全 文 ：传感器与微系统(Transducer and Microsystem Technologies) 2013 年 第 32 卷 第 5 期
电化学发光免疫传感器检测相思子毒素研究*
刘 冰，童朝阳，郝兰群，穆晞惠，刘 威，黄启斌
(防化研究院 国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京 102205)
摘 要:以磁性微球固定相思子毒素多抗制备捕获探针，以三联吡啶钌标记相思子毒素单抗作为发光探
针，两者与相思子毒素发生特异性免疫反应形成夹心复合物，成功建立了相思子毒素的电化学发光免疫传
感检测方法。利用此方法检测相思子毒素，浓度在 0． 1～ 1 000 μg /L 范围内与电化学发光强度呈良好的对
数线性关系，拟合方程为 lg Y = 0． 763 lg X + 0． 562(R = 0． 990 3，N = 7，P ＜ 0． 000 1) ，检出限为 0． 1 μg /L。
关键词:电化学发光;免疫传感器;检测;相思子毒素
中图分类号:TP212． 3 文献标识码:A 文章编号:1000—9787(2013)05—0028—03
Research on abrin detection by electrochemiluminescence
immunosensor*
LIU Bing，TONG Zhao-yang，HAO Lan-qun，MU Xi-hui，LIU Wei，HUANG Qi-bin
(State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian，Research Institute of Chemical Defence，
Beijing 102205，China)
Abstract:Polyclonal antibody(PcAb)of abrin is immobilized on magnetic microbeads as capture probe． An
efficient approach for abrin detection by electrochemiluminescence(ECL)immunosensor is developed based on
specific immunological reaction between immobilized PcAb，abrin and Ru(bpy)2 +3 -labeled monoclonal antibody
(McAb) ，which forms sandwich immunocomplex． Then the target abrin is determined by ECL． A good logarithmic
linear relationship between ECL intensity and the concentration of abrin at a range of 0． 1～ 1000μg /L is obtained，
fitting equation is lg Y = 0． 763 lg X + 0． 562(R = 0． 990 3，N = 7，P ＜ 0． 000 1)and the detection limit is 0． 1 μg /
L．
Key words:electrochemiluminescence(ECL) ;immunosensor;detection;abrin
0 引 言
电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)是一种电
化学反应引起化学发光的现象，具有操作简便、灵敏度高、
背景信号低、易于控制等特点。免疫磁性微球分离技术通
过免疫反应与磁性微球的分离作用能从复杂的生物样品中
特异性捕获并分离被检抗原或抗体。近年来，磁免疫分离
和电化学发光分析方法不断发展，二者结合的磁免疫电化
学发光分析方法已被用于检测一些抗原、抗体和半抗
原［1～ 4］，尤其是临床医学检验上。
相思子毒素(abrin)来源于豆科植物相思子种子，是
一种Ⅱ型核糖体失活蛋白，其结构、作用机理与蓖麻毒素
(ricin)类似，毒性超过 ricin，属剧毒生物毒素，可以作为潜
在的生物战剂被恐怖分子使用，近几年已引起广泛关注，建
立快速、灵敏的检测方法极为必要。已经建立的酶联免疫
吸附测定(ELISA)［5～ 8］、平板上的 ECL［7］、分子生物学(定
收稿日期:2013—02—26
* 基金项目:总装预先研究资助项目(404070205)
量 PCR、免疫 PCR)［9］等方法灵敏度高，但耗时较长;胶体
金免疫层析［10～ 12］、压电免疫传感器［13］等速度较快 但灵敏
度稍低。
本研究将磁免疫分离技术、生物素—亲和素系统
(BAS)的放大作用、多抗的强富集能力以及三联吡啶钌
［Ru(bpy)2 +3 ］标记单抗的高度特异性结合起来，建立了一
种操作简便、响应快速、灵敏度高的磁免疫电化学发光传感
检测方法，为临床诊断、环境监测、食品卫生检验及生物反
恐等应用领域提供技术基础和参考依据。
1 实 验
1． 1 试剂与仪器
三联吡啶钌 N—羟基琥珀酰亚胺酯(Ru(bpy)2 +3 -NHS
