色硅胶快速干燥，带回
实验室放于 － 80 ℃冰箱保存备用。
1. 2 研究方法
1. 2. 1 植物基因组 DNA提取
采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)
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法，将提取液中加入适量聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)
和 β-巯基乙醇，对植物基因组 DNA 进行提取。提
取过程中动作要迅速，尽量减少样品与空气的接触
时间。提取后用冷的纯酒精沉淀，发现沉淀物立即
用细玻璃棒挑出。晾干后，测定 DNA 浓度和纯度，
并通过琼脂糖电泳检查 DNA 的完整性，于 － 20 ℃
保存备用。
1. 2. 2 引物筛选结果
随机引物采用上海生工公司引物(OD = 2) ，共
100 个引物(S1 ～ S20;S41 ～ S60;S81 ～ S100;S161 ～
S170;S261 ～ S270;S351 ～ S360;S501 ～ S510) ，经预
备试验选择重复性强且能产生多态性、清晰明亮谱
带的 18 个引物，对所有个体 DNA 进行扩增。各引
物序列及检测带数见表 1.
表 1 18 个 RAPD引物对黄心夜合各居群 DNA
模板的扩增结果 个
引物 序列号 5 ～ 3 位点总数 多态位点数
S7 GGTGACGCAG 6 5
S12 CCTTGACGCA 7 6
S17 AGGGAACGAG 4 4
S45 TGAGCGGACA 2 0
S86 GTGCCTAACC 9 8
S91 TGCCCGTCGT 6 6
S162 GGAGGAGAGG 5 5
S163 CAGAAGCCCA 6 6
S164 CCGCCTAGTC 6 4
S166 AAGGCGGCAG 8 8
S167 CAGCGACAAG 6 6
S169 TGGAGAGCAG 8 5
S262 ACCCCGCCAA 8 5
S263 GTCCGGAGTG 6 6
S264 CAGAAGCGGA 7 6
S265 GGCGGATAAG 9 8
S360 AAGCGGCCTC 4 2
S507 ACTGGCCTGA 6 6
1. 2. 3 RAPD扩增反应
根据 Taguchi法优化的结果对几个主要因子的
优化比较，确定了 PCR的扩增反应在 25 uL 反应体
积中的优化反应体系成分为:1. 5 mmol /L Mg2 +，
0. 8 mmol /L dNTP，240 nmol /L 随机引物，80 ng
DNA，1. 0 U Taq DNA聚合酶(上海生工公司) ，1 倍
的 buffer溶液。扩增的热循环参数设定如下:94 ℃
变性 3 min 20 s，1 个循环;94 ℃变性 1 min，36 ℃退
火 1 min，72 ℃延长 2 min，45 个循环;72 ℃延长
10 min，1 个循环。设定仪器自动转入 4 ℃以保存
扩增产物等待检测。
1. 2. 4 PCR产物检测
取 10 uL扩增产物在含有 0. 5 ug /mL EB(溴化
乙锭)的 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为
1 × TBE，稳压 90 V，电泳 0. 5 h．电泳结果在紫外分
析仪中观察、记录、拍照。
1. 2. 5 数据处理
每一随机引物重复 1 次，根据各标记的迁移率
及其有无进行 1 /0 记录，能重复出现且稳定、清晰的
RAPD条带记为 1，不出现的条带记为 0，强带、弱带
的赋值均为 1. 记录过程遵循以下原则:只记录易于
辨认的条带，模糊不清的条带予以排除;电泳道中无
法准确标识的条带不记录;迁移率相同但强度不同
的条带，当强带的强度超过弱带的 1. 5 倍时，不视为
相同的条带，而是把它们分别计算。最后得到的数
据输入 POPGENE32 软件进行分析。遗传距离(D)
另按 Neis等的方法计算:
D = － LnS ，
S = 2 Nxy /(Nx + Ny) ．
其中: S———任意两样本之间的遗传相似系数;
Nx，Ny———样本 x和样本 y 扩增出的 DNA 片
段总数;
Nxy———样本 x和样本 y共有的DNA片段数。
根据遗传距离对各居群进行 UPGMA 聚类分
析，构建居群间亲缘关系分支树系图。
2 结果与分析
2. 1 RAPD产物的多态性
不同引物扩增出来的带数不同，18 个引物共扩
增出 110 条带，长度在 300 bp ～ 2 100 bp 之间，每个
引物产生 2 条 ～ 9 条。扩增条带的多少与含量不成
正相关关系，平均每个引物约产生 6. 11 条带。其中
96 条扩增带具有多态性，占 PCR 扩增带总数的
87. 27%，与黄山花楸、天目木兰、三棱栎等相比，比
值较高，但与中国芸芥、乐昌含笑、海南粗榧及珙桐
等物种的多样性条带百分比值接近。据此推测，黄
心夜合物种水平上的遗传多样性背景较为复杂，遗
传变异水平较高。
2. 2 遗传多样性和居群分化程度
基于 18 条 RAPD引物所扩增出的多态条带，利
用 POPGENE32 软件在假设遗传平衡时计算有效等
位基因数(Ne) ，Nei’s 基因多样性(He)和 Shannon
表型指数(I)等指标见第 15 页表 2.