ester，Sigma公司) ，活化生物素(biotin-NHS ester，Sigma 公
司) ;链亲和素包被磁微球(New England BioLabs公司，直径
2 ． 0μm) ，abrin，abrin多抗，abrin单抗，ricin，葡萄球菌肠毒
82
DOI:10.13873/j.1000-97872013.05.034
第 5 期 刘 冰，等:电化学发光免疫传感器检测相思子毒素研究
素 B(SEB，本实验室) ;ProCell 发光检测液与 CleanCell 清
洗液(北京百隆腾科技发展有限公司) ;牛血清白蛋白
(BSA，上海国药集团有限公司) ;磷酸盐缓冲溶液(PBS)用
0． 1 mol /L Na2HPO4，0． 1 mol /L KH2PO4 和 0． 1 mol /L KCl;
实验用水均为去离子水，其它所用化学品和试剂均为分析
纯。
磁免疫电化学发光传感检测平台(本实验室与西安瑞
迈分析仪器有限责任公司联合研制) ;MPI—E型电化学发光
检测仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司) ;BIOMATE 3S
紫外可见分光光度计(赛默飞世尔科技) ;HS—3 垂直混合
器(宁波新芝生物科技股份有限责任公司) ;磁分离架(Pro-
mega公司)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 发光探针制备
按照文献［14，15］方法稍有改动，将 1 mg abrin 单抗溶
于 582 μL 碳酸盐缓冲液(0． 05 mol /L，pH = 9． 6) ，加入
380 μL Ru(bpy)2 +3 -ester(8． 76 × 10
－4 mol /L) ，再加入 38 μL
二甲基亚砜(DMSO) ，37 ℃避光振荡孵育 12 h。超滤除去
未结合的 Ru (bpy)2 +3 -ester，用磷酸盐缓冲液 (PBS，
0． 01 mol /L，pH = 7． 4)重悬至 1 mL，备用。
1． 2． 2 捕获探针制备
1)abrin多抗生物素化
用 1 mL DMSO 溶解活化生物素 1 mg，向 1 mL abrin 多
抗溶液(1 g /L)中加入 120 μL 活化生物素溶液(即含活化
生物素 120 μg) ;在室温下持续搅拌，保温 2 ～ 4 h;加入
9． 6 μL 1 mol /L NH4Cl(每 25 μg活化生物素加 1 μL) ，在室
温下搅拌 10 min;4 ℃充分透析，以除去游离的生物素，以
PBS重悬至 1 mL。
2)磁微球捕获探针构建
将生物素化的 abrin多抗 20 μL加入 1 mL(1 g /L)亲和
素包被的磁微球中，室温振荡孵育 1 h，置于磁分离架上用
PBST(含 1． 5 % Tween—20 的 PBS)清洗 2 次，PBS 清洗 2 次
除去未结合的 abrin多抗，余下结合了 abrin多抗的磁微球，
加 PBS重悬至 1 mL，4 ℃保存备用。
1． 2． 3 ECL检测
将 abrin多抗包被的磁微球 50μL和 50μL样品混合后
室温振荡孵育 15 min，用 PBS 磁分离清洗 2 次，再加入
Ru(bpy)2 +3 -ester标记的 abrin单抗 50 μL(20 mg /L)共同振
荡孵育 15 min，PBS磁分离清洗以除去未结合的标记探针，
用发光检测液重悬后加入检测池，磁微球在磁铁作用下沉
积在工作电极表面，在 1． 4 V 恒电位下，标记在 abrin 单抗
上的 Ru(bpy)2 +3 就和发光检测液中的三丙胺(TPA)反应，
产生光子，光信号由光电倍增管检测。实验原理如图 1 所
示。
亲和素包被磁微球
生物素化多抗
相思予毒素
Ru(bpy)2+3标记单抗
图 1 相思子毒素电化学发光检测原理
Fig 1 Principle of ECL detection on abrin
1． 2． 4 传感器电极表面再生
ECL检测反应完成后，将磁铁位置移至电极远端，先用
去离子水冲洗检测池，流动注入 CleanCell 清洗液，反复运
行电化学阶跃脉冲，再用去离子水反复冲洗，直至注入 Pro-
Cell发光检测液后，ECL响应值恢复至基线水平。
2 结果与讨论
2． 1 发光探针性质
2． 1． 1 发光探针紫外—可见光谱
如图 2 所示，abrin 单抗标记后紫外—可见光谱发生改
变，a为 abrin单抗光谱图，在 280 nm处有一个特征吸收峰，
是蛋白特征峰;b 为标记物 Ru(bpy)2 +3 -NHS ester 的图谱，
联吡啶钌在 220～ 600 nm 之间有 3 个特征吸收峰，其中，可
见光 457 nm处的吸收对应于金属 Ru(II)到 bpy配体 dπ→
π* 电荷跃迁，紫外区 287 nm 处的吸收是以配体为中心的
π→π* 跃迁，紫外区的另一个吸收峰在 245 nm 处，也是金
属 Ru(II)到 bpy 配体的 dπ→π* 电荷跃迁［10］;c 标记
abrin单抗的光谱图，位于 286 nm 和 457 nm 处均为联吡啶
钌的特征吸收，这表明 Ru(bpy)2 +3 -NHS ester 已经标记到
abrin单抗上。
0
1
2
3
4
5
吸
光
度
200 300 400 500
波长 /nm
a
c
b
图 2 标记探针的紫外—可见(UV-Vis)光谱
Fig 2 UV-Vis spectrum of labeled probe
2． 1． 2 发光探针电化学发光性质
在发光检测液中，利用循环伏安法对标记探针进行扫
描，结果如图 3 所示。可见 Ru(bpy)2 +3 标记到 abrin 单抗
上后，仍然有较强的电化学发光信号，峰电位保持不变，仍
在 1． 4 V附近，保持了 Ru(bpy)2 +3 的电化学发光特性，标记
abrin单抗可以用作电化学发光探针。
2． 2 传感器的响应特性
2． 2． 1 线性与检出限
图 4 为 ECL 强度(3 次重复平均值，扣除基线值)随
abrin浓度变化的关系曲线，可见随着 abrin 浓度升高，ECL
值逐渐上升;在 abrin 浓度达 1 000 μg /L 时不再上升，基本
92
传 感 器 与 微 系 统 第 32 卷
26
126
226
326
426
526
电
化
学
发
光
强
度
/A
U
1
电压 /V
图 3 标记探针的电化学发光性质
Fig 3 ECL characteristics of labeled probe
达到饱和。在 0． 1～ 1 000 μg /L范围内电化学发光强度(Y)
的对数与 abrin 浓度(X)的对数呈线性关系，拟合方程为
lg Y = 0． 763 lg X + 0． 562(R = 0． 990 3，N = 7，P ＜ 0． 000 1)。
因此，传感器对抗原检测的线性范围是 0． 1～ 1 000 μg /L，当
abrin浓度低于 0． 1 μg /L时，电化学发光强度基本处于基线
水平(6～ 7) ，因此，检测下限为 0． 1 μg /L。这较之前建立的
压电免疫传感器法检测 abrin［13］在灵敏度上提高 500 倍，与
Garber E A等人［7］建立的固相平板上的 ECL水平(不同样
本中 0． 1～ 0． 5μg /L不等)相当。由于本方法采用的磁性微
球悬浮反应体系，使异相反应成类似均相反应，大大加快了
反应速度，加上磁性微球的分离富集作用以及便于清洗，与
平板上 ECL相比，明显缩短了检测时间。
0.01 0.1 1 10 100 1000
abrin浓度 /μg·L-1
1
10
100
1000
电
化
学
发
光
强
度
/A
U
lgY=0.7631X+0.562
图 4 ECL强度与 abrin浓度的关系
Fig 4 Relationship between ECL intensity and
concentration of abrin
2． 2． 2 特异性
传感器对空白样品缓冲液(PBS) ，100 μg /L 的牛血清
白蛋白(BSA)、100 μg /L 的葡萄球菌肠毒素 B(SEB)与
100 μg /L的蓖麻毒素(ricin)的 ECL 响应值都在基线水平
(6～ 7) ，对非目标蛋白均不响应，说明该传感器对 abrin 检
测有很强的特异性。磁微球固定化多抗作为捕获探针与标
记单抗作为发光探针对 abrin的夹心式双重特异性识别，以
及磁微球的分离富集作用，保证了传感检测的高度特异性。
2． 2． 3 检测重现性
在线性范围内，对浓度为 100 μg /L 的 abrin 重复 5 次
平行测定，ECL值为 89 ± 8，相对偏差为 9%，传感器不仅灵
敏度高而且重现性较好。
3 结 论
本文以磁性微球固定相思子毒素多抗制备捕获探针，
以三联吡啶钌标记相思子毒素单抗作为发光探针，建立了
相思子毒素的磁免疫电化学发光传感检测方法。实验结果
表明:利用此方法检测相思子毒素，响应快速、特异性强、灵
敏度高(检出限为 0． 1 μg /L)、线性范围宽(0． 1～ 1 000 μg /
L)。可以此为基础，发展生物毒素和其它蛋白的现场检测
方法，用于临床诊断、环境监测、食品卫生检验及生物防护
等应用领域。
参考文献:
［1］ Pyati R，Richter M M． ECL—electrochemical luminescence［J］．
Annu Rep Prog Chem，Sect C，2007，103:12 － 78．
［2］ Yan G H，Xing D，Tan S C，et al． Rapid and sensitive immu-
nomagnetic-electrochemiluminescent detection of p53 antibodies
in human serum［J］． J Immunol Methonds，2004，288:47 － 54．
［3］ Li M Y，Sun Y M，Chen L，et al． Ultrasensitive eletrogenerated
chemiluminescence immunoassay by magnetic nanobead amplifi-
cation［J］． Electroanalysis，2010，22:333 － 337．
［4］ Zhan W，Bard A J． Electrogenerated chemiluminescence． 83． Im-
munoassay of human C-reactive protein by using Ru(bpy)2 +3 -
encapsulated liposomes as labels［J］． Anal Chem，2007，79:
459 － 463．
［5］ 穆晞惠，童朝阳，郝兰群，等． 双抗体夹心 ELISA 法检测相思
子毒素［J］． 细胞与分子免疫学杂志，2007，23(8) :763 －
764．
［6］ 穆晞惠，郝兰群，童朝阳，等． 双抗体夹心生物素 － 亲和素
ELISA法检测相思子毒素［J］． 免疫学杂志，2007，23(5) :
571 － 574．
［7］ Garber E A，Walker J L，OBrien T W． Detection of abrin in food
using enzyme-linked immunosorbent assay and electrochemilumi-
nescence technologies［J］． Journal of Food Protection，2008，
71(9) :1868 － 1874．
［8］ Zhou Y，Tian X L，Li Y S，et al． Development of a monoclonal an-
tibody-based sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA)for detection of abrin in food samples［J］． Food Che-
mistry，2012，135(4) :2661 － 2665．
［9］ Melchior W B，Tolleson W H． A functional quantitative polyme-
rase chain reaction assay for ricin，Shiga toxin，and related ribo-
some-inactivating proteins［J］． Analytical Biochemistry，2010，
396(2) :204 － 211．
［10］ Gao S，Nie C，Wang J H，et al． colloidal gold-based immuno-
chromatographic test strip for rapid detection of abrin in food
samples［J］． Journal of Food Protection，2012，75(1) :112 －
117．
［11］ Yang W，Li XB，Liu GW，et al． A colloidal gold probe-based sil-
ver enhancement immunochromatographic assay for the rapid de-
tection of abrin-a ［J］． Biosensors ＆ Bioelectronics，2011，
26(8) :3710 － 3713．
［12］ Weber M，Schulz H． Immunological detection of ricin and castor
seeds in beverages，food and consumer products［J］． Toxichem
Krimtech，2011，78(Special Issue) :276 － 277．
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传 感 器 与 微 系 统 第 32 卷
网
络
权
值
训练次数
180160140120100806040200
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
图 4 分数阶算法权值最优解曲线
Fig 4 Optimal solution curve of fractional order
algorithm weight
瓦
斯
涌
出
量
/m
3 ·
m
in
-1
181614121086420
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
瓦斯涌出量实际值
瓦斯涌出量预测值
样本个数
图 5 绝对瓦斯涌出量预测值与实测值的对比
Fig 5 Contrast of predicted and measured values of
absolute gas emission
表 2 三种预测模型预测效果
Tab 2 Prediction effect of three kinds of prediction model
实际值
BP网络预测
预测值
相对误差
(%)
小波网络预测
预测值
相对误差
(%)
分数阶网络预测
预测值
相对误差
(%)
4． 06 4． 61 13． 55 4． 21 3． 69 3． 95 2． 71
4． 92 5． 18 5． 28 5． 20 5． 69 4． 97 1． 07
8． 04 7． 89 1． 87 7． 98 0． 75 8． 11 0． 87
相对平均误差 6． 90 3． 38 1． 55
均方误差 0． 18 0． 10 0． 08
4 结束语
将擅长局部搜索的 BP 神经网络和擅长全局搜索的分
数阶理论有机结合，构成一种新的神经网络，有效地克服了
传统 BP算法收敛速度慢、易陷于局部极小值等缺点，提高