第 4 期 朱秀志，等:黄心夜合的遗传多样性研究 15
表 2 黄心夜合遗传多样性与居群遗传结构
种群 Ne He I Ht Hs Gst
1 平武居群 1. 503 4 0. 306 8 0. 462 8 － － －
2 金佛山居群 1. 568 3 0. 321 6 0. 516 2 － － －
3 沐川居群 1. 659 0 0. 383 4 0. 566 6 － － －
4 洪雅居群 1. 270 5 0. 207 5 0. 325 1 － － －
5 峨眉山居群 1. 576 5 0. 350 4 0. 523 4 － － －
6 雷波居群 1. 536 4 0. 298 7 0. 486 3 － － －
总体分析 1. 735 2 0. 416 3 0. 597 1 0. 339 8 0. 258 7 0. 323 1
由表 2 可知，在物种水平上，有效等位基因数
目(Ne) ，Nei’s基因多样性系数(He)和 Shannon 表
型多样性指数(I)分别为 1. 735 2，0. 416 3和 0. 597 1，
比乐昌含笑高。总的遗传变异量(Ht)为 0. 339 8，
其中居群内遗传变异量(Hs)为 0. 258 7，各居群间
的遗传分化系数(Gst)达到 0. 323 1，即在总的遗传
变异中有 32. 31%的变异存在于居群间，各居群已
出现较强的遗传分化。
2. 3 居群遗传距离
群体间 RAPD 片段共享性(即遗传相似度)能
够在一定程度上反映群体间 DNA 的差异。根据每
个引物在 6 个黄心夜合样本 DNA的扩增结果，算出
6 个样本 RAPD片段的平均遗传相似度。根据遗传
相似度计算出遗传距离，见表 3.
表 3 任意 2 个居群间的遗传距离
1 2 3 4 5
1
2 0. 499 5
3 0. 455 5 0. 577 3
4 0. 631 3 0. 658 5 0. 568 5
5 0. 541 6 0. 520 8 0. 477 8 0. 693 1
6 0. 397 5 0. 549 7 0. 287 6 0. 468 3 0. 518 5
根据遗传距离应用 POPGENE32 软件对各居群
进行 UPGMA聚类分析，构建居群间亲缘关系分支
树系图，见图 1.
由图 1 看出，洪雅居群与其它居群的遗传距离
最大，可能与生境被破坏有关。除洪雅居群，可以把
供试的其它 5 个黄心夜合材料聚为两大类群:东部
的重庆金佛山居群和西部的四川居群，后者包括平
武居群、沐川居群、峨眉山居群以及雷波居群。
3 讨论
笔者首次利用 RAPD技术对黄心夜合种群进行
了遗传多样性分析，结果表明，黄心夜合具有较高的
1—平武居群;2—金佛山居群;3—沐川居群;
4—洪雅居群;5—峨眉山居群;6—雷波居群
图 1 黄心夜合居群间的遗传距离聚类分析
遗传多样性。洪雅高庙乡黄心夜合居群的 RAPD产
物条带数少，多态性条带百分比值小，遗传多样性指
数也小，与其它居群遗传距离较远，可能与生境被破
坏有关。聚类结果显示，东部重庆金佛山居群和西
部四川居群被归为两类，这一结果也真实地反映了
两地黄心夜合植株在外观形态上的差异，两类居群
之间表现出较大的遗传差异与它们的地理距离相
关，即较远的金佛山居群与其它地方的居群遗传距
离较大。
遗传多样性是反映种质材料遗传多样性的有效
指标。黄心夜合目前尚未濒危，其遗传多样性指数
较高，遗传差异较大，在品种改良中有较大的遗传潜
力。有效保护并维持黄心夜合的遗传多样性，有助
于其适应环境变化。而且保护黄心夜合的基因资
源，也是遗传改良工作的基础。
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(下转第 18 页)
18 山 西 林 业 科 技 2011 年
近，不易被发现，有利于避敌，静伏约 3 h ～ 6 h 后开
始取食。1 龄 ～ 7 龄幼虫均有群集取食的习性，1 龄
幼虫常把针叶咬成不规则小缺刻，1 龄 ～ 3 龄幼虫常
数条集中在 1 根针叶上，自针叶中部向基部啃食，残
留的叶脉及针叶上部逐渐枯萎弯曲。4 龄后的幼虫
可单独食尽整根针叶，并有啃食嫩枝皮层的习性，使
油松小枝形成不规则缺刻。据室内饲养观察，每头
雌成虫所产子代(幼虫)累计可取食 10 578 根油松
针叶，相当于把长 6. 8 m松枝上的针叶全部吃光，每
条幼虫取食约 50 根 ～ 60 根针叶。幼虫有群聚抱团
和受到惊扰时头尾翘起吐黄色混浊液体的习性，以
保护自身安全，减少天敌伤害。每群幼虫取食范围
相对集中于几条枝条上，每脱皮 1 次，即就近转移
1 次。幼虫老熟后在树上或坠落树下蜕皮，在适宜
场所结茧越冬。
4)蛹期。5 月间，雌蛹历时 12 d ～ 25 d，雄蛹历
时 10 d ～ 15 d． 6 月间，雌蛹历时 12 d ～ 16 d，雄蛹历
时 10 d ～ 14 d．
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