了煤与瓦斯涌出量预测的科学性和准确性。结果表明:分
数阶神经网络比 BP神经网络、小波神经网络等其他预测模
型具有更灵活有效的函数逼近能力、更强的自适应能力、更
快的收敛速度和更高的预测精度。该算法能较好地应用于
煤矿瓦斯涌出量预测，并且为拟合瓦斯涌出量等非线性系
统提供了新的思路和方法，可以推广到其他领域。
参考文献:
［1］ 王晓路，刘 健，卢建军． 煤与瓦斯突出预测器输入主因素识
别方法［J］．系统工程理论与实践，2010，30(8) :1500 － 1505．
［2］ 邵良杉，张 宇．基于小波理论的支持向量机瓦斯涌出量的预
测［J］．煤炭学报，2011，36(S1) :104 － 107．
［3］ 谷 松，崔洪庆，冯文丽． 基于灰色理论的小波神经网络对瓦
斯涌出量的预测［J］．煤炭学报，2007，32(9) :964 － 966．
［4］ 郝吉生，袁崇孚．模糊神经网络技术在煤与瓦斯突出预测中的
应用［J］．煤炭学报，1999，24(6) :624 － 627．
［5］ 刘汉丽，周成虎，朱阿兴，等．多子群遗传神经网络模型用于路
口短时交通流量预测［J］．测绘学报，2009，38(8) :363 － 368．
［6］ Tao Ran，Meng Xiangyi，Wang Yue． Image encryption with mul-
tiorders of fractional Fourier transforms［J］． IEEE Trans on Infor-
mation Forensics and Security，2010，4(5) :734 － 738．
［7］ Li H S，Luo Y，Chen Y Q． A fractional order proportional and de-
rivative (FOPD)motion controller:Tuning rule and experiment-
s［J］． IEEE Transactions on Control Systems Technology，2010，
18(2) :516 － 520．
［8］ 陶 然，邓 兵，王 越．分数阶傅里叶变换及其应用［M］．北
京:清华大学出版社，2009．
［9］ 谢德光，张贤达． 基于分数阶 Fourier 变换的雷达目标识
别［J］．清华大学学报:自然科学版，2010，50(4) :485 － 488．
［10］ Pei S C，Ding J J． Closed-form discrete fractional and affine Fourier
transforms［J］． IEEE Trans on Signal Process，2000，48(5) :
1338 － 1353．
［11］ 李 昕，邢丽坤．基于最优阶次分数阶神经网络的短时交通流
预测［J］．计算机工程与应用，2012，48(18) :226 － 230．
［12］ 付 华，姜 伟，单欣欣． 基于耦合算法的煤矿瓦斯涌出量预
测模型研究［J］．煤炭学报，2012，37(4) :654 － 658．
［13］ Benmalek M，Charef A． Digital fractional order operators for R-
wave detection in electrocardiogram signal［J］． IET Signal Pro-
cessing，2009，3(5) :381 － 391．
［14］ MATLAB 中文论坛编著． MATLAB 神经网络 30 个案例分
析［M］．北京:北京航空航天大学出版社，2010．
作者简介:
付 华(1962 －) ，女，辽宁阜新人，教授，博导，研究方向为计算
机测控技术及应用、现代传感技术与系统
檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸
。
(上接第 30 页)
［13］ 穆晞惠，周志强，童朝阳，等．基于生物素—亲和素系统的压电
免疫传感器检测相思子毒素研究［J］． 分析化学，2009，
37(10) :1492 － 1502．
［14］ Miao W，Bard A J． Electrogenerated chemiluminescence． 72． de-
termination of immobilized DNA and C-reactive protein on Au
(111)electrodes using tris(2，2—bipyridyl)ruthenium(II)
labels［J］． Anal Chem，2003，75(21) :5825 － 5834．
［15］ Terpetschnig E，Szmacinski H，Malak H，et al． Metal-ligand com-
plexes as a new class of long-lived fluorophores for protein hydro-
dynamics［J］． Biophys J，1995，68(1) :342 － 350．
作者简介:
刘 冰(1977 －) ，男，山东潍坊人，助理研究员，博士研究生，
研究方向为生物传感器与生物检测。
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